Les recherches présentées dans cette publication ont été soutenues par les subventions des NIH R01EY018341 et R01EY019250 (C.S.S.), F31EY035156 des subventions NIH (A.H.) et P30 EY011373. L’organisme de financement n’a joué aucun rôle dans la conception ou la réalisation de cette recherche.

L’utilisation de sujets animaux dans cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Case Western Reserve.
1. Préparation des réactifs
<ol><li>Préparez le milieu tampon de lavage en complétant la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol avec 10 mM de solution tampon HEPES. Maintenir la solution à 4 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Préparez le milieu EPR en complétant le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco avec 4,5 g/L de glucose, 1,25 fois le supplément GlutaMAX (concentration de base 100x ou 200 mM ; concentration finale de 2,5 mM de L-glutamine), avec 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine et 1x solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x). Avant utilisation, préchauffez le média à 37 °C au bain-marie.</li>
</ol>2. Extraction de l’œil de la souris
<ol><li>Euthanasier la souris, de préférence âgée de 3 à 14 semaines, à l’aide d’une méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC (la luxation cervicale sous anesthésie à l’aide d’un cocktail de kétamine et de xylazine à raison de 0,1 mL par 20 g de souris [87,5 mg/kg de kétamine et 12,5 mg/kg de xylazine] a été utilisée dans cette étude). REMARQUE : Les yeux prélevés sur des souris plus jeunes faciliteront l’augmentation du rendement des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes au fil du temps et étendront la capacité de passages successifs.</li>
	<li>Posez la souris à plat sur le côté, l’œil orienté vers le haut.</li>
	<li>Placez l’index et le pouce au-dessus et en dessous de l’œil, respectivement. Appliquez doucement une pression sur la structure osseuse entourant l’œil pour induire la saillie du globe oculaire.</li>
	<li>Insérez la pointe des ciseaux légèrement ouverts sous l’œil et tournez doucement le poignet en l’éloignant de l’œil de 90° jusqu’à ce que l’œil se détache de l’orbite. REMARQUE : Ne fermez pas les ciseaux pour couper l’œil ou le nerf optique, car cela rendrait la dissection de l’œilleton plus difficile.</li>
	<li>Placez immédiatement l’œil et roulez-le dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 secondes au maximum avant de le transférer dans un milieu tampon de lavage maintenu sur de la glace.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope à dissection, transférez un œil à la fois dans une boîte de Pétri remplie de tampon de lavage et de bandes de gaze trempée.</li>
	<li>Stabilisez l’œil en tenant le nerf optique à l’aide d’une pince à épiler. Faites doucement une incision au niveau de l’ora serrata à l’aide d’un couteau chirurgical de 3,00 mm à 45° ou d’une lame de rasoir de 0,009".</li>
	<li>À l’aide de ciseaux Vannas, insérez doucement les ciseaux dans l’incision et coupez autour de la circonférence de l’ora serrata jusqu’à ce que le segment antérieur et le vitré puissent être retirés et jetés.</li>
	<li>Décollez doucement la rétine de l’œilleton à l’aide d’une pince attachée, en prenant soin de ne pas perturber la couche d’EPR. REMARQUE : Pour faciliter l’élimination de la rétine, remplissez une pipette de transfert avec un produit tampon de lavage et appliquez-la soigneusement sur les bords de l’œilleton pour soulever doucement la rétine.</li>
	<li>Enfin, retirez le nerf optique et l’excès de tissu conjonctif de l’œilleton à l’aide de ciseaux. Attention à ne pas percer l’œilleton.</li>
</ol>3. Isolement de l’EPR primaire
<ol><li>Transférez l’œilleton dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1 mL de trypsine à 0,25 % + 0,02 % d’EDTA. REMARQUE : Deux œilletons peuvent être ajoutés à une aliquote de trypsine-EDTA pour augmenter le rendement en EPR cultivable.</li>
	<li>Transférez les tubes de microcentrifugation dans un bain-marie réglé à 37 °C et incubez pendant 10 min. Toutes les 2 minutes, retirez les tubes du bain-marie et tapotez fermement le bas du tube 40 fois sur le plan de travail.</li>
	<li>Après 10 min, perturbez doucement l’œilleton mécaniquement à l’aide d’une pipette sérologique P1000 ou de 2 mL en pipetant de haut en bas pas plus de 3 fois. REMARQUE : La fragmentation des feuilles RPE est essentielle car les grandes feuilles n’adhéreront pas correctement.</li>
	<li>Neutralisez immédiatement la trypsine en superposant les feuillets d’EPR détachés, mais pas l’œilleton, sur 0,5 mL de sérum fœtal bovin (FBS) dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>De plus, diluez la trypsine en superposant 3 mL de média EPR goutte à goutte sur les couches de feuilles de FBS et d’EPR.</li>
	<li>Centrifuger l’EPR à 340 x g pendant 3 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans une quantité appropriée de milieu EPR pour une plaque de 24 puits (1,9 cm2/puits) ou une plaque de 48 puits (0,75 cm2/puits). REMARQUE : L’EPR peut être plaqué sur des plaques bien recouvertes de protéines de matrice extracellulaire, en particulier de laminine, de collagène IV ou de fibronectine, pour augmenter l’adhérence11. L’EPR peut également être remis en suspension dans 1 mL de milieu EPR et superposé sur un gradient de séparation de densité de 40 % pour isoler davantage les cellules EPR pures. De plus, faire tourner la plaque à 340 x g pendant 3 à 5 minutes peut augmenter l’adhésion cellulaire13.</li>
	<li>Incuber à 37 °C à 5% de CO2.</li>
</ol>4. Culture de l’EPR
<ol><li>Ne perturbez pas l’EPR isolé pendant au moins 3 jours. Après 72 h, retirez délicatement l’ancien média et remplacez-le par un média frais et préchauffé.</li>
	<li>Changez de milieu toutes les 48 h après les 3 premiers jours.</li>
	<li>Une fois que les cellules atteignent la confluence, faites passer les cellules en utilisant 0,25 % de trypsine + 0,02 % d’EDTA et réduisez le FBS dans le milieu RPE à 2 %. REMARQUE : Les EPR primaires ont déjà commencé à se dédifférencier après 5 à 7 passages et commenceront à perdre leur forme hexagonale et leur pigmentation14.</li>
</ol>

Caractérisation et dynamique morphologique de l’EPR primaire murin en culture

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).</li><li>Lambros, M. L., Plafker, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+the+Nrf2+anti-oxidant+transcription+factor+in+age-related+macular+degeneration.">Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration.</a> Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).</li><li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+genes+and+disease+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li><li>Xia, T., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+diabetic+retinopathy+on+the+barrier+functions+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium.</a> Vision Res. 139, 72-81 (2017).</li><li>Edwards, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+rat+retinal+pigment+epithelium.">Culture of rat retinal pigment epithelium.</a> In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).</li><li>Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+rat+retinal+pigment+epithelial+cells.">An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).</li><li>Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+pigment+epithelial+cells+from+rat+retina.">An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina.</a> Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).</li><li>Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats.">A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).</li><li>Sakagami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+rat+eyeballs.">A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs.</a> Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).</li><li>Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+and+culture+of+adult+rat+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+cells+to+study+retinal+diseases.">A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 449 (2015).</li><li>Shen, J., He, J., Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigment+epithelial+(RPE)+cells+with+Rho-Kinase+and+TGFbetaR-1/ALK5+inhibitor.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor.</a> Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).</li><li>Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts.">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101758 (2022).</li><li>Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+Junctions+of+the+outer+blood+retina+barrier.">Tight Junctions of the outer blood retina barrier.</a> Int J Mol Sci. 21 (1), 211 (2019).</li><li>Ban, B., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions.">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Mol Vis. 3, 18 (1997).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Front Pharmacol. 12, 727870 (2021).</li></ol>

Il n’y a pas de divulgation financière ou non financière pertinente.

Dans cet article, nous avons décrit un protocole simplifié pour l’isolement et la culture de l’épithélium pigmentaire rétinien murin. Les cellules EPR isolées dans les yeux de souris adultes ont exprimé un marqueur spécifique de l’EPR, RPE65, et un marqueur de jonction intercellulaire, ZO-1. De plus, les cellules cultivées se sont développées en feuilles hexagonales pigmentées en culture.
Plusieurs méthodes d’isolement de l’EPR chez les rongeurs ont été publiées préc...

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche cellulaire spécialisée qui tapisse la membrane de Bruch située entre les photorécepteurs et la choroïde1. Les cellules EPR jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement de la rétine. Les cellules EPR transportent le glucose et la vitamine A vers les photorécepteurs, favorisent la vision par réisomérisation de la rétine tout-trans en rétinienne 11-cis et maintiennent les segments externes du photorécepteur par phagocytose des segments externes excrétés, éliminent l’eau de l’espace sous-rétinien, forment la barrière hémato-rétinienne externe par la présence de jonctions serrées et sécrètent des facteurs de croissance neurotropes (tels que le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire, et facteur de croissance des fibroblastes de base) qui soutiennent les photorécepteurs2. Le dysfonctionnement des cellules EPR est impliqué dans la pathogenèse de diverses rétinopathies, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique 3,4,5. Les études in vitro utilisant des cellules RPE sont essentielles pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse de ces maladies. Les cellules primaires de l’EPR sont de loin préférées pour ces études, car les lignées cellulaires de l’EPR, bien qu’elles soient facilement disponibles, ne présentent pas les caractéristiques clés des cellules primaires de l’EPR.
Alors que diverses espèces ont été utilisées comme sources de cellules primaires de l’EPR, les souris ont l’avantage d’utiliser des modifications génétiques pour aider à comprendre la pathogenèse des rétinopathies. Les protocoles décrits précédemment pour isoler les cellules EPR des rongeurs nécessitent l’utilisation d’animaux nouveau-nés, sont longs, nécessitent des compétences techniques ou ne conviennent pas à la culture 6,7,8,9,10,11,12. Nous décrivons une méthode simple et rapide pour isoler les cellules EPR de souris adultes qui produisent des cultures très pures de ces cellules.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.009 RD Single-Edge Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>941202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>no Calcium, no magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Unitome Knife</td>
			<td>BVI Beaver</td>
			<td>377546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Microplates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td>24-well or 48-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult mice

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) sont essentielles au bon fonctionnement de la rétine. Le dysfonctionnement de l’EPR est impliqué dans la pathogenèse d’importantes maladies rétiniennes, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique. Nous présentons une approche simplifiée pour l’isolement de l’EPR à partir d’yeux adultes murins. Contrairement aux méthodes précédemment rapportées, cette approche permet d’isoler et de cultiver des EPR très purs à partir de souris adultes. Cette méthode simple et rapide ne nécessite pas de compétences techniques approfondies et est réalisable avec des outils scientifiques et des réactifs de base. Les EPR primaires sont isolées chez des souris de fond C57BL/6 âgées de 3 à 14 semaines par énucléation de l’œil suivie de l’ablation du segment antérieur. La trypsinisation enzymatique et la centrifugation sont utilisées pour dissocier et isoler l’EPR de l’œilleton. En conclusion, cette approche offre un protocole rapide et efficace pour l’utilisation de l’EPR dans l’étude de la fonction rétinienne et de la maladie.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized cell monolayer lining the Bruch&#39;s membrane located between photoreceptors and the choroid1. RPE cells play a critical role in the proper function of the retina. RPE cells transport glucose and vitamin A to photoreceptors, promote vision by re-isomerization of all-trans retinal into 11-cis retinal and maintain outer segments of photoreceptor through phagocytosis of shed outer segments, remove water from the subretinal space, form the outer blood-retinal barrier through the presence of tight junctions and secrete neurotropic growth factors (such as Pigment Epithelium Derived Factor, and Basic Fibroblast Growth Factor) that support photoreceptors2. Dysfunction of RPE cells is involved in the pathogenesis of various retinopathies, including age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy3,4,5. In vitro studies using RPE cells are critical to improving our understanding of the pathogenesis of these diseases. Primary RPE cells are much preferred for these studies since RPE cell lines, while readily available, lack key characteristics of primary RPE cells.
Whereas various species have been utilized as sources of primary RPE cells, mice have the advantage of using genetic modifications to help understand the pathogenesis of retinopathies. Previously described protocols to isolate RPE cells from rodents either require the use of neonatal animals, are lengthy, require technical skill, or are not suitable for culture6,7,8,9,10,11,12. We describe a simple and fast method to isolate RPE cells from adult mice that yield highly pure cultures of these cells.

Pleins feux sur l’auteur : Isolement efficace des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires de souris adultes pour la recherche sur la rétinopathie

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Retinal pigment epithelial cells or RPE are located between photoreceptors and the choroid. Dysfunction of RPE is important in the pathogenesis of diseases, such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, and retinitis pigmentosa. The use of primary RPE is key to studies to improve the understanding of how disease is developed.While various species have been used as a source of primary RPE, mice have the advantage of allowing to use genetic manipulation to help understand how retinopathies develop. Prior methods of isolation of primary RPE from rodents require either the use of neonatal animals, are lengthy, require technical expertise, or are not suitable for cell culture. We describe a simple and fast method to isolate primary RPE from adult mice that yields highly pure cultures of the cells.

Le protocole décrit a été utilisé sur des souris de fond C57BL/6. Le sexe ne semble pas changer la capacité à cultiver l’EPR. Les souris de moins de 6 semaines produisent des feuilles d’EPR limitées par rapport aux souris plus âgées, et plus d’yeux peuvent être nécessaires pour atteindre une confluence optimale. Après l’isolement, les cellules EPR mettent environ 3 jours à se stabiliser et à se fixer à la plaque de culture cellulaire. Environ 24 h après l’isolement, des cellules rondes et pigmen...

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

a-simplified-method-for-isolation-culture-retinal-pigment-epithelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

645 vues.  Case Western Reserve University. Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes ou EPR sont situées entre les photorécepteurs et la choroïde. Le dysfonctionnement de l’EPR est important dans la pathogenèse de maladies, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et la rétinite pigmentaire. L’utilisation de l’EPR primaire est essentielle aux études visant à améliorer la compréhension du développement de la maladie.Alo...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Isolement efficace des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes primaires de souris adultes pour la recherche sur la rétinopathie

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Recherche

Neurosciences

Extraction and Cultivation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice Eyes

To begin, prepare the wash buffer by supplementing Hank's Balanced Salt Solution with 10 millimolar heaps buffer. Store the buffer at four degrees Celsius until use. Prepare retinal pigment epithelium or RPE medium in DMEM and prewarm to 37 degrees Celsius in a water bath.Lay the euthanized mouse flat on its side with the eye facing upwards. Place the index finger above the eye and the thumb below it. Apply gentle pressure on the bone structure around the eye to cause the eyeball to protrude.Insert the tip of slightly open scissors under the eye and gently rotate the wrist away from the eye 90 degrees until the eye detaches from the socket. Immediately place and roll the eye in 70%ethanol for five seconds. Then transfer the eye to a wash buffer kept on ice.Under a dissecting microscope, place the eye in a Petri dish filled with wash buffer and strips of soaked gauze. Stabilize the eye by holding the optic nerve with tweezers and using a surgical knife gently make an incision at the level of the Ora Serrata. Insert Vannas Scissors into the incision and cut around the circumference of the Ora Serrata until the anterior segment and vitreous are removed.Gently peel away the retina from the eye cup using tethered forceps without disturbing the RPE layer. With the help of scissors, remove the optic nerve and excess connective tissue from the eye cup without puncturing the eye cup. Transfer the eye cup to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube containing one milliliter of 0.25%trypsin and 0.02%EDTA.incubate the eye cup in a 37 degrees Celsius water bath for 10 minutes. Every two minutes, remove the tube and firmly tap the bottom 40 times onto the countertop. After incubation, using AP-1000 pipette gently mix up and down three times to disrupt the eye cup.To neutralize the trypsin, immediately layer the detached RPE sheets, excluding the eye cup onto 0.5 milliliters of FBS in a 15 milliliter conical tube. Then dropwise, add RPE media onto the layers of FBS and RPE sheets to dilute the trypsin. Centrifuge the RPE at 340G for three minutes.Discard the supernatant and resuspend the cells in a suitable amount of RPE media for a 24 well plate. Incubate the RPE at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for three days. 24 hours after RPE isolation, a nucleate pigmented cells begin to settle without full adherence.Over the 48 to 72 hours, these cells attach and spread, retaining dark pigmentation in a transparent nucleus. After five days, RPE cells show increased co fluency in start forming cell to cell contacts shaping into a polarized monolayer with hexagonal structures. Isolated RPE showed purity as evidenced by the RPE specific marker and tight junction integrity after six days in culture.