Cette recherche a été financée en partie par le National Institute of Health dans le cadre des subventions R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 et de la subvention CBET 2150798 de la NSF. Les auteurs remercient l’atelier d’usinage RIT pour la fabrication de moules en aluminium. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Cette conception peut être utilisée dans différents modes en fonction des exigences expérimentales et des préférences de l’utilisateur final. Avant chaque expérience, consultez l’organigramme de décision présenté à la figure 2 pour déterminer les étapes et les modules nécessaires au protocole. Par exemple, si l’utilisateur a l’intention de conserver le format à puits ouvert tout au long d’une expérience pour le comparer directement avec le système de type Transwell, le gabarit de motif n’est pas nécessaire pour l’ensemencement cellulaire. Le module de base est disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux), et la nanomembrane ultramince peut être sélectionnée parmi une bibliothèque de matériaux avec différentes porosités et tailles de pores pour répondre aux besoins expérimentaux.
1. Fabrication du pochoir à motifs
REMARQUE : Le pochoir de motif sert à positionner les cellules exclusivement sur la région poreuse de la puce à membrane, empêchant les cellules de se déposer sur la couche de silicium environnante où elles pourraient potentiellement subir des dommages après l’ajout du module de flux16 (voir Figure 3). Les dommages à la monocouche peuvent nuire à l’intégrité de la barrière et compromettre les résultats expérimentaux. Le pochoir n’est pas nécessaire dans une culture ouverte et statique, car il n’y a aucun risque de dommages.
<ol><li>Achetez, usinez ou imprimez en 3D un moule à l’aide de la conception fournie dans le fichier de codage supplémentaire 1 (Figure 4A). REMARQUE : Les parois du pochoir sont effilées pour augmenter la capacité du support et minimiser le piégeage des bulles par rapport aux caractéristiques à paroi droite à rapport d’aspect élevé.</li>
	<li>Fixez un film adhésif sensible à la pression (PSA) de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,2 mm à l’aide d’un rouleau froid (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Découpez la feuille d’acrylique au laser selon le modèle fourni dans le fichier de codage supplémentaire 2 pour créer un ensemble de cavités (figure 4B).</li>
	<li>Décollez la couche protectrice du film PSA et fixez la feuille acrylique au moule. REMARQUE : Assurez-vous que la feuille découpée au laser est alignée avec le moule afin que les caractéristiques du moule soient centrées dans la cavité (Figure 4C). La précision du positionnement des cellules sur la membrane dépend de cette étape.</li>
	<li>Bien mélanger le prépolymère PDMS (en utilisant un rapport base/catalyseur de 10 :1) (voir tableau des matériaux) et le dégazer dans une chambre à vide jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles visibles (5-15 min).</li>
	<li>Versez lentement le PDMS dans les cavités du moule, en le nivelant avec un bord plat. REMARQUE : Pour éviter le piégeage des bulles, versez lentement le PDMS dans chaque cavité. Si des bulles sont présentes après le versement, placez le moule dans la chambre à vide et dégazez-le à nouveau.</li>
	<li>Faites durcir le PDMS sur une plaque chauffante à 70 °C pendant 1 h, puis laissez-le refroidir à température ambiante.</li>
	<li>Extraire les pochoirs des cavités du moule à l’aide d’une pince à épiler à bout plat.</li>
</ol>2. Fabrication du module d’écoulement
REMARQUE : Le module d’écoulement partage une empreinte similaire à celle du puits en forme de trèfle du module central et comprend un microcanal moulé (largeur = 1,5 mm, hauteur = 0,2 mm, longueur = 5 mm). La forme du trèfle aide à aligner le canal sur la région de culture poreuse (figure 5).
<ol><li>Utiliser des techniques standard de lithographie douce18 pour créer un moule en silicium avec des caractéristiques définies par la conception fournie dans le fichier de codage supplémentaire 3 (figure 4D).</li>
	<li>Fixez un film PSA de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,2 mm d’épaisseur.</li>
	<li>Découpez la feuille d’acrylique au laser en vous basant sur le dessin donné dans le fichier de codage supplémentaire 4 pour créer un ensemble de cavités en forme de trèfle (figure 4E). REMARQUE : La hauteur de la cavité détermine la hauteur du module d’écoulement, qui doit être légèrement plus haute (de 0 à 0,1 mm) que la hauteur du puits du module central pour assurer une bonne étanchéité.</li>
	<li>Retirez la couche protectrice du film PSA, puis fixez la feuille découpée au laser sur le moule en silicone en alignant les marques d’alignement triangulaires sur le moule en silicone avec celles de la feuille découpée au laser. REMARQUE : Comme à l’étape 1.4, assurez-vous que la feuille acrylique découpée au laser est alignée avec le moule en silicone afin que les caractéristiques du moule soient centrées dans chaque cavité (Figure 4F). Cette étape détermine la position du microcanal par rapport à l’empreinte.</li>
	<li>Versez lentement le PDMS dégazé sur les cavités du moule et nivelez-le avec un bord plat. REMARQUE : Si des bulles sont présentes après avoir versé, dégazez le moule jusqu’à ce que les bulles soient éliminées.</li>
	<li>Placez le moule sur une plaque chauffante et faites cuire le PDMS à 70 °C pendant 1 h, puis laissez refroidir le moule à température ambiante.</li>
	<li>Retirez délicatement les modules d’écoulement des cavités du moule à l’aide d’une pince à épiler à bout plat.</li>
	<li>Orientez le module d’écoulement avec les caractéristiques du microcanal vers le haut et positionnez les orifices d’entrée et de sortie du noyau à l’extrémité du canal à l’aide d’un poinçon de biopsie (voir le tableau des matériaux).</li>
</ol>3. Fabrication de boîtiers acryliques inférieurs et supérieurs
REMARQUE : Le module central s’insère dans le boîtier inférieur. L’attraction entre les aimants intégrés dans les boîtiers comprime et scelle le module d’écoulement au module central (Figure 6).
<ol><li>Découper au laser une feuille d’acrylique de 2 mm en utilisant le dessin fourni dans le fichier de codage supplémentaire 5 pour créer le boîtier supérieur avec des trous pour l’insertion de l’aimant.</li>
	<li>Fixez un film PSA de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,5 mm.</li>
	<li>Découper au laser la feuille acrylique selon le dessin donné dans le fichier de codage supplémentaire 6 pour créer le boîtier inférieur avec des trous pour l’insertion de l’aimant. REMARQUE : L’épaisseur du boîtier inférieur est un paramètre critique et doit correspondre à l’épaisseur totale du module central pour éviter les fuites pendant l’écoulement.</li>
	<li>Retirez la couche protectrice PSA et fixez le boîtier inférieur à une lamelle en verre.</li>
	<li>Enfoncez à la presse des aimants en néodyme nickelé de 4,75 mm (voir tableau des matériaux) dans les trous découpés au laser des boîtiers. REMARQUE : Assurez-vous que les aimants des boîtiers inférieur et supérieur sont placés avec une polarité opposée pour assurer l’attraction magnétique (Figure 6).</li>
</ol>4. Fabrication du circuit d’écoulement
REMARQUE : Le circuit d’écoulement en boucle fermée contient deux flacons de prélèvement d’échantillons comme réservoirs (Figure 7). Le réservoir d’entrée est équipé d’un filtre au difluorure de polyvinylidène (PVDF) pour permettre au média cellulaire de s’équilibrer avec la concentration de CO2 dans l’incubateur.
<ol><li>Utilisez un poinçon de biopsie de 1 mm pour créer deux trous dans le bouchon d’un flacon de prélèvement d’échantillon.</li>
	<li>Utilisez des poinçons de biopsie pour créer deux trous (1 mm et 4 mm) dans le bouchon d’un flacon de prélèvement d’échantillon séparé et créez un trou de 1 mm dans la partie inférieure de ce flacon.</li>
	<li>Insérez des pointes de distribution de 20 g dans chacun des trous de 1 mm et scellez-les avec de la colle chaude.</li>
	<li>Placez un filtre PVDF de 0,22 μm (voir tableau des matériaux) dans le trou de 4 mm et scellez-le avec de la colle chaude.</li>
	<li>Découper au laser une feuille d’acrylique de 1,5 mm en utilisant le dessin fourni dans le fichier de codage supplémentaire 7 pour créer une étape de maintien de l’échantillon.</li>
	<li>Positionnez les réservoirs sur la platine acrylique.</li>
	<li>Connectez les pointes de distribution à l’aide de tubes à micro-flux (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Reliez les tubes à l’entrée et à la sortie du module de débit à l’aide d’embouts de distribution de 21 G.</li>
	<li>Utilisez une pompe péristaltique (voir le tableau des matériaux) pour la circulation du débit. REMARQUE : Des pompes à seringue ou pneumatiques peuvent également être utilisées pour introduire le débit si vous le souhaitez. Le débit doit être déterminé en fonction des besoins expérimentaux. Un tableau complet, dérivé d’un modèle COMSOL validé expérimentalement, est fourni dans le tableau supplémentaire 1 pour aider les utilisateurs à sélectionner le débit nécessaire pour obtenir la contrainte de cisaillement souhaitée au niveau de la monocouchede cellule 16.</li>
</ol>5. Ensemencement cellulaire
REMARQUE : Semblable aux inserts de membrane conventionnels, différents types de cellules peuvent être cultivés sur la nanomembrane. Un type de cellule secondaire peut également être co-cultivé de l’autre côté de la membrane dans le canal inférieur15.
<ol><li>Enduire la membrane de 5 μg/cm2 de fibronectine (voir le tableau des matériaux) à température ambiante pendant 1 h pour améliorer la fixation des cellules. REMARQUE : Le type de cellule choisi peut influencer le revêtement et la densité cellulaire requis. La procédure décrite ici concerne les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC, voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Aspirez la solution d’enrobage à l’aide d’une pipette P200 et placez un pochoir de motif dans le puits du module central.</li>
	<li>Ajoutez des supports cellulaires au puits et au canal inférieur de l’appareil.</li>
	<li>Semez des HUVEC à une densité de 40 000 cellules/cm2 dans le puits. NOTE : Les HUVEC à cette densité forment généralement une monocouche confluente après 24 h d’incubation16,19.</li>
	<li>Placez l’appareil dans une boîte de Pétri. Ajouter un bouchon de tube conique de 15 mL avec de l’eau DI dans la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité locale.</li>
	<li>Transférez la boîte de Pétri dans l’incubateur. REMARQUE : Les supports cellulaires dans le puits supérieur et le canal inférieur de l’appareil doivent être changés toutes les 24 heures. Pour changer le support dans le canal inférieur, injectez doucement un nouveau support dans l’un des ports pour déplacer l’ancien support de l’autre port.</li>
</ol>6. Reconfiguration en mode microfluidique
<ol><li>Stérilisez le boîtier supérieur, le boîtier inférieur, le module de débit, les réservoirs, les tubes et les embouts de distribution en les plaçant dans une chambre de stérilisation UV pendant 30 minutes avant l’assemblage. Faire circuler de l’éthanol à 70% puis du PBS stérile dans le circuit d’écoulement.</li>
	<li>Remplissez les réservoirs et les tubes avec un milieu de croissance des cellules endothéliales (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Placez le boîtier inférieur sur la platine d’échantillonnage. Insérez le module à noyau à puits ouvert dans le boîtier inférieur.</li>
	<li>Aspirer le milieu cellulaire du puits du module. Placez le module d’écoulement dans le puits.</li>
	<li>Placez le boîtier supérieur pour bien sceller le module de débit dans le module central. Connectez les pointes de distribution d’entrée et de sortie aux ports du module de débit.</li>
	<li>Démarrez la pompe péristaltique pour introduire un écoulement de fluide dans le système.</li>
</ol>7. Effectuer une analyse en aval sous forme de puits ouvert après l’introduction de l’écoulement
NOTE : Le temps de culture dépend ici des objectifs expérimentaux. Les utilisateurs peuvent effectuer des analyses en aval (par exemple, immunocytochimie, extraction d’ARN) dans des formats à puits ouvert ou microfluidiques selon leurs préférences. Par exemple, si un format à puits ouvert est préféré, le système doit être reconfiguré pour effectuer des analyses basées sur des protocoles standard 16,19.
<ol><li>Arrêtez la pompe lorsque le temps souhaité pour l’exposition au flux de cisaillement est atteint. Retirez les embouts de distribution d’entrée et de sortie.</li>
	<li>Retirez le boîtier supérieur. Retirez délicatement le module d’écoulement du puits à l’aide d’une pince à épiler.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de milieu cellulaire dans le puits. Effectuer les tests souhaités en fonction des protocoles standard.</li>
</ol>

Une plate-forme de tissu barrière reconfigurable avec des modes à puits ouvert et microfluidique

<ol>
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J.L.M. est cofondateur de SiMPore, Inc. et détient une participation dans la société. SiMPore commercialise les technologies à base de silicium ultramince, y compris les membranes utilisées dans cette étude.

L’objectif de ce protocole est de développer une méthode pratique pour intégrer les capacités d’écoulement dans une plate-forme à puits ouvert dotée d’une nanomembrane ultrafine. Dans cette conception, une approche de verrouillage magnétique est utilisée, permettant de basculer entre les modes puits ouvert et fluidique pendant les expériences et combinant les avantages des deux approches. Contrairement aux plates-formes conventionnelles à liaison permanente, le verrouillage magnétique permet de démonte...

Les barrières vasculaires servent d’interface critique qui sépare le compartiment sanguin des tissus environnants. Ils jouent un rôle essentiel dans la préservation de l’homéostasie en attirant les cellules immunitaires, en contrôlant la perméabilité moléculaire et en protégeant contre l’intrusion d’agents pathogènes dans les tissus 1,2. Des modèles de culture in vitro ont été développés pour imiter le microenvironnement in vivo, permettant des études systématiques sur les facteurs et les conditions qui ont un impact sur les propriétés de barrière à l’état sain et malade 3,4.
L’approche la plus largement utilisée pour de tels modèles de culture est la configuration « à puits ouvert »de type Transwell 5, où une membrane de culture poreuse et gravée sépare les compartiments remplis de milieux (Figure 1A). Dans ce format, les cellules peuvent être ensemencées de chaque côté de la membrane, et un large éventail de protocoles expérimentaux a été développé. Cependant, ces systèmes sont limités dans leur capacité à fournir les flux de fluides essentiels pour soutenir la maturation de la barrière et imiter la circulation des cellules immunitaires observée in vivo 5,6. Par conséquent, ils ne peuvent pas être utilisés pour des études nécessitant des écoulements dynamiques qui introduisent des doses de médicaments, une stimulation mécanique ou des contraintes de cisaillement induites par un fluide 6,7,8.
Pour surmonter les limites des systèmes à puits ouverts, des plateformes microfluidiques combinant des membranes de culture poreuses avec des canaux fluidiques adressables individuellement ont été développées9. Ces plates-formes offrent un contrôle précis de l’acheminement des fluides, de la perfusion et de l’introduction de composés chimiques, une stimulation contrôlée par cisaillement et des capacités d’ajout dynamique de cellules 7,10,11,12,13. Malgré les capacités avancées fournies par les plateformes microfluidiques, elles n’ont pas été largement adoptées dans les laboratoires de biosciences en raison de protocoles microfluidiques complexes et de leur incompatibilité avec les flux de travail expérimentaux établis 4,10,14.
Pour combler le fossé entre ces technologies, nous présentons un protocole qui utilise un système modulaire magnétiquement reconfigurable. Ce système peut être facilement commuté entre les modes puits ouvert et microfluidique en fonction des besoins spécifiques de l’expérience. La plateforme comprend un dispositif à puits ouvert, connu sous le nom de m-μSiM (système microphysiologique modulaire activé par une membrane de silicium), avec une membrane de culture de 100 nm d’épaisseur (nanomembrane). Cette nanomembrane possède une porosité élevée (15 %) et une transparence semblable à celle du verre, comme illustré à la figure 1B. Il sépare physiquement le compartiment supérieur d’un canal inférieur, permettant le transport moléculaire à travers des échelles de longueur physiologiques15. Contrairement aux membranes conventionnelles gravées par trace, qui présentent des défis connus pour l’imagerie des cellules vivantes avec l’imagerie en fond clair, les propriétés optiques et physiques favorables de la nanomembrane permettent une visualisation claire des cellules de chaque côté de la surface de la membrane 15,16,17.
Le présent protocole décrit la fabrication de modules d’ensemencement et d’écoulement spécialisés et explique la reconfiguration magnétique de la plate-forme. Il montre comment la plateforme peut être utilisée pour établir des barrières endothéliales dans des conditions statiques et dynamiques. Cette démonstration révèle que les cellules endothéliales s’alignent dans le sens du flux, avec une régulation à la hausse des cibles génétiques sensibles au cisaillement sous stimulation par cisaillement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 x 0.86 Micro Flow tubes</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>WX10-14 &#38; DG Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS 7.4 pH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG20-1.5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG21-1.0HPX-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9726-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9720-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488 conjugated phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#160;TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ64100-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K171</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 1/16&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8589K31</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 3/32&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K191</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 7.64&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human, 1 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture A1&#38;A2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture B1&#38;B2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4374966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C0035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>D31</td>
			<td>3/16&#34; dia.&#160;x 1/16&#34; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>aa47392-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>BQ50-1J-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 developer solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filters</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2542913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer,USA</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0702369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Pierce 20x PBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100500-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI-reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin Nanoporous Membrane Chip</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NPSN100-1L</td>
			<td>The design is&#160; compatible with all of SiMPore membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 1</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transforming static barrier tissue models into dynamic microphysiological systems

Les systèmes microphysiologiques sont des plateformes de culture cellulaire miniaturisées utilisées pour imiter la structure et la fonction des tissus humains en laboratoire. Cependant, ces plateformes n’ont pas été largement adoptées dans les laboratoires de biosciences où les approches membranaires à puits ouverts servent de référence pour imiter les barrières tissulaires, malgré l’absence de capacités d’écoulement des fluides. Ce problème peut être principalement attribué à l’incompatibilité des systèmes microphysiologiques existants avec les protocoles et outils standard développés pour les systèmes à puits ouverts.
Ici, nous présentons un protocole pour créer une plate-forme membranaire reconfigurable avec une structure à puits ouverts, une capacité d’amélioration de l’écoulement et une compatibilité avec les protocoles conventionnels. Ce système utilise une approche d’assemblage magnétique qui permet une commutation réversible entre les modes puits ouverts et microfluidique. Grâce à cette approche, les utilisateurs ont la possibilité de commencer une expérience dans le format de puits ouvert en utilisant des protocoles standard et d’ajouter ou de supprimer des capacités d’écoulement selon les besoins. Pour démontrer l’utilisation pratique de ce système et sa compatibilité avec les techniques standard, une monocouche de cellules endothéliales a été établie dans un format à puits ouvert. Le système a été reconfiguré pour introduire un flux de fluide, puis est passé au format à puits ouvert pour effectuer l’immunomarquage et l’extraction de l’ARN. En raison de sa compatibilité avec les protocoles conventionnels à puits ouverts et de sa capacité d’amélioration de l’écoulement, cette conception reconfigurable devrait être adoptée par les laboratoires d’ingénierie et de biosciences.

Vascular barriers serve as a critical interface that separates the blood compartment from the surrounding tissue. They play a critical role in preserving homeostasis by attracting immune cells, controlling molecular permeability, and shielding against the intrusion of pathogens into the tissue1,2. In vitro culture models have been developed to mimic the in vivo microenvironment, enabling systematic investigations into the factors and conditions that impact barrier properties in both healthy and diseased states3,4.
The most widely used approach for such culture models is the Transwell-like &#34;open-well&#34; configuration5, where a porous, track-etched culture membrane separates media-filled compartments (Figure 1A). In this format, cells can be seeded on either side of the membrane, and a wide range of experimental protocols has been developed. However, these systems are limited in their ability to provide the fluid flows essential for supporting barrier maturation and mimicking immune cell circulation seen in vivo5,6. Consequently, they cannot be used for studies requiring dynamic flows that introduce drug doses, mechanical stimulation, or fluid-induced shear stresses6,7,8.
To overcome the limitations of open-well systems, microfluidic platforms that combine porous culture membranes with individually addressable fluidic channels have been developed9. These platforms offer precise control over fluid routing, perfusion, and the introduction of chemical compounds, controlled shear stimulation, and dynamic cell addition capabilities7,10,11,12,13. Despite the advanced capabilities provided by microfluidic platforms, they have not seen widespread adoption in bioscience laboratories due to complex microfluidic protocols and their incompatibility with established experimental workflows4,10,14.
To bridge the gap between these technologies, we present a protocol that employs a magnetically reconfigurable, module-based system. This system can be easily switched between open-well and microfluidic modes based on the specific needs of the experiment. The platform features an open-well device, known as m-&#181;SiM (modular microphysiological system enabled by a silicon membrane), with a 100 nm thick culture membrane (nanomembrane). This nanomembrane possesses high porosity (15%) and glass-like transparency, as illustrated in Figure 1B. It physically separates the top compartment from a bottom channel, allowing for molecular transport across physiological length scales15. Unlike conventional track-etched membranes, which have known challenges in imaging live cells with bright-field imaging, the nanomembrane&#39;s favorable optical and physical properties enable clear visualization of cells on either side of the membrane surface15,16,17.
The present protocol outlines the fabrication of specialized seeding and flow modules and explains the magnetic reconfiguration of the platform. It demonstrates how the platform can be employed to establish endothelial barriers under both static and dynamic conditions. This demonstration reveals that endothelial cells align along the flow direction, with an upregulation of shear-sensitive gene targets under shear stimulation.

Pleins feux sur l’auteur : Développement d’un système microphysiologique modulaire unique pour imiter le tissu de la barrière humaine

Transformer des modèles de tissus de barrière statique en systèmes microphysiologiques dynamiques

Le module central à puits ouvert est initialement positionné dans une cavité spécifique créée par un boîtier inférieur et une lamelle, comme illustré à la figure 6A. Ensuite, le module de flux, qui comprend un microcanal et des ports d’accès, est inséré dans le puits du module central. Le module d’écoulement est solidement scellé contre la couche de support en silicium de la membrane en raison de la force d’attraction magnétique entre les aimants intégrés dans les bo?...

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Ce protocole décrit une plate-forme de culture cellulaire reconfigurable à base de membranes qui intègre le format à puits ouvert avec des capacités d’écoulement de fluide. Cette plateforme est compatible avec les protocoles standard et permet des transitions réversibles entre les modes de culture à puits ouvert et microfluidique, répondant aux besoins des laboratoires d’ingénierie et de biosciences.

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

Nous développons des systèmes microphysiologiques modulaires qui imitent les tissus barrières humains. Notre système est unique car il peut être reconfiguré d’une culture statique à puits ouverts à un système amélioré par l’écoulement. Cette flexibilité permet à la plateforme d’être utilisée à la fois dans les laboratoires axés sur les biosciences et l’ingénierie.Nous présentons un protocole pour créer une plate-forme à puits ouverts reconfigurable avec une imagerie de la culture et du mode de vie améliorée par flux. Il est compatible avec les protocoles de biosciences conventionnels. Notre conception reconfigurable permet aux utilisateurs de basculer entre le mode puits ouvert et le mode microfluidique au cours d’une expérience, et permet à l’utilisateur d’effectuer chaque étape en utilisant un format avec lequel il est à l’aise.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

742 vues.  Rochester Institute of Technology. Nous développons des systèmes microphysiologiques modulaires qui imitent les tissus barrières humains. Notre système est unique car il peut être reconfiguré d’une culture statique à puits ouverts à un système amélioré par l’écoulement. Cette flexibilité permet à la plateforme d’être utilisée à la fois dans les laboratoires axés sur les biosciences et l’ingénierie.Nous présentons un protocole pour créer une plate-forme à puits ouverts reconfigurable avec un...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Développement d’un système microphysiologique modulaire unique pour imiter le tissu de la barrière humaine

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.

Recherche

Bio-ingénierie

Fabricating Patterning Stencil, Flow Module, and Housings for a Reconfigurable Membrane-Based Cell Culture Platform

Fabrication d’un pochoir de motifs, d’un module d’écoulement et de boîtiers pour une plate-forme de culture cellulaire reconfigurable à base de membranes