Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 ve NSF hibe CBET 2150798 altında finanse edildi. Yazarlar, alüminyum kalıp imalatı için RIT Machine Shop'a teşekkür ediyor. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir.

Bu tasarım, deneysel gereksinimlere ve son kullanıcının tercihlerine göre çeşitli modlarda kullanılabilir. Her deneyden önce, protokol için gerekli adımları ve modülleri belirlemek için Şekil 2'de sunulan karar akış şemasına bakın. Örneğin, kullanıcı bir deney boyunca Transwell tipi sistemle doğrudan karşılaştırmak için açık kuyu biçimini korumayı planlıyorsa, hücre tohumlama için desen şablonu gerekli değildir. Çekirdek modül ticari olarak temin edilebilir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ultra ince nanomembran, deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde farklı gözeneklilik ve gözenek boyutlarına sahip bir malzeme kütüphanesinden seçilebilir.
1. Desen şablonunun imalatı
NOT: Desen şablonu, hücreleri yalnızca membran çipinin gözenekli bölgesine yerleştirmeye yarar ve hücrelerin, akış modülü eklendikten sonra potansiyel olarak hasar görebilecekleri çevreleyen silikon katmana yerleşmesini önler16 (bkz. Şekil 3). Tek katmanın hasar görmesi, bariyer bütünlüğünü olumsuz etkileyebilir ve deneysel sonuçları tehlikeye atabilir. Açık, statik bir kültürde şablon gereksizdir, çünkü hasar riski yoktur.
<ol><li>Ek Kodlama Dosyası 1'de (Şekil 4A) sağlanan tasarımı kullanarak bir kalıp satın alın, işleyin veya 3D yazdırın. NOT: Şablon duvarları, yüksek en-boy oranlı düz duvarlı özelliklere kıyasla ortam kapasitesini artırmak ve kabarcık sıkışmasını en aza indirmek için koniktir.</li>
	<li>Soğuk bir rulo kullanarak 130 μm basınca duyarlı yapışkan (PSA) filmi 3.2 mm'lik bir akrilik levhaya yapıştırın (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Bir dizi boşluk oluşturmak için akrilik levhayı Ek Kodlama Dosyası 2'de sağlanan tasarıma göre lazerle kesin (Şekil 4B).</li>
	<li>Koruyucu tabakayı PSA filminden soyun ve akrilik tabakayı kalıba yapıştırın. NOT: Kalıp özellikleri boşluk içinde ortalanacak şekilde lazerle kesilmiş tabakanın kalıpla hizalandığından emin olun (Şekil 4C). Zar üzerindeki hücre konumlandırmasının doğruluğu bu adıma bağlıdır.</li>
	<li>PDMS prepolimerini iyice karıştırın (10:1 baz-katalizör oranı kullanarak) ( Malzeme Tablosuna bakın) ve görünür kabarcık kalmayana kadar (5-15 dakika) bir vakum odasında gazını alın.</li>
	<li>PDMS'yi yavaşça kalıp boşluklarına dökün ve düz bir kenarla düzleştirin. NOT: Kabarcık sıkışmasını önlemek için PDMS'yi her boşluğa yavaşça dökün. Döküldükten sonra kabarcıklar varsa, kalıbı vakum odasına yerleştirin ve tekrar gazdan arındırın.</li>
	<li>PDMS'yi bir ocak gözü üzerinde 70 °C'de 1 saat kürleyin ve ardından oda sıcaklığına soğumaya bırakın.</li>
	<li>Düz uçlu cımbız kullanarak kalıpları kalıp boşluklarından çıkarın.</li>
</ol>2. Akış modülünün imalatı
NOT: Akış modülü, çekirdek modülün yonca şeklindeki kuyusu ile benzer bir ayak izini paylaşır ve kalıplanmış bir mikro kanal içerir (genişlik = 1.5 mm, yükseklik = 0.2 mm, uzunluk = 5 mm). Yonca şekli, kanalın gözenekli kültür bölgesi üzerinde hizalanmasına yardımcı olur (Şekil 5).
<ol><li>Ek Kodlama Dosyası 3'te (Şekil 4D) sağlanan tasarım tarafından tanımlanan özelliklere sahip bir silikon kalıp oluşturmak için standart yumuşak litografi tekniklerini 18 kullanın.</li>
	<li>3,2 mm kalınlığında bir akrilik levhaya 130 μm PSA filmi yapıştırın.</li>
	<li>Bir dizi yonca şeklindeki boşluk oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 4'te verilen tasarıma dayalı olarak akrilik levhayı lazerle kesin (Şekil 4E). NOT: Boşluğun yüksekliği, uygun sızdırmazlığı sağlamak için çekirdek modülün yüksekliğinden biraz daha uzun (0-0.1 mm) olması gereken akış modülünün yüksekliğini belirler.</li>
	<li>Koruyucu tabakayı PSA filminden çıkarın ve ardından silikon kalıp üzerindeki üçgen hizalama işaretlerini lazer kesim tabakadakilerle hizalayarak lazer kesim tabakayı silikon kalıba yapıştırın. NOT: Adım 1.4'e benzer şekilde, lazerle kesilmiş akrilik levhanın, kalıp özellikleri her boşlukta ortalanacak şekilde silikon kalıpla hizalandığından emin olun (Şekil 4F). Bu adım, mikrokanalın ayak izine göre konumunu belirler.</li>
	<li>Gazdan arındırılmış PDMS'yi kalıp boşluklarına yavaşça dökün ve düz bir kenarla düzleştirin. NOT: Döküldükten sonra kabarcıklar varsa, kabarcıklar çıkana kadar kalıbın gazını alın.</li>
	<li>Kalıbı bir ocak gözüne yerleştirin ve PDMS'yi 70 °C'de 1 saat pişirin, ardından kalıbın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Düz uçlu cımbız kullanarak akış modüllerini kalıp boşluklarından dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Akış modülünü mikro kanal özellikleri yukarı bakacak şekilde yönlendirin ve bir biyopsi zımbası kullanarak çekirdek giriş ve çıkış portlarını kanalın sonuna yerleştirin (bkz.</li>
</ol>3. Alt ve üst akrilik muhafazaların imalatı
NOT: Çekirdek modül alt muhafazaya sığar. Muhafazalardaki gömülü mıknatıslar arasındaki çekim, akış modülünü çekirdek modüle sıkıştırır ve sızdırmaz hale getirir (Şekil 6).
<ol><li>Mıknatıs yerleştirme delikleri olan üst muhafazayı oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 5'te sağlanan tasarımı kullanarak 2 mm'lik bir akrilik levhayı lazerle kesin.</li>
	<li>3,5 mm'lik bir akrilik levhaya 130 μm'lik bir PSA filmi yapıştırın.</li>
	<li>Mıknatıs yerleştirme delikleri olan alt muhafazayı oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 6'da verilen tasarıma göre akrilik levhayı lazerle kesin. NOT: Alt muhafazanın kalınlığı kritik bir parametredir ve akış sırasında sızıntıyı önlemek için çekirdek modülün toplam kalınlığına uygun olmalıdır.</li>
	<li>PSA koruyucu tabakayı çıkarın ve alt muhafazayı bir cam lamel üzerine takın.</li>
	<li>4,75 mm nikel kaplı neodimyum mıknatısları ( Malzeme Tablosuna bakın) muhafazaların lazerle kesilmiş deliklerine bastırın. NOT: Manyetik çekimi sağlamak için alt ve üst muhafazalardaki mıknatısların zıt kutuplarla yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 6).</li>
</ol>4. Akış devresinin imalatı
NOT: Kapalı döngü akış devresi, rezervuar olarak iki numune toplama şişesi içerir (Şekil 7). Giriş rezervuarı, hücre ortamının inkübatördeki CO2 konsantrasyonu ile dengelenmesini sağlamak için bir poliviniliden diflorür (PVDF) filtresine sahiptir.
<ol><li>Bir numune toplama şişesinin kapağında iki delik oluşturmak için 1 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanın.</li>
	<li>Ayrı bir numune toplama şişesinin kapağında iki delik (1 mm ve 4 mm) oluşturmak için biyopsi zımbaları kullanın ve bu şişenin alt kısmında 1 mm'lik bir delik oluşturun.</li>
	<li>20 mm'lik deliklerin her birine 1 G dağıtım ucu yerleştirin ve bunları sıcak tutkalla kapatın.</li>
	<li>4 mm'lik deliğe 0,22 μm'lik bir PVDF filtresi ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin ve sıcak tutkalla kapatın.</li>
	<li>Bir numune tutma aşaması oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 7'de sağlanan tasarımı kullanarak 1,5 mm'lik bir akrilik levhayı lazerle kesin.</li>
	<li>Rezervuarları akrilik tabla üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Mikro akış tüpleri kullanarak dağıtım uçlarını bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>21 G dağıtım uçlarını kullanarak tüpleri akış modülünün giriş ve çıkışına bağlayın.</li>
	<li>Akış sirkülasyonu için peristaltik bir pompa ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. NOT: İstenirse akışı sağlamak için şırınga veya pnömatik pompalar da kullanılabilir. Akış hızı deneysel ihtiyaçlara göre belirlenmelidir. Deneysel olarak doğrulanmış bir COMSOL modelinden türetilen kapsamlı bir tablo, kullanıcıların hücre tek tabakası16'da istenen kesme gerilimini elde etmek için gerekli akış hızını seçmelerine yardımcı olmak için Ek Tablo 1'de verilmiştir.</li>
</ol>5. Hücre tohumlama
NOT: Geleneksel membran eklerine benzer şekilde, nanomembran üzerinde farklı hücre tipleri kültürlenebilir. İkincil bir hücre tipi, alt kanal15'teki zarın diğer tarafında da birlikte kültürlenebilir.
<ol><li>Hücre yapışmasını iyileştirmek için membranı 5 μg /cm2 fibronektin ile kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 1 saat. NOT: Seçilen hücre tipi, gerekli kaplamayı ve hücre yoğunluğunu etkileyebilir. Burada açıklanan prosedür, İnsan umbilikal ven endotel hücreleri içindir (HUVEC'ler, bkz.</li>
	<li>Kaplama solüsyonunu bir P200 pipeti kullanarak aspire edin ve çekirdek modül kuyucuğuna bir desen şablonu yerleştirin.</li>
	<li>Cihazın kuyusuna ve alt kanalına hücre ortamı ekleyin.</li>
	<li>40.000 hücre/cm2 yoğunlukta HUVEC'leri kuyuya tohumlayın. NOT: Bu yoğunluktaki HUVEC'ler tipik olarak 24 saatlik inkübasyondansonra birleşik bir tek tabaka oluşturur 16,19.</li>
	<li>Cihazı bir Petri kabına yerleştirin. Yerel nemi korumak için Petri kabına DI su içeren 15 mL'lik bir konik tüp kapağı ekleyin.</li>
	<li>Petri kabını inkübatöre aktarın. NOT: Cihazın üst kuyu ve alt kanalındaki hücre ortamı her 24 saatte bir değiştirilmelidir. Alt kanaldaki medyayı değiştirmek için, eski medyayı diğer porttan çıkarmak için portlardan birine yavaşça yeni medya enjekte edin.</li>
</ol>6. Mikroakışkan moduna yeniden yapılandırma
<ol><li>Üst muhafazayı, alt muhafazayı, akış modülünü, rezervuarları, tüpleri ve dağıtım uçlarını montajdan önce 30 dakika boyunca bir UV sterilizasyon odasına yerleştirerek sterilize edin. Akış devresinde% 70 etanol ve ardından steril PBS dolaştırın.</li>
	<li>Rezervuarları ve tüpleri Endotel Hücre Büyüme ortamı ile doldurun (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Alt muhafazayı s'ye yerleştirinamptage. Açık kuyu çekirdek modülünü alt muhafazaya yerleştirin.</li>
	<li>Modülün kuyusundan hücre ortamını aspire edin. Akış modülünü kuyuya yerleştirin.</li>
	<li>Akış modülünü çekirdek modül kuyusuna sızdırmaz hale getirmek için üst muhafazayı yerleştirin. Giriş ve çıkış dağıtım uçlarını akış modülü bağlantı noktalarına bağlayın.</li>
	<li>Sisteme sıvı akışı sağlamak için peristaltik pompayı çalıştırın.</li>
</ol>7. Akış girişinden sonra açık kuyu formatında aşağı akış analizinin yapılması
NOT: Buradaki kültür süresi deneysel hedeflere bağlıdır. Kullanıcılar, tercihlerine göre açık kuyu veya mikroakışkan formatlarda aşağı akış analizi (örneğin, İmmünositokimya, RNA ekstraksiyonu) yapabilirler. Örneğin, bir açık kuyu formatı tercih edilirse, sistem standart protokollere16,19 dayalı tahliller yapacak şekilde yeniden yapılandırılmalıdır.
<ol><li>Kesme akışına maruz kalma için istenen süreye ulaşıldığında pompayı durdurun. Giriş ve çıkış dağıtım uçlarını çıkarın.</li>
	<li>Üst muhafazayı çıkarın. Akış modülünü cımbız kullanarak kuyudan yavaşça çıkarın.</li>
	<li>Kuyuya 100 μL hücre ortamı ekleyin. Standart protokollere dayalı olarak istenen tahlilleri gerçekleştirin.</li>
</ol>

Açık Kuyu ve Mikroakışkan Modlarına Sahip Yeniden Yapılandırılabilir Bir Bariyer Doku Platformu

<ol>
	<li>Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+Endothelial+Barrier:+Identifying+and+Reconciling+Controversies.">Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).</li><li>Vera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue+barrier+models+on+hydrogel+microfluidic+platforms.">Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).</li><li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening.">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).</li><li>Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+barrier+tissues+in+vitro:+methods,+achievements,+and+challenges.">Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges.</a> eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).</li><li>Kaisar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+experimental+models+of+the+blood-brain+barrier+for+CNS+drug+discovery.">New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+microphysiological+system+(PREDICT-96)+to+recapitulate+hepatocyte+function+in+dynamic,+re-circulating+flow+conditions.">A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions.</a> Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).</li><li>Ayuso, J. M., Virumbrales-Mu&#241;oz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+microfluidic+systems+in+precision+medicine.">A role for microfluidic systems in precision medicine.</a> Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).</li><li>Katt, M. E., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+building+in+physiological+complexity.">In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).</li><li>Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+reframing+biological+enquiry.">Microfluidics: reframing biological enquiry.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+rapidly+integrated+debubbler+(rid)+module+for+microfluidic+cell+culture+applications.">A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications.</a> Micromachines. 10 (6), 360 (2019).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+fiber+anisotropy+within+natural+collagen+hydrogels.">Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+3D+collagen+gels+with+independently+tunable+fiber+anisotropy+and+directionality.">Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality.</a> Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).</li><li>&#321;ach, A., Wnuk, A., W&#243;jtowicz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+to+study+the+functions+of+the+blood-brain+barrier.">Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier.</a> Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).</li><li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Modular+&#181;SiM:+A+mass+produced,+rapidly+assembled,+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro.">The Modular &#181;SiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+&#181;sim+reconfigured:+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow.">The modular &#181;sim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).</li><li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+using+an+ultrathin+silicon+nitride+membrane-based+microfluidic+device.">Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).</li><li>Joshi, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+3D+Collagen+Matrices+with+Tumor-Mimetic+Gradients+in+Fiber+Alignment.">Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Hsu, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniaturized+3D+printed+pressure+regulator+(&#181;PR)+for+microfluidic+cell+culture+applications.">A miniaturized 3D printed pressure regulator (&#181;PR) for microfluidic cell culture applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).</li><li>Rogers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+bilayer+co-culture+platform+to+study+endothelial-pericyte+interactions.">A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions.</a> Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).</li><li>Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passing+the+vascular+barrier:+endothelial+signaling+processes+controlling+extravasation.">Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).</li><li>Wang, Y. I., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniChip+enables+long-term+recirculating+unidirectional+perfusion+with+gravity-driven+flow+for+microphysiological+systems.">UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).</li><li>Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Go+with+the+flow&amp;#34;:+how+Kr&#252;ppel-like+factor+2+regulates+the+vasoprotective+effects+of+shear+stress.">34;Go with the flow&amp;#34;: how Kr&#252;ppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).</li><li>Satoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+pressure-driven+multi-throughput+microfluidic+circulation+culture+system.">A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system.</a> Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).</li><li>Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reversibly+sealed,+easy+access,+modular+(seam)+microfluidic+architecture+to+establish+in+vitro+tissue+interfaces.">A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces.</a> PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+extensional+flows+promote+long-range+fiber+alignment+in+3D+collagen+hydrogels.">Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels.</a> Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).</li><li>Hasan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fabrication+of+flexible+nanotextured+PDMS+as+a+substrate+for+selective+cell+capture.">One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture.</a> Biomedical Physics &amp; Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+3D+collagen+hydrogels+with+long-range+fiber+alignment.">Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment.</a> Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).</li></ol>

J.L.M., SiMPore, Inc.'in kurucu ortağıdır ve şirkette öz sermaye payına sahiptir. SiMPore, bu çalışmada kullanılan membranlar da dahil olmak üzere ultra ince silikon bazlı teknolojileri ticarileştiriyor.

Bu protokolün amacı, akış yeteneklerini ultra ince bir nanomembran içeren bir açık kuyu platformuna dahil etmek için pratik bir yöntem geliştirmektir. Bu tasarımda, deneyler sırasında açık kuyu ve akışkan modları arasında geçişe izin veren ve her iki yaklaşımın avantajlarını birleştiren manyetik bir kilitleme yaklaşımı kullanılmıştır. Geleneksel kalıcı olarak bağlı platformların aksine, manyetik kilitleme, platformun deneysel iş akışı 16,25,26,27</su...

Vasküler bariyerler, kan bölmesini çevreleyen dokudan ayıran kritik bir arayüz görevi görür. Bağışıklık hücrelerini çekerek, moleküler geçirgenliği kontrol ederek ve patojenlerin dokuya girmesine karşı kalkan oluşturarak homeostazın korunmasında kritik bir rol oynarlar 1,2. İn vivo mikroçevreyi taklit etmek için in vitro kültür modelleri geliştirilmiştir ve hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda bariyer özelliklerini etkileyen faktörlerin ve koşulların sistematik olarak araştırılmasını sağlar 3,4.
Bu tür kültür modelleri için en yaygın kullanılan yaklaşım, gözenekli, iz ile kazınmış bir kültür zarının ortamla dolu bölmeleri ayırdığı Transwell benzeri "açık kuyu" konfigürasyonu5'tir (Şekil 1A). Bu formatta, hücreler zarın her iki tarafına da ekilebilir ve çok çeşitli deneysel protokoller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo 5,6'da görülen bariyer olgunlaşmasını desteklemek ve bağışıklık hücresi dolaşımını taklit etmek için gerekli olan sıvı akışlarını sağlama yetenekleri bakımından sınırlıdır. Sonuç olarak, ilaç dozları, mekanik stimülasyon veya sıvı kaynaklı kesme gerilmeleri 6,7,8 uygulayan dinamik akışlar gerektiren çalışmalar için kullanılamazlar.
Açık kuyu sistemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, gözenekli kültür membranlarını ayrı ayrı adreslenebilir akışkan kanallarla birleştiren mikroakışkan platformlar geliştirilmiştir9. Bu platformlar, sıvı yönlendirme, perfüzyon ve kimyasal bileşiklerin eklenmesi, kontrollü kesme stimülasyonu ve dinamik hücre ekleme yetenekleri üzerinde hassas kontrol sunar 7,10,11,12,13. Mikroakışkan platformlar tarafından sağlanan gelişmiş yeteneklere rağmen, karmaşık mikroakışkan protokoller ve yerleşik deneysel iş akışlarıyla uyumsuzlukları nedeniyle biyobilim laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmemişlerdir 4,10,14.
Bu teknolojiler arasındaki boşluğu doldurmak için, manyetik olarak yeniden yapılandırılabilir, modül tabanlı bir sistem kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, deneyin özel ihtiyaçlarına göre açık kuyu ve mikroakışkan modları arasında kolayca değiştirilebilir. Platform, 100 nm kalınlığında bir kültür zarına (nanomembran) sahip m-μSiM (silikon membran tarafından etkinleştirilen modüler mikrofizyolojik sistem) olarak bilinen açık kuyulu bir cihaza sahiptir. Bu nanomembran, Şekil 1B'de gösterildiği gibi yüksek gözenekliliğe (% 15) ve cam benzeri şeffaflığa sahiptir. Üst bölmeyi bir alt kanaldan fiziksel olarak ayırır ve fizyolojik uzunluk ölçekleri15 boyunca moleküler taşımaya izin verir. Parlak alan görüntüleme ile canlı hücrelerin görüntülenmesinde bilinen zorluklara sahip olan geleneksel iz kazınmış membranların aksine, nanomembranın uygun optik ve fiziksel özellikleri, membran yüzeyinin her iki tarafındaki hücrelerin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar 15,16,17.
Mevcut protokol, özel tohumlama ve akış modüllerinin imalatını özetlemekte ve platformun manyetik olarak yeniden yapılandırılmasını açıklamaktadır. Platformun hem statik hem de dinamik koşullar altında endotel bariyerleri oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösterir. Bu gösteri, endotel hücrelerinin, kayma stimülasyonu altında kaymaya duyarlı gen hedeflerinin yukarı regülasyonu ile akış yönü boyunca hizalandığını ortaya koymaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 x 0.86 Micro Flow tubes</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>WX10-14 &#38; DG Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS 7.4 pH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG20-1.5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG21-1.0HPX-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9726-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9720-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488 conjugated phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#160;TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ64100-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K171</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 1/16&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8589K31</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 3/32&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K191</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 7.64&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human, 1 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture A1&#38;A2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture B1&#38;B2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4374966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C0035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>D31</td>
			<td>3/16&#34; dia.&#160;x 1/16&#34; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>aa47392-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>BQ50-1J-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 developer solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filters</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2542913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer,USA</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0702369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Pierce 20x PBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100500-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI-reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin Nanoporous Membrane Chip</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NPSN100-1L</td>
			<td>The design is&#160; compatible with all of SiMPore membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 1</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transforming static barrier tissue models into dynamic microphysiological systems

Mikrofizyolojik sistemler, laboratuvar ortamında insan dokularının yapısını ve işlevini taklit etmek için kullanılan minyatür hücre kültürü platformlarıdır. Bununla birlikte, bu platformlar, sıvı akış yeteneklerinden yoksun olmasına rağmen, açık kuyulu, membran tabanlı yaklaşımların doku bariyerlerini taklit etmek için altın standart olarak hizmet ettiği biyobilim laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmemiştir. Bu sorun öncelikle mevcut mikrofizyolojik sistemlerin açık kuyu sistemleri için geliştirilen standart protokoller ve araçlarla uyumsuzluğuna bağlanabilir.
Burada, açık kuyu yapısına, akış geliştirme kabiliyetine ve geleneksel protokollerle uyumluluğa sahip yeniden yapılandırılabilir membran tabanlı bir platform oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, açık kuyu ve mikroakışkan modlar arasında tersine çevrilebilir geçiş sağlayan bir manyetik montaj yaklaşımı kullanır. Bu yaklaşımla kullanıcılar, standart protokolleri kullanarak açık kuyu biçiminde bir deneye başlama ve gerektiğinde akış özellikleri ekleme veya kaldırma esnekliğine sahip olur. Bu sistemin pratik kullanımını ve standart tekniklerle uyumluluğunu göstermek için, açık kuyu formatında bir endotel hücre tek tabakası oluşturulmuştur. Sistem, sıvı akışını sağlamak için yeniden yapılandırıldı ve daha sonra immün boyama ve RNA ekstraksiyonu yapmak için açık kuyu formatına geçildi. Konvansiyonel açık kuyu protokolleri ile uyumluluğu ve akış geliştirme kabiliyeti nedeniyle, bu yeniden yapılandırılabilir tasarımın hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarları tarafından benimsenmesi beklenmektedir.

Vascular barriers serve as a critical interface that separates the blood compartment from the surrounding tissue. They play a critical role in preserving homeostasis by attracting immune cells, controlling molecular permeability, and shielding against the intrusion of pathogens into the tissue1,2. In vitro culture models have been developed to mimic the in vivo microenvironment, enabling systematic investigations into the factors and conditions that impact barrier properties in both healthy and diseased states3,4.
The most widely used approach for such culture models is the Transwell-like &#34;open-well&#34; configuration5, where a porous, track-etched culture membrane separates media-filled compartments (Figure 1A). In this format, cells can be seeded on either side of the membrane, and a wide range of experimental protocols has been developed. However, these systems are limited in their ability to provide the fluid flows essential for supporting barrier maturation and mimicking immune cell circulation seen in vivo5,6. Consequently, they cannot be used for studies requiring dynamic flows that introduce drug doses, mechanical stimulation, or fluid-induced shear stresses6,7,8.
To overcome the limitations of open-well systems, microfluidic platforms that combine porous culture membranes with individually addressable fluidic channels have been developed9. These platforms offer precise control over fluid routing, perfusion, and the introduction of chemical compounds, controlled shear stimulation, and dynamic cell addition capabilities7,10,11,12,13. Despite the advanced capabilities provided by microfluidic platforms, they have not seen widespread adoption in bioscience laboratories due to complex microfluidic protocols and their incompatibility with established experimental workflows4,10,14.
To bridge the gap between these technologies, we present a protocol that employs a magnetically reconfigurable, module-based system. This system can be easily switched between open-well and microfluidic modes based on the specific needs of the experiment. The platform features an open-well device, known as m-&#181;SiM (modular microphysiological system enabled by a silicon membrane), with a 100 nm thick culture membrane (nanomembrane). This nanomembrane possesses high porosity (15%) and glass-like transparency, as illustrated in Figure 1B. It physically separates the top compartment from a bottom channel, allowing for molecular transport across physiological length scales15. Unlike conventional track-etched membranes, which have known challenges in imaging live cells with bright-field imaging, the nanomembrane&#39;s favorable optical and physical properties enable clear visualization of cells on either side of the membrane surface15,16,17.
The present protocol outlines the fabrication of specialized seeding and flow modules and explains the magnetic reconfiguration of the platform. It demonstrates how the platform can be employed to establish endothelial barriers under both static and dynamic conditions. This demonstration reveals that endothelial cells align along the flow direction, with an upregulation of shear-sensitive gene targets under shear stimulation.

Yazar Spotlight: İnsan Bariyer Dokusunu Taklit Etmek İçin Benzersiz Bir Modüler Mikrofizyolojik Sistem Geliştirme

Statik Bariyer Doku Modellerinin Dinamik Mikrofizyolojik Sistemlere Dönüştürülmesi

We're developing modular microphysiological systems that mimic human barrier tissues. Our system is unique because it can be reconfigured from a static open well culture to a flow-enhanced system. This flexibility allows the platform to be used in both bioscience and engineering-focused laboratories.We present a protocol for creating a reconfigurable open well platform with flow-enhanced culture and lifestyle imaging. It is compatible with conventional bioscience protocols. Our reconfigurable design allows users to switch between the open well and microfluidic modes during an experiment, and allows the user to conduct each step using a format they are comfortable with.

Açık kuyu çekirdek modülü, Şekil 6A'da gösterildiği gibi, başlangıçta bir alt mahfaza ve bir lamel tarafından oluşturulan belirli bir boşluk içine yerleştirilir. Daha sonra, bir mikrokanal ve erişim portları içeren akış modülü, çekirdek modülün kuyusuna yerleştirilir. Akış modülü, Şekil 6B'de gösterildiği gibi, alt ve üst yuvalara gömülü mıknatıslar arasındaki manyetik çekim kuvveti nedeniyle membranın silikon destek ka...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing a Unique Modular Microphysiological System to Mimic Human Barrier Tissue at JoVE.com

Bu protokol, açık kuyu formatını sıvı akış yetenekleriyle bütünleştiren yeniden yapılandırılabilir bir membran tabanlı hücre kültürü platformunu açıklar. Bu platform standart protokollerle uyumludur ve hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarlarının ihtiyaçlarını karşılayarak açık kuyu ve mikroakışkan kültür modları arasında tersine çevrilebilir geçişlere izin verir.

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

İnsan bariyer dokularını taklit eden modüler mikrofizyolojik sistemler geliştiriyoruz. Sistemimiz benzersizdir çünkü statik bir açık kuyu kültüründen akışı geliştirilmiş bir sisteme yeniden yapılandırılabilir. Bu esneklik, platformun hem biyobilim hem de mühendislik odaklı laboratuvarlarda kullanılmasına olanak tanır.Akışla geliştirilmiş kültür ve yaşam tarzı görüntüleme ile yeniden yapılandırılabilir bir açık kuyu platformu oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Konvansiyonel biyobilim protokolleri ile uyumludur. Yeniden yapılandırılabilir tasarımımız, kullanıcıların bir deney sırasında açık kuyu ve mikroakışkan modlar arasında geçiş yapmasına olanak tanır ve kullanıcının her adımı rahat olduğu bir format kullanarak gerçekleştirmesine olanak tanır.

transforming-static-barrier-tissue-models-into-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

692 Görüntüleme.  Rochester Institute of Technology. İnsan bariyer dokularını taklit eden modüler mikrofizyolojik sistemler geliştiriyoruz. Sistemimiz benzersizdir çünkü statik bir açık kuyu kültüründen akışı geliştirilmiş bir sisteme yeniden yapılandırılabilir. Bu esneklik, platformun hem biyobilim hem de mühendislik odaklı laboratuvarlarda kullanılmasına olanak tanır.Akışla geliştirilmiş kültür ve yaşam tarzı görüntüleme ile yeniden yapılandırılabilir bir açık kuyu platformu oluşturmak için b...