Nous remercions le personnel de soutien de l’installation piscicole et du centre de dépistage IBCS-BIP pour son excellente assistance technique. Ces travaux ont reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 965406 (PrecisionTox). Cette production ne reflète que l’opinion des auteurs, et l’Union européenne ne peut être tenue responsable de l’utilisation qui pourrait être faite des informations qu’elles contiennent.

Tous les élevages et manipulations de poissons-zèbres ont été effectués conformément aux normes allemandes de protection des animaux et approuvés par le gouvernement du Bade-Wurtemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Allemagne (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).
1. Préparation des solutions mères des produits chimiques à tester
<ol><li>Étiquetez le flacon en verre (ou l’aliquote chimique) avec le nom ou l’abréviation du composé, la concentration du stock et la date de préparation. Par exemple, CdCl2_2,5 g· L-1_210813.</li>
	<li>Centrifuger l’aliquote chimique à 2000 x g pendant 1 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Sous une hotte, pesez le composé (si nécessaire) sur une balance sensible à 0,001 g et transférez-le dans le flacon étiqueté. Si le composé est liquide, ajoutez-le dans le flacon à l’aide d’une pipette et d’un embout de pipette en plastique. REMARQUE : Par exemple, pour le stock de méthanesulfonate de tricaïne utilisé dans l’exemple de résultat illustré à la figure 2, 400 mg ont été pesés dans le flacon étiqueté.</li>
	<li>Ajouter un solvant (p. ex., eau pure stérile ou diméthylsulfoxyde (DMSO), selon les propriétés physicochimiques des composés) à l’aide d’une pipette et d’une pointe de pipette en plastique. Si possible, l’eau est le solvant préféré. REMARQUE : Par exemple, pour le stock de tricaïne, une solution de 15,3 mM dans 100 mL d’eau a été préparée.</li>
	<li>Fermez le flacon, secouez doucement et vérifiez les précipitations.</li>
	<li>Préparer des solutions mères diluées (si nécessaire) dans des flacons en verre à l’aide de pipettes et d’embouts de pipette en plastique. NOTE : Par exemple, aucune dilution supplémentaire n’a été nécessaire pour le stock de tricaïne.</li>
	<li>Conservez la ou les solutions mères à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Stockez l’aliquote chimique restante dans les mêmes conditions qu’auparavant.</li>
	<li>Enregistrez les informations aliquotes de stock dans le cahier de laboratoire.</li>
</ol>2. Collecter et élever des embryons de poisson-zèbre
<ol><li>Prélever des embryons aux stades de clivage (stade 2-8 cellules) à partir de la ponte naturelle des accouplements de groupe dans des boîtes de culture tissulaire de 10 cm.</li>
	<li>Sélectionnez un lot de qualité appropriée : moins de 10 % d’œufs non fécondés/morts.</li>
	<li>Nettoyez la vaisselle (enlevez les œufs non fécondés, les débris, les écailles, etc.).</li>
	<li>Placer 60 embryons par boîte de culture tissulaire de 10 cm dans 15 mL de milieu E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM de MgSO4)25.</li>
	<li>Placez la vaisselle dans une chambre humidifiée préparée en disposant des serviettes en papier imbibées d’eau.</li>
	<li>Élever les embryons jusqu’à 72 hpf dans un incubateur à 28,5 °C.</li>
</ol>3. Préparation de la dilution de travail des produits chimiques à tester
<ol><li>Sortez la solution mère du congélateur à -20 °C et laissez-la décongeler.</li>
	<li>Si la solubilité du composé est suffisamment élevée, préparer des dilutions en série dans un milieu E3 dans des bouteilles en verre, 1 mL par répétition et par concentration. Assurez-vous que la concentration est 10 fois supérieure à la concentration d’exposition souhaitée. Cela évite d’avoir à changer tout le milieu des embryons au début de l’exposition. En cas de faible solubilité, préparer les dilutions en série directement aux concentrations d’exposition souhaitées, 10 mL par répétition et par concentration.</li>
	<li>Vérifiez les précipitations (si nécessaire). Si la solution a précipité, notez-la, puis diluez-la davantage pour atteindre la concentration la plus élevée suivante. Vérifiez à nouveau les précipitations. Répétez jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de précipitations.</li>
	<li>Vérifiez le pH de la solution d’exposition. Si le pH se situe en dehors de la plage de pH 7,0-8,5, notez-le et préparez les solutions dans E3 contenant 5 mM d’HEPES/pH 7,4, en ajustant le pH avec du HCl ou du NaOH.</li>
	<li>Éliminez les supports d’exposition inutilisés conformément aux réglementations locales.</li>
</ol>4. Exposition des embryons aux produits chimiques à tester
<ol><li>Vérifiez les boîtes avec les 72 embryons hpf pour les embryons morts/non éclos et retirez-les. Si un lot d’embryons contient plus de 5 % d’œufs non éclos, retirez le lot.</li>
	<li>Placer 10 embryons par boîte de culture tissulaire de 6 cm dans 9 mL de milieu E3 (plaque d’exposition).</li>
	<li>Étiquetez les plaques d’exposition avec le nom du composé, la concentration d’exposition et le numéro de répétition. Par exemple, « CdCl2 1 mg· L-1 01". Inclure suffisamment de plaques E3 seulement et une plaque de contrôle des solvants, si nécessaire (voir rubrique 5).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution d’exposition dans chaque plaque, en commençant par la concentration la plus faible, et faire tourner la plaque. Pour les composés peu solubles, remplacer les 10 mL de la plaque par la solution d’exposition (voir étape 3.2).</li>
	<li>Notez l’ordre temporel dans lequel des solutions composées ont été ajoutées aux embryons.</li>
	<li>Incuber les plaques dans la chambre humidifiée dans un incubateur à 28,5 °C pendant 48 h jusqu’à ce qu’elles atteignent 120 hpf.</li>
</ol>5. Effectuer le test de sursaut par vibration
REMARQUE : Analysez les plaques dans le même ordre que celui enregistré à l’étape 4.5. Chaque passage doit inclure une plaque de contrôle E3.
<ol><li>Allumez l’ordinateur et le dispositif de vibration (le voyant LED bleu doit être allumé).</li>
	<li>Préparez le fichier de configuration dans une feuille de calcul, comme illustré à la figure 1D et joint en tant que fichier supplémentaire 1. Enregistrer les informations d’exposition pour chacune des 5 positions de la plaque (composé, concentration, répétition).</li>
	<li>Ouvrez le programme d’interface utilisateur générale (GUI) (disponible à l’https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , ID de projet 43215.)</li>
	<li>Vérifiez le mouvement de la caméra en sélectionnant les différentes positions dans le programme de l’interface graphique et en observant le mouvement de la caméra.</li>
	<li>Sortez les plaques d’échantillons à mesurer de l’incubateur. Placez les plaques d’échantillons sur les 5 positions (voir Figure 1A, « haut-parleurs ») et laissez les embryons reposer pendant plusieurs minutes.</li>
	<li>Cliquez sur Enregistrer ; Une fenêtre s’ouvrira pour sélectionner le fichier de configuration.</li>
	<li>Sélectionnez le fichier de configuration approprié préparé à l’étape 5.2 pour cette exécution.</li>
	<li>Vérifiez que la description de l’échantillon correspond aux échantillons de chaque position (1-5).</li>
	<li>La mesure sera effectuée automatiquement (10 s / position). Lorsque l’impulsion sonore est appliquée par le programme, une LED s’allume. L’enregistrement pendant 10 s/position permet d’acquérir suffisamment de données pour estimer la vitesse de nage et la distance parcourue avant et après l’application du stimulus et empêche l’accoutumance aux stimuli ultérieurs.</li>
	<li>Une fois l’enregistrement terminé, la caméra revient à la position 1 et le logiciel commence à compresser les fichiers. Pendant ce temps, remplacez les échantillons par la prochaine série qui doit être mesurée.</li>
	<li>Passez à l’étape 5.2. pour enregistrer la prochaine exécution.</li>
	<li>Lorsque toutes les plaques ont été mesurées, prélevez les solutions d’exposition. Utilisez un tamis pour retenir les embryons.</li>
	<li>Euthanasier les embryons par refroidissement rapide dans un bain de glace/isopropanol (5%).</li>
	<li>Éliminez les solutions d’exposition et les embryons morts conformément aux réglementations locales.</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Ouvrez les données vidéo avec VirtualDub (1.10.4).</li>
	<li>Noter visuellement le nombre d’embryons répondant à l’impulsion sonore (lorsque la LED de contrôle est allumée).</li>
	<li>Saisissez les données dans une feuille de calcul. Inscrivez le nom du composé, la répétition, la concentration du composé et le pourcentage d’embryons immobiles selon le modèle fourni dans le fichier supplémentaire 2, qui comprend l’exemple d’ensemble de données présenté à la figure 2C. REMARQUE : Le modèle a une structure flexible et permet principalement l’application de données sur d’autres organismes et paramètres. Il décrit les réponses pour chaque concentration et fournit également des descriptions des paramètres ainsi que des définitions des paramètres générés dans la modélisation concentration-réponse ultérieure.</li>
	<li>Effectuez l’analyse de la concentration de référence (BMC) à l’aide d’un flux de travail KNIME (KNIME analytics 4.626) avec des scripts R intégrés (R version 3.6., R-packages plotrix, drc et bmd 27,28). NOTE : En principe, l’évaluation pourrait également être effectuée directement dans R. Cependant, pour des raisons de commodité et pour permettre l’évaluation en tant que service Web, l’analyse a été organisée dans un flux de travail conforme au serveur KNIME. Le résultat du flux de travail KNIME est fourni dans le fichier supplémentaire 3. Pour plus de détails sur les paramètres statistiques générés par le flux de travail KNIME, reportez-vous à ce modèle. Les paramètres statistiques permettant d’estimer la qualité de l’ajustement et les seuils permettant d’accepter les valeurs BMC déterminées sont indiqués dans le tableau 1. Le flux de travail KNIME lui-même est disponible via GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). La concentration-réponse est modélisée à l’aide d’un modèle log-logistique à 4 paramètres. Deux des paramètres d’ajustement de courbe peuvent être fixés. En règle générale, on fixe le maximum à 100 dans le cas des données en pourcentage. En l’absence d’effets de fond, le minimum peut être fixé à 0 %.</li>
</ol>

Essai de sursaut pour l’évaluation de la toxicité chez l’embryon de poisson-zèbre

Nous n’avons rien à divulguer.

Nous présentons le flux de travail et l’analyse des données pour l’évaluation des composés chimiques à l’aide d’une configuration d’essai de sursaut par vibration d’embryon de poisson-zèbre sur mesure. Le flux de travail génère des données robustes qui permettent de calculer des paramètres typiques spécifiant la toxicité du composé, tels que la concentration/dose de référence (BMC/BMD). La modularité de l’installation permet de s’adapter aux différents besoins en termes de débit et d’espace. Comme le système est fabriqué à partir de composants de base à faible coût, après une configuration relativement simple, il offre une alternative bon marché aux systèmes commerciaux existants, qui sont généralement conçus pour plusieurs types de tests à la fois, reposent sur des logiciels propriétaires et restent relativement coûteux.
Ces systèmes commerciaux et d’autres systèmes sur mesure permettent d’évaluer des embryons ou des larves uniques dans des plaques multipuits (p. ex.,34 à 12 puits,32 à 35 à 16 puits,20, 33, 36 à 24 puits,37 à 48 puits,38, 39, 40, 41, 42 et même 384 puits4 [comme puits 4x96]43), mais la restriction spatiale dans les puits rend plus difficile l’analyse de certains paramètres de données de la réponse d’évacuation (p. ex., la distance parcourue). De plus, dans certaines de ces configurations, l’imagerie est limitée à un sous-ensemble des puits de la plaque, ce qui réduit le débit36,39. L’imagerie des embryons dans des boîtes permet de mieux évaluer les paramètres de réponse d’échappement et d’enregistrer le comportement de plusieurs embryons à la fois (jusqu’à 30 dans une boîte de 6 cm, par exemple). Habituellement, l’imagerie en boîte est limitée à une boîte par cycle 44,45,46,47,48 (les exceptions effectuent l’imagerie en parallèle sur 6 boîtes avec une larve chacune49 ou sur 4 larves dans 2 boîtes divisées50), un inconvénient qui peut être résolu par des conceptions parallèles comme dans notre cas. Nous avons résumé certaines caractéristiques du système utilisé dans cette étude et d’autres solutions commerciales et sur mesure dans le tableau 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50, 51,52.
L’un des avantages de la méthode est une lecture capturant à la fois la létalité et les changements de comportement, ce qui peut augmenter les performances des évaluations de toxicité. Par exemple, alors qu’il a été démontré que l’essai de toxicité aiguë de l’embryon de poisson zèbre (FET)5 prédit assez bien la toxicité dans l’essai de toxicité aiguë chez le poisson adulte53 , sa précision de prédiction a été améliorée en incluant des lectures comportementales54. La raison en est la faible mortalité induite par les composés neuroactifs observés dans les embryons de poissons, probablement en raison de l’absence de syndrome d’insuffisance respiratoire provoquant une toxicité accrue chez les poissons juvéniles ou adultes. La neuroactivité peut cependant être identifiée par l’évaluation du comportement. En outre, les lectures comportementales peuvent également capturer les effets myotoxiques et ototoxiques ainsi que d’autres effets toxiques plus subtils sur la physiologie, qui sont sublétaux mais influencent les performances comportementales de l’organisme.
Lors de la réalisation de l’essai, il est essentiel de s’assurer de la manipulation appropriée des composés ainsi que de l’utilisation d’un lot d’embryons de poisson-zèbre en développement homogène. Ainsi, l’utilisation de flacons en verre pour le stockage des composés devrait minimiser la baisse des concentrations de produits chimiques, en particulier de composés hydrophobes, due à l’absorbance de la matière plastique. Dans le cas de composés à fort potentiel d’absorption du polystyrène « plastique », des plaques de verre peuvent également être utilisées pour l’incubation. Le nettoyage des ovules dans les boîtes de culture tissulaire utilisées pour le prélèvement et le prélèvement des embryons morts est une étape essentielle pour assurer le développement standard. La vitesse normale de développement est importante, car les retards de développement peuvent affecter la maturité des réseaux neuronaux sous-jacents au comportement évalué14,33. De plus, pour permettre la comparaison des effets composés, les œufs doivent provenir de la même souche car différentes souches ont été signalées comme présentant des profils comportementaux différents 38,55,56,57. Lors de l’exposition, il est important d’incuber les embryons dans une chambre humidifiée afin d’éviter une évaporation excessive du milieu E3, qui modifierait les concentrations testées.
Des témoins E3 doivent être incorporés dans chaque cycle afin de déterminer le niveau de réponse de base du lot particulier d’embryons utilisé dans la série d’essais. En règle générale, nous exécutons une plaque de contrôle le long de chaque ensemble de 5 mesures. Comme l’illustre la figure 2D, cette approche permet également de détecter des lots présentant des réponses sous-optimales en raison d’un retard de développement ou pour d’autres raisons, telles que les effets de fond génétique. En cas d’absence inattendue de réponse au stimulus, faites également attention à une défaillance potentielle du transducteur. En règle générale, les réponses de sursaut montrent un comportement concentration-réponse sigmoïdal qui permet d’ajuster la courbe à l’aide d’un modèle log-logistique. Cependant, dans de rares cas avec des réponses biphasiques, d’autres modèles peuvent devoir être utilisés, tels que les modèles gaussiens ou Cedergreen. Ils sont disponibles dans les packages R drc et bdm27,28.
L’absence de réponse au stimulus vibratoire peut indiquer simplement la mort des embryons ou une altération sévère des fonctions vitales en raison d’une cytotoxicité générale, mais peut également refléter une toxicité plus spécifique ciblant les circuits neuronaux de perception, d’intégration et de production locomotrice du stimulus. D’autres effets composés possibles sont l’interférence avec l’interface neuromusculaire ou avec la structure et la fonction musculaires. Pour distinguer ces possibilités, d’autres essais sont nécessaires. Par exemple, l’intégrité structurelle des muscles peut être évaluée avec un test de biréfringence58,59, et des lignées transgéniques sont disponibles pour évaluer la perturbation de la fonction musculaire et neuronale60,61. Cependant, les données vidéo enregistrées permettent déjà une analyse plus détaillée de la morphologie et de la réponse comportementale des embryons qui peut fournir des informations supplémentaires dans un premier temps. Seule la courbure en C est-elle altérée, ou toute motilité ? Y a-t-il encore des restes d’activité neuromusculaire, comme l’indiquent des mouvements de queue faibles ou tremblants ? Ces comportements modifiés s’accompagnent-ils de changements morphologiques, tels qu’un œdème ou une courbure accrue du corps ? De plus, des paramètres tels que le temps de latence jusqu’au coude en C ou la distance parcourue pendant la réponse d’échappement peuvent être évalués (voir, par exemple, Réf. 44).
Le protocole de dépistage décrit ici permet des évaluations rapides et robustes de la toxicité des composés, avec la valeur ajoutée de détecter spécifiquement les composés neurotoxiques, ototoxiques et myotoxiques non létaux. Le flux d’analyse fourni est facile à mettre en œuvre et fournit une lecture robuste. Des modifications des protocoles de stimulus utilisés dans l’essai de sursaut par vibration ont également été utilisées pour traiter les effets composés sur des aspects plus complexes du comportement de sursaut, tels que l’inhibition pré-impulsionnelle (IPP)39,44 et l’habituation32,33, et pourraient être adaptées à la configuration de stimulus basée sur un transducteur électrodynamique utilisée dans cette étude.
L’une des principales applications des systèmes de criblage basés sur la réponse au sursaut est l’évaluation des effets des composés dans les criblages chimiques, ce qui est pertinent à la fois pour l’évaluation de la toxicité humaine et le développement de médicaments 1,4,62. Dans le même temps, en testant les premiers stades de vie d’un organisme aquatique, les résultats obtenus ont un rapport direct pour l’évaluation des risques écotoxicologiques63,64. De plus, les systèmes de réponse de sursaut peuvent être utilisés pour le phénotypage comportemental dans les cribles génétiques 65,66,67,68,69. Notre système facile à mettre en œuvre et adaptable offre une configuration abordable aux petits laboratoires qui ont l’intention de mener leurs propres projets de criblage spécifiques dans ces différents domaines d’application.

Ces dernières années, le poisson-zèbre est devenu un organisme modèle très populaire pour l’évaluation des effets des composés chimiques, englobant des domaines de recherche allant du développement de médicaments à la toxicologie environnementale1. En tant que vertébrés, les poissons-zèbres partagent de nombreux aspects de leur constitution génétique et de leur physiologie globale avec les humains 2,3. Par conséquent, les résultats obtenus dans ce modèle sont souvent directement pertinents pour la santé humaine. Plusieurs candidats médicaments actuellement en essais cliniques ont été identifiés dans des cribles composés utilisant le poisson-zèbre4.
L’évaluation de la toxicité est une application majeure où les essais utilisant les stades embryonnaires du poisson-zèbre sont intéressants. Il existe diverses lignes directrices de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) pour l’utilisation du poisson-zèbre dans les essais de toxicité environnementale 5,6. La petite taille et le développement rapide des embryons de poisson-zèbre les rendent très adaptés aux approches de criblage à une échelle de débit moyen à élevé 1,3,4. Les paramètres toxicologiques ciblés par ces criblages comprennent les malformations embryonnaires et la létalité7, la perturbation endocrinienne8, la toxicité pour les organes9 et les évaluations comportementales indiquant une toxicité neuronale10,11. Les tests comportementaux sont possibles parce que les embryons de poisson-zèbre présentent différents types de réponses locomotrices à différents stimuli en fonction de leur stade de développement. Par exemple, les embryons 1 jour après la fécondation (dpf) présentent un enroulement spontané de la queue12 et répondent à une séquence d’impulsions lumineuses par une séquence typique de mouvements, appelée réponse photomotrice (PMR)10. Après l’éclosion, qui se produit généralement environ 48 à 72 heures après la fécondation (hpf), les éleuthéroembryons13 nageant librement développent progressivement des réponses de sursaut et d’échappement aux stimuli vibratoires à partir d’environ 4 dpf14. Ces réponses sont caractérisées par une courbure distinctive dans la direction opposée à la direction du stimulus (appelée courbure en C ou C), qui est suivie d’une contre-courbure plus petite et d’un comportement de nage 14,15,16,17. Notamment, les comportements embryonnaires sont régis par des circuits neuronaux utilisant divers systèmes de neurotransmetteurs, ce qui permet de sonder les effets des composés chimiques ciblant ces systèmes. Par exemple, le test PMR a révélé les effets des composés interférant avec la signalisation cholinergique, adrénergique et dopaminergique10, tandis que la réponse de sursaut implique les neurones cholinergiques, glutamatergiques et glycinergiques 16,18. De plus, les composés qui endommagent les muscles ou l’interface neuro-musculaire affecteront également ces comportements, tout comme les composés toxiques pour les cellules ciliées de l’oreille interne et de la ligne latérale19,20. L’observation du comportement locomoteur du poisson-zèbre en réponse à un stimulus est donc un moyen approprié pour évaluer non seulement la neurotoxicité, mais également l’ototoxicité et la myotoxicité. L’évaluation du comportement locomoteur sert également d’indicateur pour l’évaluation générale de la toxicité/létalité puisque les embryons morts ne bougent pas. Ainsi, les comportements de locomotion embryonnaire représentent une lecture intégrative pour une approche de dépistage de la toxicité de premier niveau, qui indique les effets des composés létaux et neuromusculaires dans une seule configuration. Étant donné que les éleuthéroembryons sont déjà capables de métaboliser des composés, l’approche peut également détecter les effets des produits de transformation métabolique 7,21,22. Il est important de noter que les embryons de poisson-zèbre ne sont pas considérés comme des stades de vie protégés en vertu de certaines législations sur la protection des animaux jusqu’au stade de l’alimentation libre après 120 hpf13. Par conséquent, ils sont considérés comme une alternative aux tests de toxicité sur les animaux.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg"> Figure 1 : Configuration du système de réponse au sursaut par vibration. (A) Présentation du système. Des plaques contenant des embryons exposés aux composés testés sont placées sur le réseau de transducteurs électrodynamiques (« haut-parleurs »). La caméra est déplacée séquentiellement par l’entraînement linéaire par courroie dans la position d’enregistrement au-dessus du transducteur ciblé. (B) Vue détaillée du transducteur/haut-parleur avec une boîte de culture tissulaire insérée sur le dessus. Les plaques sont éclairées par le bas par une feuille lumineuse LED à 4000-5000 lux. Une lumière LED à côté du haut-parleur s’allume pendant que le stimulus est donné. (C) Image fixe de la vidéo enregistrée par la caméra lors de la stimulation des embryons. (D) Capture d’écran du fichier de configuration. (E) Capture d’écran de l’interface du logiciel d’enregistrement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Ici, nous décrivons un protocole de test pour l’évaluation des effets composés sur la réponse de sursaut par vibration à l’aide d’un dispositif de test simple construit en interne basé sur des stimuli vibratoires générés par des transducteurs électrodynamiques couplés à un enregistrement vidéo automatisé de plusieurs embryons en mouvement libre dans une boîte de culture tissulaire23. Le système est modulaire et permet un enregistrement séquentiel à partir de plusieurs boîtes de culture tissulaire en parallèle. Dans la configuration actuellement utilisée, cinq transducteurs électrodynamiques fournissent un stimulus vibratoire (500 Hz, durée 1 ms) à des boîtes de culture tissulaire contenant 20 embryons placés dessus (Figure 1). Les plaques sont éclairées par le bas à 4000-5000 lux avec des feuilles lumineuses LED. Une lumière LED à côté de chaque transducteur indique les périodes d’application du stimulus, et un oscilloscope indique les formes d’onde et la fréquence du stimulus appliqué (pour plus de détails, voir Réf. 23). Le comportement des embryons est enregistré par une caméra à grande vitesse (Table of Materials) à 1000 images par seconde (fps), qui est déplacée au-dessus du haut-parleur ciblé par un entraînement linéaire par courroie. Cette vitesse d’enregistrement est nécessaire pour résoudre de manière fiable la réponse de sursaut. Le système offre une alternative peu coûteuse et adaptable individuellement aux systèmes commerciaux actuels. Le flux de travail précis détaillé ci-dessous est actuellement effectué dans le cadre de l’initiative Precision Toxicology24 afin de déterminer les conditions d’exposition appropriées pour l’acquisition de données OMICS à partir d’embryons de poisson-zèbre traités avec un ensemble sélectionné de toxiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 &#956;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z289744-1EA</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed camera</td>
			<td>XIMEA</td>
			<td>&#160;MQ013MG-ON USB 3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>215-3261</td>
			<td>Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 10 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3010.210</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 1000 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3050.100</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 20 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3020.210</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 200 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3030.100</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene)</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3902.500</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 6 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1175</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.5472.54</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system

Nous avons développé un système de dépistage simple pour l’évaluation de la toxicité neuromusculaire et générale chez les embryons de poisson-zèbre. Le système modulaire se compose de transducteurs électrodynamiques au-dessus desquels des boîtes de culture tissulaire contenant des embryons peuvent être placées. Plusieurs paires de boîtes de culture haut-parleur-tissu peuvent être combinées. Les stimuli vibratoires générés par les transducteurs électrodynamiques induisent une réaction de sursaut et d’échappement caractéristique chez les embryons. Un entraînement linéaire par courroie positionne séquentiellement une caméra au-dessus de chaque haut-parleur pour enregistrer le mouvement des embryons. De cette façon, les altérations de la réponse de sursaut dues à la létalité ou à la toxicité neuromusculaire des composés chimiques peuvent être visualisées et quantifiées. Nous présentons un exemple de flux de travail pour le criblage des composés chimiques à l’aide de ce système, y compris la préparation des embryons et des solutions de traitement, le fonctionnement du système d’enregistrement et l’analyse des données pour calculer les valeurs de concentration de référence des composés actifs dans l’essai. L’assemblage modulaire basé sur des composants simples disponibles dans le commerce rend ce système à la fois économique et adaptable de manière flexible aux besoins de certaines installations de laboratoire et à des fins de dépistage.

In recent years, zebrafish have become highly popular model organisms for the evaluation of chemical compound effects, encompassing research areas from drug development to environmental toxicology1. As vertebrates, zebrafish share many aspects of their genetic makeup and overall physiology with humans2,3. Therefore, results obtained in this model often are directly relevant to human health. Several drug candidates currently in clinical trials have been identified in compound screens using zebrafish4.
Toxicity assessment is one major application where tests using zebrafish embryonic stages are of interest. Various Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guidelines exist for the use of zebrafish in environmental toxicity testing5,6. The small size and rapid development of zebrafish embryos make them highly suitable for screening approaches on a medium to high throughput scale1,3,4. Toxicological endpoints targeted by such screens include embryonic malformations and lethality7, endocrine disruption8, organ toxicity9, and behavioral assessments indicative of neural toxicity10,11. The behavioral assays are possible because zebrafish embryos show various types of locomotor responses to different stimuli depending on their stage of development. For example, 1 day post fertilization (dpf) embryos show spontaneous tail coiling12 and respond to a sequence of light pulses with a typical sequence of movements, the so-called photomotor response (PMR)10. After hatching, typically occurring around 48-72 hours post fertilization (hpf), the freely swimming eleutheroembryos13 gradually develop startle and escape responses to vibrational stimuli starting around 4 dpf14. These responses are characterized by a distinctive bend to the direction opposite the direction of the stimulus (the so-called C-bend or C-start), which is followed by a smaller counter bend and swimming behavior14,15,16,17. Notably, embryonic behaviors are governed by neural circuits using various neurotransmitter systems, allowing for probing chemical compound effects targeting these systems. For example, the PMR assay revealed the effects of compounds interfering with cholinergic, adrenergic, and dopaminergic signaling10, while the startle response involves cholinergic, glutamatergic, and glycinergic neurons16,18. Furthermore, compounds that damage the muscles or the neuro-muscular interface will also affect these behaviors, as will compounds toxic to the inner ear/lateral line hair cells19,20. Observing zebrafish locomotor behavior in response to a stimulus is thus a suitable means to assess not only neurotoxicity but equally ototoxicity and myotoxicity. Scoring locomotor behavior also serves as a proxy for general toxicity/lethality assessment since dead embryos do not move. Thereby, embryonic locomotion behaviors represent an integrative readout for a first-tier toxicity screening approach, which indicates lethal and neuromuscular compound effects in one setup. Given that the eleutheroembryos are already capable of metabolizing compounds, the approach may also detect the effects of metabolic transformation products7,21,22. Importantly, zebrafish embryos are not considered as protected life stage under some animal protection legislations until the stage of free feeding after 120 hpf13. Therefore, they are regarded as an alternative to animal toxicity testing.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg" /> 
Figure 1: Vibration startle response system setup. (A) Overview of the system. Plates with embryos exposed to the test compounds are placed on the electrodynamic transducer array (&#34;loudspeakers&#34;). The camera is sequentially moved by the belt-driven linear drive into the recording position above the targeted transducer. (B) Detailed view of the transducer/loudspeaker with tissue culture dish inserted on top. The plates are illuminated from below by an LED light sheet at 4000-5000 lux. An LED light next to the speaker lights up while the stimulus is given. (C) Still image of video recorded by the camera upon stimulation of the embryos. (D) Screenshot of the configuration file. (E) Screenshot of the recording software interface. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Here, we describe a testing protocol for the evaluation of compound effects on the vibration startle response using an in-house build simple testing device based on vibration stimuli generated by electrodynamic transducers coupled with an automated video recording of several freely moving embryos in a tissue culture dish23. The system is modular and allows for sequential recording from several tissue culture dishes in parallel. In the setup currently used, five electrodynamic transducers provide a vibrational stimulus (500 Hz, duration 1 ms) to tissue culture dishes containing 20 embryos placed on top of them (Figure 1). The plates are illuminated from below at 4000-5000 lux with LED light sheets. An LED light next to each transducer indicates periods of stimulus application, and an oscilloscope indicates waveforms and frequency of the applied stimulus (for details, see Ref. 23). The behavior of the embryos is recorded by a high-speed camera (Table of Materials) at 1000 frames per second (fps), which is moved above the targeted speaker by a belt-driven linear drive. This recording speed is required to reliably resolve the startle response. The system provides a low-cost, individually adaptable alternative to current commercial systems. The precise workflow detailed below is currently performed in the framework of the Precision Toxicology initiative24 in order to determine suitable exposure conditions for OMICS data acquisition from zebrafish embryos treated with a selected set of toxicants.

Pleins feux sur l’auteur : Dépistage de la toxicité à haut débit à l’aide d’un essai de réponse au sursaut de l’embryon de poisson-zèbre

Évaluation de la toxicité des produits chimiques à l’aide d’un système de criblage de réaction au sursaut par vibration du poisson-zèbre

When screening chemicals for toxicity, a current experimental challenge is the determination of toxic effects in vivo, taking into account the complexity of a whole organism, and to do this in a rapid high-throughput manner. By using a behavioral readout that monitors the escape response of zebrafish embryos to a vibration stimulus, our system allows us to identify compounds that interfere with neural or muscular function. Because dead embryos don't move, we also capture compounds that cause lethality by unspecific toxicity.The system we present can be built for a modest price and is customizable. It is also easy to maintain and all pieces can be replaced. We are currently employing the startle assay system within the PrecisionTox Consortium to determine a chemical compound dose for OMICS data acquisition.The data are generated across five model organisms and human cell lines. They will be used to derive toxicity pathways and biomarkers for human toxicity prediction.

La figure 2A montre le pourcentage d’embryons immobiles dans 48 couvées d’embryons de type sauvage non traités (souche AB2O2). En moyenne, 14,33 % des embryons de type sauvage non traités ne réagissent pas au stimulus vibratoire. Dans 4 couvées, le pourcentage de larves immobiles a atteint 50 %, mais 75 % des couvées avaient un pourcentage de larves immobiles inférieur à 20 %.
Les figures 2B,C montrent un exemple de calcul typique d’une concentration/dose de référence (BMC/BMD29,30) pour les effets des composés sur la motilité avec le flux de travail du test de sursaut vibratoire, tel qu’il est actuellement effectué au sein du consortium PrecisionTox24. Les valeurs BMC10, BMC25 et BMC50 correspondent aux concentrations auxquelles 10 %, 25 % et 50 % des embryons présentent des niveaux d’immotilité supérieurs au niveau de fond, respectivement. Seuls les embryons complètement immobiles sont inclus dans ce calcul, et non ceux qui présentent encore des réponses partielles, comme seulement une courbure en C sans nage d’échappement ultérieure ou seulement des mouvements de queue (Figure 2B). Les embryons ont été exposés à 8 concentrations de l’inhibiteur des canaux sodiques, le méthanesulfonate de tricaïne, qui est fréquemment utilisé pour l’anesthésie des poissons31. Les données indiquent un niveau de fond d’environ 25 % d’immotilité en réponse au stimulus vibratoire. À partir de 1 % de tricaïne, la motilité est réduite puis cesse au-dessus de 2,5 %. Le flux de travail KNIME calcule le BMC50 à 164,9 μM, ce qui correspond à 1,07 % de tricaïne et à un niveau d’immotilité de 75 % (Figure 2C). Les petits intervalles de confiance à 95 % (indiqués par les nuances de gris dans la courbe) indiquent une reproductibilité robuste des valeurs de motilité dans ce test.
La figure 2D montre un exemple d’essai sous-optimal, dont les données ne doivent pas être utilisées pour les calculs BMC. Cinq groupes témoins traités à l’E3 avec des embryons différents dérivés de la même couvée sont présentés (réplic. AB2O2 [souche de type sauvage] répliquée 1-5). Seul le premier groupe présente une réponse proche de la normale, montrant une immotilité d’environ 25 % qui est cohérente avec les valeurs publiées32 et celles obtenues dans le test décrit ici, comme le montre la figure 2A, tandis que tous les autres groupes présentent des réponses comportementales réduites et/ou incomplètes (par exemple, montrant seulement une courbure en C non suivie d’une activité de natation, ou une motilité sans courbure en C claire au début). Une telle réponse peut se produire lorsque les embryons ne se développent pas correctement et sont dans un état immature en raison d’un retard de développement, ce qui a un impact sur la robustesse de la réponse de sursaut14,33.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig02v2.jpg"> Figure 2 : Exemple de résultat typique, y compris le calcul de la dose de référence. (A) Pourcentage d’embryons non réactifs après l’impulsion sonore pour les larves de type sauvage non traitées pour 48 couvées (n = 10 par couvée). La moyenne (14,33 %) et l’écart-type (±16,19 %) sont indiqués en rouge. (B) Évaluation du comportement de réponse au sursaut des embryons (n = 20 par condition) traités avec la concentration indiquée de tricaïne dans le milieu E3 ou avec E3 seul comme témoin. Le comportement est classé selon le schéma de couleurs et les dessins animés indiqués à droite du graphique, chaque embryon étant affecté à une seule des classes suivantes : « immotile » : l’embryon ne montre aucun mouvement ; « mouvement de la queue » : l’embryon montre un mouvement de la queue, mais pas de courbure en C ni de comportement de nage ; « motile » : l’embryon montre un mouvement de nage, mais pas de courbure en C en réponse au stimulus vibratoire ; « C-bend only » : l’embryon présente une courbure en C, mais n’échappe pas à la nage ; « C-bend + motile » : l’embryon présente un comportement typique de courbure en C suivi d’une nage d’évasion (la réponse typique de sursaut complet). Les différents comportements sont indiqués en pourcentage du nombre total d’embryons pour chaque traitement. (C) Graphique de calcul BMC généré par le flux de travail KNIME, indiquant le pourcentage d’embryons « immobiles » pour chaque concentration de traitement. Les lignes bleues, rouges et noires indiquent les valeurs BMC10, BMC25 et BMC50, c’est-à-dire les concentrations auxquelles 10 %, 25 % et 50 % des embryons présentent des niveaux d’immotilité supérieurs au niveau de fond, respectivement. (D) Exemple d’un cycle d’essai rejeté. Cinq essais témoins traités à l’E3 avec différents embryons AB2O2 de type sauvage dérivés de la même couvée sont présentés (répétitions 1 à 5). Seule la répétition 1 montre une réponse presque normale, tandis que les embryons des autres montaisons ne présentent pas la réponse typique de courbure en C + nage d’évasion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Paramètres statistiques pour estimer la qualité de l’ajustement et seuils pour accepter les valeurs BMC déterminées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Propriétés d’une sélection de systèmes d’essai de réponse au sursaut vibratoire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%202.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Modèle Excel pour le fichier de configuration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : Modèle d’entrée KNIME avec un exemple d’ensemble de données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 3 : Exemple de fichier de sortie KNIME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System at JoVE.com

Nous décrivons le flux de travail et l’analyse des données d’un système de criblage pour évaluer la toxicité des composés chimiques en fonction de la réponse au sursaut par vibration de l’embryon de poisson-zèbre. Le système enregistre les mouvements des embryons de poisson-zèbre lorsqu’ils sont exposés à un stimulus vibratoire et permet une évaluation intégrée de la toxicité/létalité générale et de la toxicité neuromusculaire.

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

Lors de l’évaluation de la toxicité des produits chimiques, un défi expérimental actuel consiste à déterminer les effets toxiques in vivo, en tenant compte de la complexité d’un organisme entier, et à le faire de manière rapide et à haut débit. En utilisant une lecture comportementale qui surveille la réponse de fuite des embryons de poisson-zèbre à un stimulus vibratoire, notre système nous permet d’identifier les composés qui interfèrent avec la fonction neuronale ou musculaire. Parce que les embryons morts ne bougent pas, nous capturons également les composés qui causent la létalité par toxicité non spécifique.Le système que nous présentons peut être construit pour un prix modique et est personnalisable. Il est également facile à entretenir et toutes les pièces peuvent être remplacées. Nous utilisons actuellement le système de test de sursaut au sein du consortium PrecisionTox pour déterminer une dose de composé chimique pour l’acquisition de données OMICS.Les données sont générées à travers cinq organismes modèles et lignées cellulaires humaines. Ils seront utilisés pour dériver des voies de toxicité et des biomarqueurs pour la prévision de la toxicité humaine.

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Research

JoVE Journal

Biology

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

799 vues.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord. Lors de l’évaluation de la toxicité des produits chimiques, un défi expérimental actuel consiste à déterminer les effets toxiques in vivo, en tenant compte de la complexité d’un organisme entier, et à le faire de manière rapide et à haut débit. En utilisant une lecture comportementale qui surveille la réponse de fuite des embryons de poisson-zèbre à un stimulus vibratoire, notre système nous permet d’identifier les composés qui interfèrent avec la fonction neuronale ou ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Dépistage de la toxicité à haut débit à l’aide d’un essai de réponse au sursaut de l’embryon de poisson-zèbre

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

Recherche

Biologie

Preparation of Zebrafish Embryos and Chemicals for Testing Neuromuscular and General Toxicity on Embryos

Préparation d’embryons de poisson-zèbre et de produits chimiques pour tester la toxicité neuromusculaire et générale sur les embryons

Evaluating Lethality and Neuromuscular Toxicity of Chemicals in Zebrafish Embryos Using Vibration Startle Assay

Évaluation de la létalité et de la toxicité neuromusculaire des produits chimiques chez les embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un test de sursaut par vibration