Ce travail a été soutenu par une «subvention à l&#39;aide de la recherche» de la maladie de Crohn et la colite Fondation du Canada pour LMS, qui est soutenu par une Association canadienne de gastroentérologie / Association canadienne de la Santé s de recherche / maladie de Crohn et la colite Fondation des Prix du Canada de nouveau chercheur.

1. Les macrophages appauvrissant la couche d&#39;Utilisation clodronate liposomes contenant <ol><li> Les liposomes sont conservés à 4 ° C. Deux heures avant l&#39;injection, retirez le clodronate contenant des liposomes, PBS contenant des liposomes, ou PBS stérile (commande d&#39;injection) du réfrigérateur afin de leur permettre de s&#39;acclimater à la température ambiante (18 ° C). </li><li> Inverser les tubes contenant des liposomes 8-10 fois pour assurer une répartition avant même de charger 200 pi dans une seringue de 1 ml. Fixer une aiguille de calibre 26 vers le haut de la seringue. </li><li> En utilisant votre main gauche, nuque la souris juste au-dessous des oreilles détenant assez de peau pour immobiliser la tête et des membres. </li><li> Inclinez la souris de façon à sa tête est légèrement vers le sol afin organes internes s&#39;éloigner du site d&#39;injection, qui est situé dans le quadrant inférieur droit de l&#39;abdomen. </li><li> Rouler la seringue entre les paumes de vos mains et la retourner 6 fois pour répartir uniformément la solution de liposomes avant l&#39;injection. </li> &lt;li&gt; Insérer l&#39;aiguille dans la partie inférieure droite de l&#39;abdomen de la souris à un angle de 30-40. Injecter 200 ul de solution de liposomes ou de PBS. </li><li> Au cours d&#39;une inflammation induite par le modèle, comme la colite induite par DSS, injecter souris 4 jours précédant l&#39;apparition de l&#39;inflammation expérimentale pour assurer l&#39;épuisement des macrophages résidents et tous les 2 jours pendant le protocole d&#39;épuiser nouveaux macrophages infiltrant. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, ainsi que des analyses expérimentales prévues, éliminer les tissus à partir du site d&#39;intérêt et fixer avec du paraformaldéhyde pour confirmer l&#39;épuisement des macrophages par coloration immunohistochimique. </li></ol> 2. Dérivation des macrophages polarisés de ponctions de moelle osseuse <ol><li> La moelle osseuse de souris entre 8 et 12 semaines d&#39;âge fournit le plus haut rendement de la moelle osseuse macrophages dérivés. Euthanasier la souris, posez-le sur le dos, et cerner ses pattes, étirant ses membres autant que possible. </li><li> Travailler dans un stérile hood, enlever les fémurs et les tibias, coupant le muscle autant que possible. </li><li> La moelle des os en utilisant Flush IMDM avec 10% FCS chargé dans une seringue de 5 ml munie d&#39;une aiguille de calibre 26. </li><li> Diluer la moelle osseuse aspire à 40 ml en IMDM avec 10% de FCS, les cellules de lieu dans un flacon de 75 cm2 de culture tissulaire, et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 4 heures. Cette étape supprime adhérentes des cellules mésenchymateuses ou des macrophages matures à partir de progéniteurs hématopoïétiques. </li><li> Surnageant de culture contenant de transfert non-adhérentes progéniteurs dans un tube conique de 50 ml Falcon et centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm. </li><li> Resuspendre culot cellulaire dans 5 ml IMDM, 10% de SVF et de compter les cellules nucléées en diluant 1 suspension cellulaire dans 20 dans l&#39;acide acétique. Cette procédure lyse toutes les cellules dont les globules rouges et les noyaux restants peuvent être comptées sur un hématimètre. </li><li> Resuspendre les cellules à une concentration de 0,5 × 10 6 cellules / ml dans un milieu complet; IMDM, 10% de FCS, 150 monothioglycérol uM (MTG), et 10 ng / ml soit MCSF, GM-CSF, ou de l&#39;IL-3. MCSF macrophages dérivés sont classiquement macrophages activés alors que les macrophages GM-CSF ou IL-3-dérivés sont alternativement activés. </li><li> Remplacer moyenne au 4 e jour, la filature par les cellules non adhérentes et de les retourner dans le ballon, et à 7 jours, en rejetant les cellules non adhérentes. </li><li> En outre, l&#39;IFNy (10 ng / ml) ou de l&#39;IL-4 (10 ng / ml) peuvent être ajoutés à des flacons contenant des cellules dérivées de MCSF au jour 7 de macrophages fausser à un. Classique activé ou d&#39;un phénotype encore activé, respectivement Incuber les cellules pendant 3 jours de plus. </li><li> Au jour 10, retirer le support et soulevez les cellules hors du flacon de culture tissulaire en utilisant la dissociation cellulaire tampon (Gibco-BRL). Placer 5 ml de tampon sur les cellules pendant 5 min à température ambiante (18 ° C) puis taper le côté du ballon avec le talon de la paume fermement plusieurs fois. Faire en sorte que les cellules ont soulevé du flacon en examinant le ballon sous uneMicroscope. Pipeter remis en suspension les cellules dans un tube de 15 ml conique Falcon et laver la fiole avec un supplément de 10 ml de IMDM, 10% de FBS. Piscine et centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 × g. </li><li> Compter les cellules viables au moyen d&#39;un hémocytomètre et remettre en suspension à une concentration de 10 7 cellules / ml dans du PBS stérile pH 7,4. Les macrophages sont prêtes pour l&#39;injection à des souris. </li><li> Réserve 1,0 × 10 6 macrophages pour l&#39;évaluation du phénotype des macrophages. Macrophages activés Classiquement stimulées par les niveaux élevés de lipopolysaccharide sécrètent de l&#39;oxyde nitrique et les niveaux d&#39;IL-12p70 et basse de l&#39;IL-10 par rapport aux macrophages activés alternativement. Macrophages activés alternativement expriment constitutivement YM1 et l&#39;arginase I (Argi), qui peut être détecté par Western immunoblot. </li></ol> 3. Tranferring macrophages à des souris <ol><li> Remettre en suspension dans les macrophages du PBS stérile à une concentration de 10 7 cellules / ml. Cela permet pour un end&#39;injection intraveineux de 10 6 macrophages dans un volume total de 100 pi, ce qui est un volume qui peut être en toute sécurité et confortablement injectées à des souris par la veine de la queue. </li><li> Souris chaude avec un coussin chauffant ou sur les genoux de la chaleur pendant 5-10 min pour dilater la veine de la queue. Surveiller la souris en tout temps pour des signes d&#39;hyperthermie. </li><li> Transfert de la souris à un dispositif de retenue qui permet d&#39;accéder aux veines de la queue. </li><li> Tournez la queue 90 ° de sorte que la veine est orientée vers le haut. Les veines de fonctionner latéralement vers le bas des deux côtés de la queue et soit la veine peut être utilisé. </li><li> Nettoyer le site d&#39;injection avec un tampon imbibé d&#39;alcool et lentement, injecter 100 ml (10 6 macrophages) en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 26 ou 28. Insérez l&#39;aiguille avec le côté conique vers le haut et à un léger angle, presque parallèle à la veine. </li><li> Si l&#39;aiguille est insérée correctement aucune résistance devrait se faire sentir et la veine devrait devenir claire après l&#39;injection. Si l&#39;aiguille n&#39;est pas dans laveine, la queue sera renflement. Si cela se produit, retirez l&#39;aiguille et essayez à nouveau à proximité de la dernière tentative ou dans la veine des autres. Une nouvelle aiguille doit être utilisée pour chaque injection, la queue est dure et les aiguilles deviennent ternes rapidement lors de l&#39;injection veine de la queue. </li><li> Après l&#39;injection, retirez l&#39;aiguille, appliquer une légère pression au site d&#39;injection jusqu&#39;à ce que le saignement s&#39;arrête, et de surveiller la souris pour un 5min supplémentaires pour veiller à ce que le saignement a cessé. </li><li> Répéter les injections macrophages tous les 4 jours pour assurer une livraison continue des macrophages polarisés au cours de la procédure expérimentale. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, ainsi que des analyses expérimentales, éliminer les tissus à partir du site d&#39;intérêt et fixer avec du paraformaldéhyde ou de formol pour confirmer la livraison effective des macrophages polarisés par coloration immunohistochimique. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le nombre et le phénotype des macrop résidentHages dans n&#39;importe quel tissu donné dépend sur le tissu en cours d&#39;examen et va changer lors de l&#39;infection ou l&#39;inflammation. De même, la capacité du clodronate liposomes contenant d&#39;épuiser les macrophages à partir d&#39;un tissu dépendra de la voie d&#39;administration et la prestation efficace du tissu cible. L&#39;injection intrapéritonéale des résultats des liposomes contenant du clodronate à une diminution de F4/80 + macrophages dans le côlon de la souris pendant DSS-colite induite en évidence par la coloration immunohistochimique pour le marqueur des macrophages, F4/80 (figure 1A). Coloration histologique peut également être utilisé pour déterminer les différences quantitatives en nombre des macrophages et du phénotype dans des coupes de tissus. Figure 1B montre qu&#39;en moyenne 55% des macrophages est appauvri par le clodronate liposomes contenant par rapport à aucun épuisement détecté dans deux points de la souris lorsque les souris sont injectées avec PBS seul comme un contrôle de l&#39;injection. Chaque valeur est déterminée par comptage F4/80 et Argi tachecellules éd positifs dans des coupes de tissus de série à partir de 6 souris à 3 points, en 3 sections par la souris avec comptage étant effectué par deux individus aveuglés à l&#39;état expérimental. Ces résultats démontrent que les injections intra-péritonéales de liposomes clodronate épuiser les macrophages du côlon chez des souris. Dérivation des macrophages de la moelle osseuse en présence de facteurs de croissance différents des macrophages rendements qui sont classiquement activés (MCSF-dérivé ou MCSF dérivé et traitée avec IFNy) ou encore activé (GM-CSF ou IL-3-dérivé ou MCSF dérivés et traitée avec de l&#39;IL-4). Flushing moelle osseuse à partir de 2 fémurs et tibias 2 à partir d&#39;une souris de 8 semaines donne généralement de 6 × 10 7 cellules nucléées par la souris et les rendements de 8 × 10 6 MCSF macrophages dérivés, 10 × 10 6 GM-CSF macrophages dérivés, ou 12 × 10 6 IL-3-macrophages dérivés. La figure 2A montre le nitrite et le rapport IL-12p70/IL-10 dans les macrophages supernatants traitée avec un lipopolysaccharide pendant 24 heures la figure 2B montre une analyse par transfert de type Western de 0,5 × 10 6 macrophages de MCSF + / -. IL-4 conditions de dérivation sondé avec des anticorps pour les marqueurs des macrophages activés, alternativement, des Argi YM1, ou avec la GAPDH comme un le chargement de contrôle. Ces données démontrent que la moelle osseuse macrophages dérivés peuvent être faussés à un phénotype polarisé au cours de dérivation. Un transfert effectif de ex vivo des macrophages dérivés polarisées à un tissu dépend de la voie d&#39;administration et l&#39;accès à du tissu. Au cours de DSS-colite induite par les macrophages injecté par voie intraveineuse se rendre sur le site de l&#39;inflammation et les macrophages alternativement activés réduire la sévérité de la maladie. Figure 3A montre le nombre total des macrophages et le nombre de macrophages Argi + (alternativement activé) comptés dans les coupes histologiques de souris injectées avec des polarisée moelle osseuseDérivé des macrophages. L&#39;impact du transfert des macrophages polarisés au niveau du côlon au cours DSS-colite induite est représenté par l&#39;indice activité de la maladie, un score additif à base de la perte de poids, saignements rectaux, et la consistance des selles a diminué (figure 3B). Ces résultats démontrent que ex vivo dérivés, les macrophages adoptive transférés peuvent le trafic au niveau du côlon et de l&#39;inflammation induite par l&#39;impact. Macrophages M1 n&#39;ont pas d&#39;impact alors que l&#39;inflammation des macrophages M2 réduire de façon significative l&#39;indice d&#39;activité de la maladie. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Le clodronate liposomes contenant effectivement épuiser F4/80 + et + F480 + Argi cellules dans deux points de souris in vivo. Une génération F2 de souris de type sauvage sur une souris C57BL mixte / 6 × fond 129SV ont été donnés DSS 5% pendant 7 jours et IP injecté avec du PBS (contrôle) ou le clodronate liposomes contenant (clodronate) 4 jours avant le traitement au MASet aux jours 0, 2, 4, et 6 au cours du traitement DSS. (A) Colons ont été enlevés, fixé, et les articles ont été colorées par immunohistochimie pour les macrophages matures (F4/80) et le marqueur des macrophages M2, Argi. (B) La quantification de F4/80 + et + de Argi macrophages. Cellules colorées positivement ont été comptés par deux individus aveuglés à l&#39;état expérimental à un grossissement de 40 × 6 dans les champs à partir de 3 sections / souris et à partir de 6 souris par groupe. * P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. MCSF macrophages dérivés exprimer un phénotype classique activé et MCSF macrophages dérivés traités avec de l&#39;IL-4 exprimer un phénotype des macrophages activés alternativement. (A) Conformément à un phénotype classique activé, MCSF macrophages dérivés de produire des niveaux plus élevés d&#39;oxyde nitrique en réponse aux lipopolysaccharides et peut être mesurée par le dosage de Griess, qui détecte son aval métabolite, le nitrite. Ils also produire un rapport plus élevé IL-12p70/IL-10, qui peut être mesurée par la méthode ELISA. * P &lt;0,01 pour n = 3. (B) Conformément à un phénotype alternativement activée, MCSF macrophages dérivés traités avec de l&#39;IL-4 YM1 expriment constitutivement et Argi, qui peut être détectée par immuno-Ouest. Les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes avec des résultats similaires. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Injecté par voie intraveineuse, ex vivo dérivé alternativement activé la circulation des macrophages dans le côlon et réduire l&#39;inflammation intestinale. Une génération F2 de souris de type sauvage sur une souris C57BL mixte / 6 × 129SV fond ont été donnés 5 DSS% dans leur eau potable pendant six jours. Macrophages M1 et M2 ont été injecté par voie IV aux jours 0 et 4 au cours du traitement DSS. (A) Colons ont été enlevés, fixé, et les articles ont été colorées par immunohistochimie pour les macrophages matures (F4/80) et un marqueur de macrophages M2 (Argi).La quantification des macrophages pour les souris injectées PBS contrôle (C), les souris injectées avec des macrophages M1 (M1 +) et des souris injectées avec des macrophages M2 (M2 +) ont été réalisées par comptage des cellules colorées positivement à un grossissement de 40 × 6 dans les champs à partir de 3 sections / souris et à partir de 6 souris par groupe. Le comptage est effectué par deux individus aveuglés à l&#39;état expérimental. (B) activité de la maladie a été contrôlée et a marqué tous les jours pendant le traitement et a réalisé un score additif à base de la perte de poids, saignements rectaux, et la consistance des selles a diminué. * P &lt;0,05 pour n = 6 souris dans 2 expériences indépendantes.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Les macrophages sont des cellules phagocytaires qui jouent un rôle important dans le système immunitaire. Ils sont responsables pour initier la réponse immunitaire innée et de diriger la réponse immunitaire acquise. En règle générale, les macrophages activés classique sont activés par IFNy ou LPS et sont responsables de l&#39;élimination des pathogènes et le montage d&#39;une réponse inflammatoire 1. A l&#39;inverse, les macrophages activés alternativement sont activés par l&#39;IL-4 ou d&#39;I...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Clodronate contenant des liposomes </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS contenant des liposomes </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS stérile pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> l&#39;acide acétique </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monothioglycérol (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> Recombinant murin MCSF </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> Recombinant GM-CSF murin </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Recombinant IL-3 murine </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Recombinant murin IFNy </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Recombinant IL-4 murine </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Cellule tampon de dissociation </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Rat anti-F4/80 Anticorps </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Souris anti-Argi Anticorps </td><td> Transduction Laboratories BD </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs spécifiques utilisés dans ce protocole.

depletion and reconstitution of macrophages in mice

Les macrophages sont des acteurs essentiels dans la réponse immunitaire innée au défi infectieuse ou d&#39;une blessure, les initiateurs de la réponse immunitaire innée et de diriger la réponse immunitaire acquise. Macrophage dysfonctionnement peut conduire à une incapacité de monter une réponse immunitaire appropriée et en tant que telle, a été impliqué dans de nombreux processus pathologiques, y compris les maladies inflammatoires de l&#39;intestin. Les macrophages afficher phénotypes polarisés qui sont largement divisés en deux catégories. Macrophages activés Classiquement, activées par la stimulation avec IFNy ou LPS, jouent un rôle essentiel dans la réponse au défi alors que les macrophages bactérienne alternativement activés, activée par l&#39;IL-4 ou d&#39;IL-13, participer à des débris de balayage et le remodelage des tissus et ont été impliqués dans la résolution la phase de l&#39;inflammation. Lors d&#39;une réponse inflammatoire in vivo, les macrophages se trouvent au milieu d&#39;un mélange complexe d&#39;infiltrer les cellules immunitaires et peuvent participer en exacerbant ou résolvinel&#39;inflammation g. Pour définir le rôle des macrophages in situ dans un modèle animal entier, il est nécessaire d&#39;examiner l&#39;effet de l&#39;épuisement des macrophages à l&#39;environnement complexe. Pour poser des questions sur le rôle du phénotype des macrophages in situ, phénotypiquement définis macrophages polarisés peuvent être dérivées ex vivo, à partir de ponctions de moelle osseuse et rajoutées à la souris, avec ou sans l&#39;épuisement préalable des macrophages. Dans le protocole présenté ici clodronate liposomes contenant, par rapport aux témoins injectés PBS, ont été utilisés pour épuiser les macrophages du côlon au cours du sulfate de sodium dextran (DSS) de colite induite chez la souris. En outre, les macrophages ont été polarisées dérivée ex vivo et transféré à des souris par injection intraveineuse. Une mise en garde de cette approche est que les liposomes contenant du clodronate épuiser toutes les phagocytes professionnels, y compris les deux cellules dendritiques et les macrophages afin d&#39;assurer l&#39;effet observé par l&#39;épuisement est macrophages spécifique, la reconstitution ophénotype f par transfert adoptif de macrophages est nécessaire. L&#39;épuisement des macrophages systémique chez la souris peut également être obtenu par rétrocroisement souris sur un fond CD11b-DTR, qui est une excellente approche complémentaire. L&#39;avantage du clodronate liposome contenant médiée par l&#39;épuisement, c&#39;est qu&#39;il ne nécessite pas le temps et les frais engagés pour les souris et rétrocroisement il peut être utilisé chez la souris indépendamment de l&#39;origine des souris (C57BL / 6, BALB / c, ou d&#39;origine mixte ).

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Les macrophages jouent un rôle central dans l&#39;homéostasie et de la pathologie dans de nombreux tissus. Le protocole présenté ici décrit des méthodes pour épuiser les macrophages<em&gt; In vivo</em&gt;, Dérivant macrophages polarisés de ponctions de moelle osseuse, et le transfert adoptif des macrophages à des souris. Ces techniques permettent de déterminer le rôle que les macrophages polarisés jouer dans la santé et la maladie.

L&#39;épuisement et la reconstitution des macrophages chez la souris

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

depletion-and-reconstitution-of-macrophages-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.4K vues.  University of British Columbia. Les macrophages jouent un rôle central dans l'homéostasie et de la pathologie dans de nombreux tissus. Le protocole présenté ici décrit des méthodes pour épuiser les macrophages In vivo, Dérivant macrophages polarisés de ponctions de moelle osseuse, et le transfert adoptif des macrophages à des souris. Ces techniques permettent de déterminer le rôle que les macrophages polarisés jouer dans la santé et la maladie.

Vidéo: Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l&#39;épuisement Complément

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Recherche

Immunologie et infection

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilisation d&#39;<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Pour étudier les interactions de l&#39;autophagie cytosquelette

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d&#39;utilisation efficace<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l&#39;antigène

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantification des cytosolique vs Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Dégradation de l'adage pour atteindre un appauvrissement spécifique et efficace des protéines

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...