Les deux techniques de pelage démontrées ici isolent les compartiments subcellulaires individuels des bâtonnets et peuvent aider à révéler les processus physiologiques importants qui se produisent dans chaque compartiment spécialisé chez les bâtonnets sains et malades. Isoler différents compartiments de cellules de bâtonnets de la rétine de la souris peut être difficile. Ces techniques simples utilisent des matériaux de laboratoire peu coûteux et courants pour isoler de manière fiable les compartiments subcellulaires des tiges pour l’analyse des protéines.
Pour commencer, placez un morceau de papier filtre dans une boîte de Petri remplie de tampon Ames HEPES bouillonné d’oxygène à 100%. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert à large alésage, transférez un rectangle rétinien disséqué d’une souris C57 Black 6J âgée de deux à trois mois. Orientez la rétine cloisonnée concave vers le haut et assurez-vous que les photorécepteurs sont orientés vers le bas vers le bas de la boîte.
Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, saisissez légèrement les côtés de la rétine coupée en deux et déplacez-la sur le papier filtre. Une fois la rétine centrée, déplacez le papier filtre vers le haut afin que la rétine coupée en deux touche le papier filtre pour créer un segment externe de tige, ou ROS pour filtrer l’adhérence du papier. Soulevez délicatement le papier filtre avec la rétine attachée hors du tampon AMes HEPES.
Placez la face inférieure du papier filtre sur une serviette en papier et tamponnez deux à trois fois pour sécher. Ajoutez une goutte d’Ames HEPES sur le côté du papier filtre avec la rétine et placez à nouveau le papier filtre sur l’essuie-tout pour sécher. Ensuite, replacez le papier filtre avec la rétine dans la boîte de Pétri et, à l’aide d’une pince à épiler, poussez doucement tous les bords de la rétine coupée en deux vers le haut et loin du papier filtre de tous les côtés.
Détachez délicatement la rétine du papier filtre, en ne touchant que le périmètre extrême de la rétine pour préserver son intégrité structurelle. Ensuite, soulevez le papier filtre de la boîte de Petri et retirez l’excès de liquide sur une serviette en papier, en veillant à ce que le côté en contact avec la rétine n’entre pas en contact avec l’essuie-tout. Placez le papier filtre avec la couche ROS partielle dans un tube étiqueté sur de la glace et gardez la rétine pelée immergée dans le tampon Ames HEPES.
Répétez le processus de peeling de cette rétine coupée en deux environ sept à huit fois pour enlever toute la couche ros. Après chaque peeling, placez le papier filtre dans le même tube pour combiner tous les ROS isolés d’une rétine coupée en deux. Conservez le tube contenant tous les épluchures de papier filtre du ROS isolé sur de la glace pour une utilisation immédiate.
À l’aide d’une pince à épiler, transférez les restes de rétine pelée dans un tube correctement étiqueté et gardez le tube sur de la glace pour une utilisation immédiate. Pour préparer l’échantillon rétinien à la lyophilisation, placez un morceau de papier filtre et transférez une rétine coupée en deux dans une boîte de Pétri remplie de tampon froid de Ringer. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, retournez soigneusement la rétine pour qu’elle soit orientée concave vers le haut et déplacez-la pour la reposer sur le papier filtre.
Soulevez le papier filtre par les bords vers le haut afin que le morceau de rétine coupé en deux touche le papier filtre. Continuez à soulever le papier filtre de la solution de Ringer. Ensuite, placez le côté inférieur du papier filtre sur une serviette en papier et tamponnez soigneusement deux à trois fois pour éliminer l’excès de liquide.
Ensuite, prenez le papier filtre avec une pince à épiler et ajoutez une goutte de Ringer froid sur le côté du papier filtre avec la rétine. Encore une fois, placez le papier filtre sur l’essuie-tout pour éliminer l’excès de liquide. Conservez chaque échantillon de rétine et de papier filtre adhérent dans une boîte de Petri remplie de Ringer froid jusqu’à ce qu’ils soient prêts à congeler tous les échantillons.
Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, soulevez chaque échantillon du tampon froid de Ringer, en vous assurant que les pinces à épiler ne contactent que les bords du papier filtre, en évitant la rétine coupée en deux. Placez la face inférieure de chaque papier filtre sur une serviette en papier pour éliminer l’excès de liquide. Ensuite, ajoutez une goutte de PBS froid sur le côté du papier filtre où la rétine est collée et tamponnez à nouveau le papier filtre sur l’essuie-tout.
Placez tous les morceaux de papier filtre dans la boîte de Pétri et, à l’aide de papier de soie non pelucheux, évacuez tout excès de liquide entourant le papier filtre. Ensuite, enveloppez hermétiquement le plat entier avec du papier d’aluminium et assurez-vous que les bords du papier d’aluminium sont fixés et pressés en douceur dans le fond de la boîte de Pétri. Percez une poignée de trous de 0,1 à 0,2 millimètre dans le couvercle en feuille d’aluminium.
Ensuite, à l’aide de pinces métalliques, abaissez progressivement la boîte de Petri recouverte de papier d’aluminium en azote liquide. Conservez les échantillons dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être lyophilisés. Pour la lyophilisation, placez la boîte de Petri recouverte de papier d’aluminium dans une fiole de lyophilisation et fixez-la à la machine de lyophilisation en suivant le protocole du fabricant.
Lyophiliser la rétine pendant 30 minutes. Après la lyophilisation, recueillir le segment externe et interne de la tige en posant soigneusement un petit morceau de ruban adhésif sur le dessus de la rétine lyophilisée et en appliquant une légère pression avec la pince à épiler pour s’assurer qu’il se lie à la couche photoréceptrice. Décollez lentement la bande et assurez-vous que le ROS et le RIS ont adhéré à la bande.
Un mince film blanc sera présent à la surface fracturée. C’est le RIS. Pour séparer ce RIS, placez un autre morceau de ruban adhésif et poussez le ruban vers le bas sur la surface fracturée.
Ensuite, placez le morceau de ruban adhésif avec seulement la couche rose orangé dans un tube de microcentrifugation étiqueté ROS, et les morceaux de ruban adhésif avec la fine couche blanche dans un autre tube étiqueté RIS. Ensuite, à l’aide de ruban adhésif, collectez le tissu rétinien restant situé sur le papier filtre en décollant la couche épaisse et blanche. Ensuite, placez cet isolat dans un tube étiqueté OIS.
Si vous utilisez le même jour, conservez les couches isolées de la rétine lyophilisée à température ambiante. Chez les animaux adaptés à l’obscurité, la distribution de GNAT1 et ARR1 correspondait étroitement à leurs distributions connues à l’état sombre, où le signal GNAT1 était visiblement le plus fort dans l’isolement ROS, et le signal ARR1 était plus robuste dans l’isolement ROS. La quantification des signaux GNAT1 et ARR1 a montré des différences significatives entre les conditions de lumière sombre pour GNAT1 et ARR1 dans les échantillons ROS et ROS.
Dans les échantillons sombres et adaptés à la lumière, les signaux G beat 5S, cytochrome C et actine sont exclus des échantillons ROS, ce qui démontre une absence de contamination par d’autres couches cellulaires. De plus, le signal G bêta 5L était clairement visible dans les échantillons ROS. La microscopie électronique à balayage des surfaces de la rétine lyophilisée intacte et pelée a montré que, avant le pelage avec du ruban adhésif, la surface de la rétine lyophilisée intacte correspondait étroitement au ROS cylindrique caractéristique.
Après le peeling initial du ruban, le ROS et le RIS ont semblé être entièrement enlevés, comme en témoigne la couche nucléaire uniforme présente à la surface de la rétine lyophilisée, pelée et pelée. Les pelures de ruban adhésif suivantes ont éliminé ris de la surface libre de la couche pelée. Cette technique a également démontré que l’immunoréactivité GRK1 était plus intense dans les échantillons de ROS dans la rétine exposée à la lumière, et absente dans les échantillons d’OIS.
Inversement, les échantillons ROS et RIS ont montré un faible signal pour PKC alpha, qui n’est généralement pas détecté dans ROS ou RIS par coloration par immunofluorescence. Enfin, un pelage sous-optimal du ruban adhésif pourrait donner des échantillons légèrement contaminés. L’échantillon RIS a été contaminé par un échantillon OIS, produisant à la fois des bandes G bêta 5L et G bêta 5S, et un signal alpha PKC plus élevé.
Des précautions doivent être prises lors de la lyophilisation de la rétine. Si une technique de lyophilisation incorrecte est utilisée, la rétine peut fondre, ce qui rend impossible l’isolement de différentes couches subcellulaires de bâtonnets par du ruban adhésif. L’utilisation de cette méthode de peeling sur bande en conjonction avec la qRT-PCR a permis de séparer les transcriptions des photorécepteurs du reste de la rétine.
