Cette méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes permettra des techniques de séquençage avancées pour révéler de nouveaux mécanismes de développement vasculaire. Le protocole décrit est optimisé pour des degrés élevés de viabilité et de pureté, qui sont essentiels pour les applications de séquençage de nouvelle génération. Shelby Cain, une étudiante diplômée du laboratoire Hershey, fera la démonstration de la procédure.
Commencez à enlever les yeux de la souris néonatale euthanasiée en coupant la peau et la membrane sur l’œil avec une incision perpendiculaire à la paupière à l’aide de ciseaux de dissection. Ensuite, utilisez la pince pour appuyer au-dessus et au-dessous de l’œil afin que l’œil sorte de l’orbite. Pincez soigneusement sous l’œil avec la pince et coupez le nerf optique qui maintient l’œil attaché.
Ensuite, placez les deux yeux de la souris dans un puits de la plaque de 48 puits dans le PBS glacé fraîchement préparé jusqu’à la fin de la récolte. Pour isoler le tissu rétinien de la souris, suspendez les yeux dans le tampon de dissection dans une boîte de Petri remplie de 500 microlitres de PBS glacé à l’aide d’un tampon de tuyau de transfert avec une pointe large. En travaillant sous le microscope à dissection, tenez le nerf optique avec une pince fine et utilisez la deuxième pince pour percer le trou à travers la chambre antérieure de l’œil où la cornée et la sclérotique se connectent.
Ensuite, déchirez le trou en cercle à environ 75% du chemin autour de la cornée. Tout en tenant le nerf optique avec une pince, utilisez la deuxième pince pour arracher doucement la sclérotique et le corps vitré du tissu rétinien. Pour enlever le cristallin et les vaisseaux du plexus hyaloïde, pénétrez dans la rétine avec une pince ouverte jusqu’à ce qu’elle soit presque touchée, puis fermez la pince pour saisir et tirer le cristallin et les vaisseaux du plexus hyaloïde hors de la rétine.
Lorsque tous les vaisseaux sont retirés, placez les rétines dans les tubes microcentrifugeux de deux millilitres remplis de 500 microlitres d’un x PBS glacé. Retirez l’excès de PBS du tube microcentrifuge de deux millilitres avec une pipette en laissant environ 100 microlitres de PBS dans le tube pour couvrir complètement le tissu rétinien. Ajoutez ensuite 500 microlitres de la solution de digestion fraîchement préparée dans le tube.
Utilisez une pipette P1000 et un embout de pipette pour pipeter le tissu rétinien dans la solution de digestion cinq fois. Une fois terminé, incuber le mélange de digestion dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 20 minutes en pipetant le mélange de digestion de haut en bas toutes les cinq minutes comme expliqué précédemment. Après l’incubation, le tissu rétinien se dissoudra en une seule suspension cellulaire rendant le mélange de digestion trouble.
Ensuite, pelletez les cellules par centrifugation à 375g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer le PBS de la pastille de cellules lavées par pipetage, puis immunocolorer les cellules en remettant la pastille en suspension dans 100 microlitres de solution de coloration d’anticorps par 0,5 fois 10 à la sixième cellule. Incuber la suspension unicellulaire avec la solution de coloration d’anticorps pendant 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité en tapotant le tube toutes les 10 minutes pour mélanger doucement les cellules.
Pour le tri cellulaire activé par fluorescence, enduire les cellules par centrifugation à 375 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, laver et granuler les cellules dans 500 microlitres de PBS comme décrit précédemment. Et puis remettre les cellules en suspension dans 300 microlitres de tri cellulaire activé par fluorescence ou tampon FACS en mélangeant doucement avec la pipetta.
Ensuite, ajoutez de l’iodure de propidium ou PI comme marqueur de viabilité aux tubes d’échantillon contenant le tampon FACS pour obtenir une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre. Utilisez une pipette pour transférer les suspensions cellulaires à travers un capuchon de crépine contenant un filtre de 35 microns dans un tube à essai de cinq millilitres. Après la filtration, conservez le tube FACS sur de la glace dans l’obscurité, puis transférez le tube dans le trieur de cellules.
Allumez l’instrument FACS et l’ordinateur et ouvrez le logiciel FACS pour exécuter et utiliser l’instrument FACS. Effectuer des tests de contrôle de la qualité de routine. Chargez les échantillons de coloration de contrôle dans l’instrument FACS pour ajuster les axes.
Commencez avec des cellules d’anticorps IgG uniquement pour générer et ajuster la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale. Ensuite, l’anticorps CD31 uniquement pour générer et ajuster CD31. Et puis l’anticorps CD45 uniquement pour générer et ajuster CD45.
Enregistrez les données des échantillons de contrôle. Ensuite, chargez les cellules d’échantillon colorées dans l’instrument FACS et exécutez l’échantillon. Démarche des cellules en fonction des paramètres de diffusion vers l’avant ou FSC et de diffusion latérale ou SSC.
Cellules de marche par FSCA et FSCH pour identifier les doublets cellulaires et ne collecter que des cellules individuelles. Cellules de marche par IP et SSCA pour identifier les cellules viables. Faire une démarche CD31+CD45 avec des témoins Faire une démarche CD31+CD45 avec des témoins et faire marcher les cellules par CD31 et CD45.
Insérez un tube collecteur avec 250 microlitres de tampon FACS dans l’instrument. Ensuite, commencez à trier les cellules CD31+CD45 dans le tube de collecte installé. Gardez les tubes de collecte sur la glace pour une analyse plus approfondie.
Les échantillons peuvent être traités pour des applications de séquençage de nouvelle génération. Dans l’étude, la variation du temps de digestion a affecté le rendement cellulaire et le pourcentage de viabilité. Le temps de digestion de 20 minutes a permis d’obtenir un rendement optimal avec un faible pourcentage de cellules endothéliales non viables.
Une coloration ultérieure à l’iodure de propidium a démontré que les cellules endothéliales isolées restaient viables pendant 60 minutes après l’isolement. La pureté de la population cellulaire a été évaluée par PCR quantitative ou qPCRR de l’expression des gènes des cellules endothéliales montrant un fort enrichissement pour les gènes des cellules endothéliales dans la population CD31+CD45. Purification de l’ARN des cellules endothéliales isolées Conversion et amplification de l’ADNc par la préparation et le séquençage de la bibliothèque La banque d’ADNc a permis d’identifier plus de 16 000 gènes dans neuf échantillons indépendants.
Une baisse des transcrits par million de lectures ou TPM a été observée dans les gènes en dessous de ce seuil. Le séquençage de l’ARN unicellulaire des cellules endothéliales rétiniennes isolées à travers le pipeline 10x Genomics a abouti à une médiane de 1 171 gènes par cellule, 15 247 gènes au total détectés et une médiane de 2 255 identificateurs moléculaires uniques ou numérations UMI par cellule dans 917 cellules. Les étapes critiques de ce protocole sont l’isolement des tissus rétiniens et la digestion des tissus, qui doivent être effectués avec précision comme décrit pour optimiser le rendement cellulaire et la viabilité.
Les cellules endothéliales isolées peuvent être utilisées dans des techniques de séquençage avancées telles que le séquençage de l’ARN du transcriptome entier, le séquençage de l’ARN unicellulaire, le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine de la chromatine et le dosage du séquençage de la chromatine accessible par la transposase. L’utilisation de cette méthode optimisée en combinaison avec des méthodes de séquençage de nouvelle génération et par des approches informatiques peut élucider davantage les mécanismes des voies de signalisation interconnectées qui régulent les développements vasculaires.
