Ce protocole décrira un moyen simple et efficace d’isoler avec succès les cellules primaires pigmentées de l’épithélium pigmenté de la rétine de souris. Les cellules de l’épithélium pigmentées de la rétine jouent un rôle très important pour maintenir les cellules photoréceptrices et assurer le fonctionnement normal de la rétine. Notre laboratoire a isolé les cellules épithéliales pigmentées primaires de souris comme un outil important pour étudier la barrière hémato-rétinienne externe et les maladies connexes telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge.
Pour extraire les yeux de souris, euthanasiez éthiquement la souris selon les méthodes approuvées de votre établissement, puis placez la souris sur un coussinet stérile et nucléez l’œil en appuyant sur une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitale pour induire la proptose, puis déplacez la pince à épiler vers la partie postérieure de l’œil et tirez doucement pour enlever l’œil en vous assurant que le nerf optique est toujours intact. Lors de l’utilisation de forceps, immergez les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant 5% de povidone iodée. Incuber les yeux à température ambiante pendant 2 à 3 minutes.
Retirez les yeux de la povidone iodée et placez-les dans une boîte de Pétri. Lors de l’utilisation d’une pipette de transfert stérile, lavez les yeux avec la solution saline équilibrée de Hanks jusqu’à ce que la couleur orange de la povidone iodée ait disparu. Cela prend environ 2 à 3 lavages.
Placez les yeux dans une nouvelle boîte de Petri et immergez-les dans un milieu de croissance complet des cellules EPR froides. À partir de là, vous pouvez commencer à disséquer sous un microscope à dissection. Au microscope, utilisez une pince à épiler et/ou des ciseaux Vannas pour tirer ou couper le tissu conjonctif dans les muscles extraoculaires.
Les yeux peuvent ensuite être maintenus pendant une heure dans des milieux de culture cellulaire EPR froids. Cependant, il est préférable de passer directement à l’étape suivante après avoir nettoyé le globe oculaire. Transférer les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant la solution d’enzyme A, puis incuber les yeux dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes.
Retirez les yeux de la solution d’enzyme A et placez-les dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 millilitres contenant la solution d’enzyme B, puis placez-les dans un incubateur et incuber à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes. Retirez les yeux de l’enzyme B et placez-les dans une boîte de Petri de 60 millimètres et immergez-les et complétez le milieu de croissance des cellules EPR, puis incuber les yeux à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Placez la capsule sous le microscope à dissection et commencez à disséquer.
Utilisez des pinces M5S et une aiguille de seringue pour faire une incision dans la section ora seratta. Maintenant, avec deux pinces, saisissez la partie interne de l’incision avec une pince et saisissez la cornée avec l’autre pince. Commencez à déchirer lentement la cornée de la rétine en tirant la cornée.
Assurez-vous de déchirer par petits incréments et de descendre la déchirure lorsque vous retirez la cornée. Cela garantira que le RPE restera en grande partie intact et vous obtiendrez une déchirure plus propre. Une fois que la cornée est complètement détachée, vous devriez pouvoir voir l’iris et le cristallin.
Retirez à la fois l’iris et la lentille avec une pince pour maintenir la pureté de l’isolement. Pour retirer la rétine neurale de la couche EPR, saisissez la couche externe de l’œilleton avec une pince à épiler et placez un bras d’une deuxième pince à épiler entre les couches RPE et neurale. De là, retirez doucement ou retirez la rétine neurale de la couche d’EPR, puis jetez la rétine neurale.
Déplacez la couche RPE à un autre endroit de la capsule, exempte de débris. Pour séparer l’EPR de la choroïde et de la sclérotique, grattez doucement l’intérieur de l’œilleton avec une pince à épiler de style 5/45 pour assurer la séparation des cellules EPR. Les cellules EPR semblent troubles lorsqu’elles sont en suspension et complètent le milieu de croissance des cellules EPR.
Aspirer les cellules à l’aide d’une pipette de transfert stérile de 3,2 millilitres et transférer dans un nouveau tube centrifuge de 15 millilitres contenant un milieu de croissance complet des cellules EPR. Les cellules peuvent être centrifugées à 300g pendant 10 minutes à température ambiante. Vous pouvez ensuite aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un milieu de croissance de cellules EPR chauffé.
Plaquez les cellules sur une boîte de Petri de 100 millimètres et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de CO2. Ces images montrent une isolation réussie au passage 0 et au passage 1, ce qui est évident par la pigmentation des cellules EPR. Au passage 4, les cellules deviennent moins caractéristiques et présentent moins de pigments, montrent un aspect fusiforme ou deviennent plus robustes avec une plus grande surface.
Nous avons validé les cellules EPR avec un marqueur spécifique de l’EPR, RPE65 et une protéine F-actine du cytosquelette. Nous avons également vérifié la contamination potentielle par les cellules de Muller en colorant avec un marqueur spécifique aux cellules de Muller, la vimentine. Ce protocole est une adaptation simplifiée des protocoles existants.
Le protocole utilise des matériaux et des équipements connexes disponibles dans la plupart des laboratoires de recherche, ce qui aidera à isoler efficacement les cellules RPE primaires de souris.
