Les plaquettes doivent être exemptes de cellules sanguines et de protéines lorsqu’elles étudient leurs propriétés biochimiques et physiologiques. Par conséquent, nous avons développé un protocole pour purifier les plaquettes à partir du sang de souris. Cette technique peut purifier les plaquettes à l’aide d’une centrifugation de gradient iohexol à vitesse moyenne et basse, ce qui entraîne une séparation claire des plaquettes des autres composants sanguins.
Pour purifier les plaquettes, utilisez une pointe de pipette à alésage large pour superposer 200 microlitres de sang entier fraîchement récolté lentement sur le côté d’un tube de 1,5 millilitre sur 600 microlitres de milieu de gradient iohexol sans mélange. Après centrifugation dans un rotor balançant-seau pour isoler les plaquettes, utilisez une nouvelle pointe de pipette à alésage large pour recueillir la majeure partie de la couche riche en plaquettes et une petite fraction de la couche platelet-pauvre sans aspirer le globule blanc ou la couche de globules rouges. Ajouter l’échantillon de plaquettes à un nouveau tube et ajouter un millilitre de PBS aux plaquettes.
Mélanger les plaquettes par inversion avant d’effectuer une autre centrifugation. Puis résuspendez la pastille dans 200 microlitres de PBS avec pipetting doux. Pour l’activation des plaquettes, transférer une à deux fois 10 sur les six plaquettes dans un nouveau tube contenant 100 microlitres de tampon de coloration.
Ajouter une à deux fois 10 aux six plaquettes à un tube différent contenant 100 microlitres de tampon de coloration complétés par du peptide GPRP de 0,4 millimilliard. Ajouter la thrombine au tube avec le peptide GPRP pour activer les plaquettes, et ajouter le cocktail d’anticorps d’intérêt aux deux tubes. Comme un contrôle positif, ajouter un microlitre de sang entier dans jusqu’à 100 microlitres de tampon de coloration dans un tube contenant 0,4 millimilliard de peptide GPRP, et ajouter de la thrombine pour activer ces plaquettes.
Comme un contrôle négatif, ajouter un microlitre de sang entier dans jusqu’à 100 microlitres de tampon de coloration. Ensuite, tachez les deux tubes de commande avec le cocktail d’anticorps. Après 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité, laver les échantillons avec un millilitre de tampon de coloration fraîche par tube.
Resuspendez les granulés dans 300 microlitres de tampon de coloration fraîche. Transférez ensuite les échantillons cellulaires dans des tubes individuels d’analyse de cytométrie d’écoulement protégés de la lumière. Pour analyser les plaquettes par cytométrie d’écoulement, créez une nouvelle expérience et générez la dispersion vers l’avant logarithmique par rapport aux parcelles de points de dispersion latérales logarithmiques.
Après avoir ajusté les tensions au besoin, enregistrez les cellules teintées d’une seule couleur pour les contrôles de compensation. Maintenant, exécutez l’échantillon de contrôle positif pour acquérir suffisamment de cellules pour ajuster la compensation et les portes. Puis acquérir et enregistrer 100 000 événements pour chaque échantillon de sang entier, et analyser les données de cytométrie du flux à l’aide des parcelles et des portes appropriées.
Si le sang est ajouté sur le milieu lentement, le milieu de gradient iohexol et l’échantillon de sang formeront deux couches distinctes dans le tube. Après centrifugation, la couche supérieure de couleur paille contient le plasma, mais pas de cellules sanguines intactes. La deuxième couche blanchâtre riche en plaquettes contient la majorité des plaquettes.
La troisième couche transparente est la couche pauvre en plaquettes et se trouve directement au-dessus du globule rouge et de la pastille de globules blancs. Le sang entier présente des populations distinctes de globules rouges, de globules blancs et de plaquettes sur une dispersion vers l’avant logarithmique par rapport à une parcelle de points de dispersion latérale. Les plaquettes purifiées, cependant, démontrent une population distincte avec un nombre négligeable de globules rouges ou blancs.
Les échantillons de sang entier contiennent des globules rouges ter119 positifs et des populations de globules blancs CD45 positifs qui sont presque absents dans les échantillons purifiés de plaquettes. Les plaquettes purifiées non traitées n’expriment presque aucun marqueur d’activation confirmant leur état de repos, tandis que les plaquettes purifiées traitées par thrombine démontrent généralement une expression de 71 % de P-selectin. L’évaluation microscopique des échantillons purifiés non traités de plaquette ne révèle aucune agrégation de plaquette.
Après activation avec la thrombine, cependant, les plaquettes démontrent une agrégation robuste, confirmant davantage leur viabilité après purification comme démontré. Superposer soigneusement l’échantillon de sang sur le milieu de l’iohexol, et lors de la collecte des plaquettes, assurez-vous d’aspirer soigneusement afin de ne pas recueillir les globules rouges et les couches de globules blancs pour une purification réussie des plaquettes. Cette méthode peut également être utilisée pour la purification des plaquettes d’autres espèces.
Les plaquettes purifiées peuvent être utilisées pour l’expression des gènes, l’activation, l’agrégation, la libération de granules et les études d’adhérence.
