Nous tenons à remercier Mark Lucanic et Hwai-Jong Cheng de l&#39;aide pour l&#39;acquisition des images faible grossissement des coupes d&#39;hippocampe ensemble présenté dans cette vidéo. Nous tenons également à remercier Sarah Parrish pour avoir aidé avec le texte qui accompagne la vidéo.

PROTOCOLE POUR LA TRANSFECTION biolistique Faire des balles Les puces sont bonnes pour un maximum de 6 mois, mais peut commencer à diminuer dans l&#39;efficacité de transfection après 2-3 mois. Bullets doivent être conservés à 4 ° C en présence de boulettes de dessicant. Toujours laisser les flacons à scintillation, dans lequel sont stockées les balles, le réchauffer à température ambiante avant d&#39;ouvrir le flacon. Avant de commencer avoir en main: <ul><li> Spermidine (0,05 M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100% de haute qualité-non ouvert bouteille) </li><li> Autoclavés H 2 0 </li><li> ADN à transfecter </li><li> Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 mg / ml de stock) </li><li> 2 X 15 ml conique (2/bullet jeu) </li><li> Tubes (coupé en 1 X ~ 30 pouces jeu balle /) </li><li> Fioles à scintillation (ensemble 1/bullet) </li><li> Granulés dessiccation </li><li> Seringue de 10 ml w / tube à l&#39;extrémité </li></ul> Préparer tube: <ol><li> Dry ~ 30 pouces de tubes (environ 2 pouces au-delà droite O-ring) dans la station de tube w / gaz N 2 (0,4 pression) pour une durée minimale de 20 min. </li></ol> Précipiter l&#39;ADN sur des billes d&#39;or: <ol><li> Préparer l&#39;ADN à transfecter dans 50 volume total μmL en microtube (maximum 50 mg d&#39;ADN total) </li><li> Peser 6-8 mg d&#39;or et de transfert à un microtube </li><li> Ajouter 100 ul de 0,05 M spermidine d&#39;or et une sonication pendant 20 sec </li><li> Ajoutez les 50 uL d&#39;ADN pour la médaille d&#39;or / spermidine </li><li> Vortex (autour de la mise 5) W / CAP ouverte </li><li> Ajouter goutte à goutte 100 ul de CaCl 2 1M </li><li> Brièvement Soniquer (&lt;5 sec) </li><li> Laisser décanter pendant 10 min à température ambiante </li><li> Soniquer brièvement </li></ol> Préparer la solution PVP pendant la sonication: <ol><li> Faire diluer solution PVP dans 15 ml conique, 3,5 ml diluées PVP pour chaque jeu de balles (ajouter 7,5 ul de 20mg/ml PVP stock à 3,5 ml EtOH 100%) </li></ol> Rinçage des billes d&#39;or avec EtOH: <ol><li> Isoler perles d&#39;or à pleine vitesse pendant 10 secondes dans la microcentrifugeuse </li><li> Rejeter le surnageant, mais gardez une petite quantité de liquide sur le dessus de perles d&#39;or </li><li> Laver avec 1 ml EtOH 3X, soniquer brièvement chaque fois, si nécessaire </li></ol> Or Resuspendre / ADN en solution PVP: <ol><li> Reprendre le culot d&#39;or dans 200 ul de la diluer 3,5 ml PVP / EtOH solution </li><li> Vortex le culot d&#39;or pour resuspendre (brièvement soniquer si nécessaire) </li><li> Transférer la uL 200 de l&#39;or / solution de PVP à une nouvelle conique 15 ml </li><li> Continuer de cette manière, l&#39;ajout de 200 uL de PVP à un moment jusqu&#39;à ce que tous l&#39;or a été transféré à la forme conique de 15 ml, et le volume final est de 3,2 ml </li></ol> Tube de revêtement: <ol><li> Éteignez N 2 à la station de tuyaux et tubes en retirer séchées </li><li> Fixez tube séché à la seringue de 10 ml </li><li> Secouez vigoureusement les 15 ml conique rempli d&#39;or / PVP </li><li> Placez l&#39;extrémité du tuyau en or / solution de PVP et sucer lentement en prenant soin d&#39;éviter les bulles </li><li> Laisser ~ 2 pouces à sec des deux extrémités de la tuyauterie </li><li> Avec le tube encore attaché à la seringue et rempli de la solution d&#39;or / PVP, placer soigneusement le dos tube dans la station </li><li> Marquer les extrémités du tube où la solution se trouve </li><li> Laissez l&#39;or se contenter de 5 min avec la seringue fixée </li><li> Suce-place de la solution très lentement en tirant la seringue afin que l&#39;or réglée soit laissé (veillez à ne pas revenir de lavage) </li><li> Déconnecter la seringue </li><li> Rotation de 90 ° et laisser reposer 2 secondes </li><li> Rotation de 180 ° et laisser reposer encore 2 secondes </li><li> Tournez le tube pendant 5 secondes </li><li> Allumez le N 2 de sorte que la vanne lit entre 0,4 à 0,5 et le spin du tube recouvert d&#39;or pendant le séchage pendant 5 min. </li></ol> Coupe tube: <ol><li> Retirez le tube de la tubulure de préparation en station et couper les extrémités à la marque. </li><li> Mettez un flacon à scintillation étiqueté sous le couperet tuyau pour attraper cartouches coupé </li><li> Placer dans le tube chopper tube et couper le tube avec de rasoir propre </li><li> Placer un dessèchement granulés en flacon à scintillation </li><li> Conservez les cartouches à 4 ° C </li></ol> Tir des tranches de tissu Lorsque vous photographiez des tranches de culture, il est important d&#39;employer une technique relativement stérile afin d&#39;éviter toute contamination. Rappelez-vous que lorsque vous photographiez deux constructions différentes, les deux séries de balles peuvent être chargées dans le support de la cartouche même, mais le canon-liner et l&#39;écran doit être changé entre les constructions. Avant de commencer avoir en main: <ul><li> Balles ADN (laissez flacon à scintillation se réchauffer à température ambiante avant ouverture) </li><li> Tranches de tissu </li><li> Helios pistolet à gènes </li><li> Réservoir d&#39;hélium avec un tuyau pistolet à gènes attachés &lt;/ Li&gt; <li> Support de la cartouche </li><li> Liner baril de plastique joint torique en place </li><li> Diffuseur (modifié) </li><li> Écran diffuseur </li><li> Forceps </li></ul> Prepping le pistolet génique: <ol><li> En utilisant une pince placer les cartouches en or recouvert de plastique dans le support de la cartouche. </li><li> Placez le support de la cartouche dans le pistolet à gènes d&#39;abord repousser verrouillage </li><li> Fixez le support de la cartouche avec blocage </li><li> Obtenir une doublure canon avec un joint torique et l&#39;écran diffuseur solidement en place </li><li> Vissez le baril-liner dans le pistolet à gènes </li></ol> Tir tranches cultivés avec le pistolet à gènes: <ol><li> Mettez cache-oreilles </li><li> Branchez le pistolet à gènes dans le tuyau de gaz réservoir relié Hélium </li><li> Tournez la pression sur le réservoir à 180 PSI </li><li> Tirez une vierge dans l&#39;air afin d&#39;enlever toute la poussière ou les débris de l&#39;écran diffuseur. Pour tirer le canon, d&#39;abord appuyer sur le bouton de verrouillage de sécurité jusqu&#39;à ce que les bips fusil, puis tirez sur la gâchette. </li><li> Après le tournage de la vierge, retirez les tranches de l&#39;incubateur </li><li> Avance au pistolet d&#39;abord construire </li><li> Shoot avec l&#39;écran diffuseur d&#39;environ 0,5 - 1 pouce de la tranche </li><li> Advance de la cartouche entre les puits. </li><li> Après le tournage du dernier puits, placer les tranches de retour dans l&#39;incubateur </li><li> Éteignez la pression du gaz et la libération avant de détacher le pistolet du tuyau d&#39;hélium </li><li> Dévissez la doublure baril, et retirez la cartouche et les coquilles utilisées </li></ol> Nettoyage porte-cartouches et les doublures canon: <ol><li> Placez les cartouches, les doublures baril, et les écrans de diffuseur dans un bécher avec de l&#39;eau savonneuse </li><li> Bécher place dans sonicateur de bain et une sonication pendant 20 min </li><li> Rincer abondamment à l&#39;eau jusqu&#39;à ce que tous les résidus de savon sont retirés </li><li> Faire tremper dans EtOH à 70% pour une heure </li><li> Placez-le sur une serviette en papier sèche sécher une nuit </li><li> Nettoyer les cartouches, les doublures baril, et les écrans peuvent ensuite être réutilisées dans les prochains transfections biolistique </li></ol> Conseils de dépannage pour la transfection biolistique Transfection biolistique peut parfois aboutir à des conditions de transfection optimales. Elle peut conduire à trop peu ou trop grand nombre de cellules transfectées, trop haut ou trop bas niveaux d&#39;expression, ou peuvent causer des tranches de tissu pour devenir généralement malsain. Entraînent souvent malsaine tranches de l&#39;explosion de pression. Voici quelques conseils pour obtenir des tranches de tissu de façon optimale transfectées. Si les tranches semblent être malsaine (ou si trop de cellules sont transfectées / tranche), essayez: <ul><li> distance de tir augmente </li><li> la pression diminue sur le réservoir de gaz </li><li> diminuant la quantité d&#39;or </li><li> découper le centre du diffuseur de Bio-Rad et le remplacement du centre avec un écran diffuseur. </li></ul> Si trop peu de cellules sont transfectées, essayez: <ul><li> diminuant la distance de tir </li><li> une pression croissante sur le réservoir de gaz </li><li> augmentant la quantité d&#39;or </li><li> augmentant le nombre de tranches de tissu / puits </li><li> assurez-vous que le joint torique dans le canon-liner est intacte. </li></ul> Si vous obtenez des tranches à la fois avec trop de cellules transfectées et trop peu pendant le tournage même s&#39;assurer que: <ul><li> que vous tenez le pistolet symétriquement au-dessus ainsi </li><li> que l&#39;or est uniformément revêtement de l&#39;intérieur du tube. (Si vous avez trouvé une ligne d&#39;or, d&#39;en tirer le surnageant du tube à un rythme plus rapide une fois l&#39;or s&#39;est installé et tourner l&#39;or plus avant de tourner sur l&#39;azote. Si, d&#39;autre part, vous avez trouvé des stries d&#39;or , cela est probablement attribuable à une exposition trop d&#39;humidité pendant la fabrication de puce: assurez-vous que vous utilisez un flacon non ouvert d&#39;EtOH, que le tube est bien sec avant de revêtement, et que vous le plafonnement des couvercles et des balles en préparation en temps opportun). </li></ul> Si l&#39;efficacité de transfection semble optimal (# des cellules transfectées / tranche), mais le niveau d&#39;expression semble trop haute ou trop basse: <ul><li> ajuster le ratio de l&#39;ADN à l&#39;or. (Par exemple, si elle est trop faible maintenir la quantité d&#39;or, mais augmenter la quantité d&#39;ADN.) </li><li> ajuster la quantité de temps entre les tirs et la collecte des données </li></ul> Dans le cas de la transfection double, si vous avez trouvé l&#39;expression trop peu de l&#39;un de vos constructions, d&#39;ajuster le ratio de ces deux concepts de façon appropriée et assurez-vous que les deux constructions sont sous le même promoteur, afin de s&#39;assurer que l&#39;on promoteur ne sera pas hors-compétition de l&#39;autre.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules par l&#39;intermédiaire bombardement de tissus vivants avec des particules de haute vitesse de l&#39;ADN d&#39;or enrobées. Dans le transfert de gène médié particules, en général, les cellules transfectées résultat quand la balle vient reposer dans le noyau. Alors que de nombreuses méthodes de transfection différentes existent, telles que la microinjection, la lipofection, la transfection de phosphate de calcium, l&#39;électroporation et la transfection virale, la transfection biolistique peut offrir un moins de travail, et alternative efficace pour transfecter des cellules qui ne sont pas facilement transfectées en utilisant ces autres méthodes. En fait, il a d&#39;abord été développé comme une technique de transfert de gènes dans les plantes, car la présence de la paroi cellulaire faite de transfection difficile en utilisant des méthodes préexistantes 1. De même, biolistique a gagné en popularité dans le domaine de la neurobiologie depuis neurones post-mitotiques sont notoirement difficiles à transfecter 2,3. En particulier, il est largement reconnu comme principe de la technique pour être utilisés dans des expériences visant à évaluer la morphologie fine de neurones isolés dans les tranches de cerveau intact. Les méthodes décrites ici fournissent une explication détaillée et exhaustive de la façon d&#39;effectuer la transfection biolistique des tranches de cerveau de culture en utilisant une main du gène-gun (le système Hélios Gene Gun; Bio-Rad). Transfection biolistique est devenu la méthode privilégiée pour la transfection de neurones en culture tranche, car il permet la transfection d&#39;un certain nombre de cellules éparses à travers la tranche du cerveau. De cette façon, les neurones individuels peuvent être examinés isolément. Comme cette technique est particulièrement bien adapté pour la transfection de neurones dans le cerveau tranche, il est souvent utilisé en conjonction avec deux microscopie biphotonique, puisque la visualisation 2-photons d&#39;excitation permet de cellules marquées par fluorescence profonde dans le tissu diffusion de la lumière 4. En effet, les images à fort grossissement de la seule neurones pyramidaux présentées tout au long de cette vidéo ont été capturées à l&#39;aide d&#39;une coutume microscope intégré au laser 2-photons numérisation. En conclusion, la transfection biolistique est un moyen efficace de transfecter des cellules individuelles dans le contexte d&#39;une forte densité de cellules environnantes, et comme tel s&#39;est avéré extrêmement utile pour l&#39;étiquetage fluorescence neurones individuels dans la culture tranche de neurones.

Bien que nous avons listé tous les produits séparément, il est plus économique d&#39;acheter &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, qui comprend tous les produits de Bio-Rad énumérés ci-dessus (cat # 165-2431).

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

Transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules en bombardant avec des tissus de haute vitesse de l&#39;ADN des particules enrobées. Nous fournissons un protocole détaillé pour la transfection biolistique de coupes d&#39;hippocampe de rat, de la préparation initiale des balles revêtus d&#39;ADN à la fusillade finale de la culture organotypique utilisant un canon à gènes. Transfection pistolet à gènes est un moyen efficace et facile de transfecter des neurones et est particulièrement utile pour l&#39;étiquetage par fluorescence un petit nombre de cellules dans les tissus tranche. Dans cette vidéo, nous avons d&#39;abord un aperçu des étapes nécessaires à la couche de particules d&#39;or avec l&#39;ADN. Nous avons ensuite montrer comment tapissent l&#39;intérieur du tube en plastique avec des balles d&#39;or / ADN, et la façon de couper ce tuyau pour obtenir les cartouches en plastique pour les charger dans le pistolet à gènes. Enfin, nous effectuons la transfection biolistique des cultures rat tranche de l&#39;hippocampe, ce qui démontre la manipulation de l&#39;Bio-Rad Helios canon à gènes, et offrant des conseils de dépannage pour obtenir des tranches de tissu sain et optimal transfectées.

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Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Nous décrivons une méthode pour la préparation de l&#39;ADN des balles d&#39;or revêtues et de démontrer l&#39;utilisation de ces balles à biolistically transfecter des neurones en culture des coupes d&#39;hippocampe.

Préparation de balles pistolet à gènes et transfection biolistique des neurones en culture Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Biology

52.2K vues.  University of California, Davis. Nous décrivons une méthode pour la préparation de l'ADN des balles d'or revêtues et de démontrer l'utilisation de ces balles à biolistically transfecter des neurones en culture des coupes d'hippocampe.

Vidéo: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Préparation tranche horizontale de la rétine

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Recherche

Biologie

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun transfection de neurones de l&#39;hippocampe

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Culture organotypique des cerveaux de rat E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Préparation et entretien des neurones ganglions de la racine dorsale dans les cultures à compartiments

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolement et culture de cellules de la zone néphrogénique du rein d&#39;embryon de souris

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.