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<html> I. Préparation pour l&#39;injection Cette section décrit les étapes de préparation qui doivent être prises avant l&#39;injection d&#39;ADNc dans le noyau des neurones. La procédure d&#39;isolement pour les neurones est au-delà de la portée de cet article, mais il est important d&#39;avoir les neurones dissociés en cellules individuelles et adhère bien à la surface inférieure de 35 mm plats de culture de cellules (voir discussion pour des conseils utiles pour atteindre cet objectif). Bien qu&#39;une variété de différents neurones pourrait potentiellement être utilisé, les ganglions périphériques tels que les ganglions cervicaux supérieurs (GCS) ou les ganglions rachidiens sont préférés pour la dissection, car ils sont facilement accessibles et le rendement d&#39;un grand nombre de neurones. Autres avantages de l&#39;utilisation de neurones SCG sont qu&#39;ils sont une population relativement homogène de cellules et bien caractérisés 1,2,3,4. A. Préparation du plasmide d&#39;ADNc pour l&#39;injection <ol><li> Pour éviter la contamination ou de panne de l&#39;ADN, les gants doivent être portés lors de la préparation. </li><li> ADN codant pour la protéine d&#39;intérêt est sous-cloné dans un vecteur d&#39;expression mammifère approprié, tel que pCI (Promega, Madison, WI), sous le contrôle du cytomégalovirus (CMV) fortement et constitutivement active. Si la protéine n&#39;est pas étiqueté, un plasmide rapporteur, EGFP encodage par exemple (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), est co-injecté pour confirmer l&#39;injection de succès et d&#39;expression. L&#39;ADN est isolé en utilisant une colonne de grande qualité de séparation (par exemple QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) et purifiée en utilisant une unité centrifuge filtre avec un filtre en PVDF (0,1 um, Millipore, Bedford, MA) pour éliminer les particules dans le préparation de plasmide, qui peut obstruer pipettes d&#39;injection au cours du processus d&#39;injection. Les plasmides sont conservés à -20 ° C à une concentration d&#39;environ 1 ug / ul dans un tampon de stockage d&#39;ADN appropriés (par exemple tampon TE: Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). </li><li> Immédiatement avant la microinjection, ADNc plasmidique sont dilués et mélangés à la concentration finale désirée dans un tampon TE ou H 2 O. Typiquement, 5-10 ng / ul du gène rapporteur est suffisante pour marquer les cellules injectées, et la concentration totale de l&#39;ADNc à injecter ne doit pas dépasser 200 ng / ul car l&#39;ADN est visqueux à des concentrations élevées et peuvent obstruer les pipettes d&#39;injection. Un petit volume d&#39;ADNc pour injection (ul 5-10) est préparé par des gouttes de mélange de solution sur la surface propre d&#39;un petit morceau de Parafilm (côté sous le support papier). Mélanger les gouttes d&#39;une solution ensemble par pipetage de haut en bas plusieurs fois avec un pipetor et éviter d&#39;introduire des bulles d&#39;air lors du mélange. </li><li> En utilisant une pipette microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), transférer la solution d&#39;ADNc dans un tube à hématocrite spécialement préparé (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Voir la section des matériaux pour des instructions sur la préparation des tubes à hématocrite (Tableau Matériaux). Placer le tube à hématocrite contenant la solution d&#39;injection d&#39;ADNc dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger le tube pendant 15-30 min à 10 000 g dans une microcentrifugeuse équipée d&#39;un rotor à godets à angle fixe ou pivotant (Eppendorf), à température ambiante (20-24 ° C) aux particules de sédiments dans la solution d&#39;ADNc qui peut bloquer le microinjection pipette. La solution d&#39;injection d&#39;ADNc peut être conservé à température ambiante pendant la séance d&#39;injection. </li></ol> B. La fabrication des pipettes d&#39;injection <ol><li> Pipettes en verre jetable microinjection sont disponibles commercialement (par exemple Femtotips, Eppendorf), qui sont pratiques mais coûteux (10 $ par microinjection pipette). Pipettes d&#39;injection peuvent être fabriqués en laboratoire en utilisant un P-97 programmable extracteur Flaming pipette Brown (Sutter Instrument Company, Novato, CA) et filamenté, à parois minces tubes de verre borosilicate capillaire (instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride). Cette option est plus rentable et permet de contrôler la forme et la taille de la pipette de micro-injection. </li><li> Un programme en deux étapes est utilisée pour tirer étroite embouts de pipettes microinjection. Depuis l&#39;ouverture de pipettes microinjection est trop étroit pour examiner sous un microscope optique, la qualité des pipettes d&#39;injection doivent être évalués directement par l&#39;injection de quelques cellules avant que les paramètres du programme sont finalisés. Les paramètres suivants sont approximatifs pour les réglages de la chaleur, tirer, la vitesse et le temps: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Ces paramètres varient en fonction de différents lots de verre et par l&#39;état du filament de chauffage dans l&#39;extracteur, et doit être ajustée au besoin. Pour plus de détails, voir 5. </li><li> Tirez plusieurs pipettes d&#39;injection (2-5) par plat de neurones à injecter, en cas de dommages ou de problèmes lors de la séance d&#39;injection. Pipettes d&#39;injection Conserver dans un récipient couvert pour empêcher la poussière de pénétrer dans l&#39;embout de la pipette de micro-injection. </li></ol> II. Microinjection intranucléaire tente »&gt; Cette section détaille le processus de l&#39;injection d&#39;ADNc dans le noyau des neurones. Une microinjection de configuration de base comprend un contraste de phase inversée microscope (Nikon par exemple Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) de visualiser le processus, micromanipulateur (par exemple Eppendorf 5171) pour contrôler le mouvement de la pipette d&#39;injection et une pression (par exemple Eppendorf FemtoJet Express) injecteur d&#39;expulser la solution d&#39;ADNc de la pipette. Raccordement de l&#39;injecteur de pression pour le micromanipulateur permet la synchronisation de ces deux derniers processus au cours des injections. Autres facultative, mais fortement recommandée, les composants comprennent un système de surveillance vidéo montée (caméra CCD, Cohu Inc, San Diego, CA; noir et blanc du moniteur vidéo, Sony Corporation, Tokyo, Japon). Ce système n&#39;est pas une exigence absolue pour les injections; Cependant, le moniteur noir et blanc offre un contraste élevé pour une meilleure visualisation du noyau cellulaire et offre une expérience de visualisation plus confortable pendant les séances d&#39;injection de long. De plus, un ordinateur portable exécutant un logiciel d&#39;exploitation d&#39;un contrôleur à main peut être utilisée à semi- automatiser le processus d&#39;injection (voir discussion pour plus de détails). Le moment idéal pour injecter de neurones CTB est de 3-6 heures après la dissociation. A ce stade, les cellules sont sphériques, bien attaché au fond du plat, et le noyau est nettement visible, sous un microscope à contraste de phase, comme un organite central rond avec une membrane noire, contenant un seul ou plusieurs nucléoles (figure 1A). <ol><li> Placez un plat de neurones dissociés sur le centre de la platine du microscope. Réglez la mise au point et optimiser l&#39;optique à contraste de phase du microscope de sorte que le noyau des neurones sont clairement visibles. </li><li> Pipeter 2 ul de solution d&#39;ADNc préparé dans une pipette de microinjection utilisant une pipette microloader. Évitez élaboration solution proche de la partie inférieure du tube hématocrite, car cela pourrait réveiller les particules qui se sont installés pendant la centrifugation. Le filament de la microinjection pipettes devrait aider à l&#39;élaboration solution à la pointe, mais si petites bulles d&#39;air persistent, tapotez doucement le côté du verre pour les déloger. </li><li> Insérez la pipette de micro-injection dans le support de l&#39;injecteur capillaire pression, puis fixer le support à l&#39;micromanipulateur. Le support est fixé à un angle de 45 °. </li><li> Abaissez la pipette de micro-injection dans le plat. Comme la pipette entre le milieu de culture, un ménisque se forme qui affecte la réfraction de la lumière et réduit la qualité d&#39;image des neurones. Pour pallier ce problème, la tourelle anneau de phase peut être légèrement décalée jusqu&#39;à ce que le noyau des neurones sont clairement visibles à nouveau. </li><li> Certains systèmes ont une pression d&#39;injection &quot;propre&quot; fonction qui applique une pression maximale de l&#39;air de la pipette de micro-injection pour une courte durée. Utilisez cette fonction pour effacer la pipette de débris avant de commencer et pendant les injections si la pointe apparaît bouché. Si du liquide dissipé n&#39;est pas visible sur l&#39;écran tout en utilisant cette fonction, le remplacer par une pipette d&#39;injection neuf. </li><li> Centre de la pipette de micro-injection dans le moniteur de visualisation et d&#39;aligner la pointe à côté d&#39;un neurone et dans le même plan focal que le nucléole. Réglez cette position inférieure de l&#39;axe z limite sur le micromanipulateur. Cette position est la profondeur de la pipette de micro-injection se qualifieront pour les injections au cours. Maintenant la position de la pointe d&#39;environ 30 um dessus de ce point afin de la pipette de microinjection efface le haut de neurones. </li><li> Le &quot;injecter&quot; une mode de Eppendorf 5171 micromanipulateur peut être définie avec les paramètres suivants pour effectuer des injections intranucléaires. La fonction d&#39;injecter est activée, tandis que la fonction empaler est laissé. Un chemin d&#39;injection diagonale (le long du x et l&#39;axe z) produit le moins de dommages aux cellules, et donc le mode axial doit être utilisé pour les injections. Une vitesse d&#39;injection de 300 um / s est suffisant, et de synchroniser la montée en pression lorsque la pipette de micro-injection atteint l&#39;ensemble axe z limite. </li><li> L&#39;injecteur de pression contrôle la quantité de solution d&#39;ADNc injecté dans le noyau. Dans le mode d&#39;injection «automatique», la livraison de l&#39;ADN est contrôlée dans le temps et initiée par le micromanipulateur connecté. La pression d&#39;injection (Pi) devrait être fixé entre 100 et 200 hectopascals (hPa; 1 hPa ~ 0.015 psi); des pressions d&#39;injection plus élevée n&#39;améliore pas le taux de réussite ou la qualité des injections et peut indiquer d&#39;autres problèmes avec la taille de la pointe de micro-injection pipette ou de l&#39;ADN pureté . Une durée d&#39;injection (ti) de 0,3 s et une pression de compensation (Pc) de 30 hPa, ce qui fournit une pression positive constante pour éviter l&#39;entrée de l&#39;occlusion des particules du milieu de culture dans l&#39;embout de la pipette, devrait être utilisé. </li><li> Position du neurone à être injecté sous la pointe de la pipette de micro-injection en utilisant le contrôle du microscope XY de l&#39;axe. Aligner l&#39;extrémité de la pipette au-dessus du centre du noyau en se concentrant avant et en arrière entre tIl pointe et les nucléoles. </li><li> Injecter le noyau en appuyant sur le bouton d&#39;injecter (sur le micromanipulateur). Pour l&#39;étape d&#39;injection, le mouvement de la pipette de micro-injection et le déversement d&#39;une solution d&#39;ADNc sont contrôlés par le micromanipulateur. Il est difficile de confirmer succès injections intranucléaires à l&#39;œil nu, mais l&#39;injection de la solution de viscosité relativement faible d&#39;ADNc (par rapport à l&#39;environnement visqueux nucléaire), apparaît souvent comme un panache blanc à contraste de phase optique et peut être utilisé comme un indicateur de l&#39;injection dans le noyau. Parfois, la pipette de micro-injection ne pénètre pas la membrane nucléaire et pousse simplement le noyau. Une tentative de deuxième injection à la même position peut conduire à une injection réussie d&#39;ADN dans le noyau. Gonflement de la cellule est généralement un indice de l&#39;injection cytoplasmique involontaire. En outre, gonflement significatif nucléaire n&#39;est pas bien toléré par les neurones et entraîne généralement la mort cellulaire peu après, ainsi, la pression d&#39;injection et la durée ne doit pas dépasser les valeurs suggérées. </li><li> Continuer injectant des neurones en repositionnant la platine du microscope pour aligner le neurone suivant sous la pipette de micro-injection. Systématiquement naviguer dans le plat à injecter approximativement 50-100 noyaux avant de retourner le plat de neurones dans l&#39;incubateur pour une nuit d&#39;incubation. Réussir neurones injectés peuvent être identifiés le jour suivant par l&#39;expression du gène rapporteur. </li></ol> III. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: cervical supérieur ganglionnaires (CTB) neurones. L&#39;image en contraste de phase de la SCG neurones 3 heures après la dissociation (A). A ce stade, le noyau est nettement visible qui aide l&#39;alignement de la pointe de pipette de microinjection. Le noyau apparaît au centre de neurones avec un seul (à gauche) ou plusieurs (à droite) nucléoles sombre. CTB neurones 16 heures suivant l&#39;injection d&#39;ADNc EGFP dans le noyau (B). Gauche, CTB neurones vue sous un éclairage en contraste de phase. A droite, l&#39;image de l&#39;épifluorescence mêmes neurones montrant l&#39;injection réussie et résultant en une expression de l&#39;EGFP neurone. Barre d&#39;échelle blanc est de 20 um. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Figure 2" border="0" /> Figure 2: cellules entières enregistrements des courants qui traversent hétérologue-exprimé couplés aux protéines G intérieurement rectifier K + (GIRK) chaînes de neurones SCG. GIRK courants (I GIRK) ont été évoqués par une rampe de tension 200 ms de -140 à 40 mV à partir d&#39;un potentiel de maintien de -60 mV (en médaillon de A) après l&#39;activation du endogènes α 2-adrénergiques par la norépinéphrine (NE, 10 uM) . Des traces superposées sont des enregistrements du même neurone et indiquer avant (noir) et après l&#39;application des deux seuls NE (bleu) ou NE plus 10 mm Ba 2 + (rouge). Les lignes pointillées indiquent le niveau zéro de courant. Pour l&#39;enregistrement, je GIRK, la solution externe contenue (en mm) 130 NaCl, 5,4 KCl, HEPES 10, 10 CaCl 2, MgCl 2 0,8, 15 de glucose, le saccharose 15, et 0,0003 TTX, ajusté à pH 7,4 avec NaOH. La solution d&#39;enregistrement interne contenue (en mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, MgCl 2 2, 10 HEPES, 4 MgATP, et 0,3 Na 2 GTP, ajusté à pH 7,2 avec KOH. Le manque de courant provoquée par la rampe de tension en présence du NE dans les neurones SCG non-injecté (A) montre que les neurones SCG n&#39;expriment pas les chaînes GIRK endogène. D&#39;injection réussie d&#39;ADNc codant pour une fonctionnelle plasmide GIRK canal 11 donne lieu à des courants importants pendant la rampe de tension lorsqu&#39;ils sont exposés à NE (B, gauche). Les courants ont les caractéristiques typiques des courants à travers les canaux GIRK: activation par un agoniste des récepteurs aux protéines G couplées (NE), rectification entrante, et de bloquer des courants par le bloqueur des canaux GIRK putatif, Ba 2 + (B, oligo-rouge de droite). Les cercles vides et remplis représentent j&#39;ai GIRK dans l&#39;exploitation et courant crête, respectivement. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2.

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

Les problèmes communs rencontrés et suggestions: Comme mentionné précédemment, le succès des injections nucléaires dépendent de la présence des cellules adhérentes à des plaques de culture de tissus. Retarder le début des injections de quelques heures suivant la procédure dissociation cellulaire permet aux neurones de se conformer au fond des plats. En outre, les plats revêtement avec 0,1 mg / ml de poids moléculaire élevé de poly-L-lysine (Sigma, St. Louis, MO) l&#39;adhérence de neurones aides à la surface inférieure de plats. Le blocage des pipettes microinjection, surtout lorsque l&#39;on tente d&#39;injecter une forte concentration de l&#39;ADN, peut être un problème fréquent. L&#39;utilisation de haute qualité de colonnes de séparation pour isoler et purifier l&#39;ADN plasmidique, et d&#39;effectuer les étapes de purification supplémentaires mentionnés (filtres spin, tourner dans des tubes à hématocrite) peut aider à éliminer les particules avant l&#39;injection. Pendant les injections, le «propre» en fonction de la pression de l&#39;injecteur peut être utilisé (pour 0,2 s est suffisant), mais si cela ne résout pas le problème, une pipette nouvelle injection doit être utilisée. Si la majorité des pipettes microinjection s&#39;obstruer lors d&#39;une séance d&#39;injection, envisager de modifier les paramètres de l&#39;extracteur pipette de verre pour produire embouts de pipettes microinjection avec une plus grande ouverture. Une autre question qui se pose lors des injections nucléaire est l&#39;irrégularité de la surface de fond de boîtes de culture tissulaire. Cette variabilité influe directement sur la précision du ciblage des embouts de pipettes d&#39;injection dans le noyau depuis la profondeur de la pipette traverse lors des injections est fixé. Par conséquent, cette limite axe z doivent être ajustés au cours des injections dans le même plat. Il sera évident lorsqu&#39;un ajustement est nécessaire: il n&#39;y aura pas d&#39;indication de l&#39;injection nucléaire (pas de panache blanc dans le noyau ou la cellule est entièrement manqué), ou l&#39;embout de la pipette d&#39;injection est proche du fond du plat (en comprimant la cellule ou même s&#39;écraser la pointe de pipette dans le fond du plat). Verre-clonage cylindres (. OD 10 mm, no 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, NJ) peut être utilisé pendant le placage de neurones à les restreindre dans un petit espace plus confiné, donc en minimisant la distance nécessaire pour déplacer la pipette d&#39;injection entre les injections. Ces cylindres de clonage sont retirés avant de procéder à des microinjections. Inconvénients de la technique: Microinjections intranucléaires sont techniquement exigeantes, qui exigent de la patience et un haut degré de dextérité manuelle par l&#39;opérateur. Maîtrise avec cette technique, comme avec n&#39;importe quelle autre compétence, vient avec la pratique. Ainsi, il est conseillé de pratiquer des injections nucléaires du gène rapporteur seuls avant de tenter des expériences réelles. Afin d&#39;aider davantage le processus d&#39;injection, il peut être possible de consolider les étapes du micromanipulateur et la pression d&#39;injection dans un programme informatique. Des programmes tels que Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) peut être utilisée pour stocker les paramètres de la micro-injection et de programmer les contrôleurs multifonctions (ShuttlePro, Contour Design, Windham, NH) de semi-automatiser le processus d&#39;injection (voir 6,7,8 pour les plus de détails). Un autre inconvénient de la technique de micro-injection intranucléaire est le faible taux de réussite. Environ 10-20% des tentatives d&#39;injections nucléaires conduisent à l&#39;expression des protéines. Alors que cette efficacité peut être suffisant pour les applications qui ne nécessitent pas un grand nombre de cellules exprimant, électrophysiologie, par exemple, pour les différents dosages biochimiques cela peut ne pas être suffisant. Applications de la technique: Malgré ses inconvénients, la microinjection intranucléaire de l&#39;ADN est une technique extrêmement utile pour hétérologue exprimant des protéines dans les neurones. Des niveaux élevés d&#39;expression de protéines sont obtenus avec microinjections nucléaire en raison du grand nombre de plasmides libérée dans le noyau lors des injections, un promoteur très actif CMV régulation de la transcription des gènes, et la stabilité à long de plasmides dans le noyau. Protéines sur-expression est particulièrement utile dans dominante négative des expériences où des niveaux élevés de protéines hétérologues sont requis pour submerger la protéine endogène. Un autre avantage de intranucléaires injections est la capacité à fournir une proportion constante de constructions d&#39;ADNc dans le noyau lors des constructions multiples sont injectés. Avec d&#39;autres méthodes de transfection, il est difficile d&#39;introduire de façon reproductible la même proportion de chaque construction d&#39;ADN dans les cellules différentes dans le même plat et entre les transfections. L&#39;injection directe de la solution d&#39;ADNc dans le noyau élimine cette source de variabilité et permet au ratio de protéines exprimées à être titré de manière efficace. Méthodes de transfection traditionnelles ont une efficacité limitée dans les cellules post-mitotiques raison de l&#39;incorporation à faible de l&#39;ADN dans le noyau 9 et toxicité des produits chimiques associés à REAG transfectionents 10. Microinjections nucléaire surmonter ces problèmes en introduisant du matériel génétique mécaniquement dans le noyau. Bien que cette technique est plus complexe, la possibilité d&#39;étudier l&#39;effet d&#39;une protéine dans un système biologique fonctionnel, complet avec les voies de signalisation endogènes, fait plus que compenser le caractère laborieux de cette technique. Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les National Institutes of Health Guide de protection des animaux et d&#39;utilisation.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

Cultures primaires de cellules neuronales sont des outils précieux pour étudier la fonction des protéines, car ils représentent un système plus biologiquement pertinente par rapport aux lignées cellulaires immortalisées. Cependant, la nature post-mitotique de neurones primaires empêche efficacement l&#39;expression des protéines hétérologues en utilisant des procédures communes telles que l&#39;électroporation ou chimiquement transfection médiée. Ainsi, d&#39;autres techniques doivent être utilisées afin d&#39;exprimer efficacement des protéines dans ces cellules ne se divisent pas. Dans cet article, nous décrivons les étapes requises pour effectuer des injections intranucléaire de constructions ADNc dans dissocié adulte neurones sympathiques. Cette technique, qui a été appliqué à différents types de neurones, peuvent réussir à induire l&#39;expression de protéines hétérologues. Le matériel indispensable pour la procédure de micro-injection comprend un microscope inversé de visualiser les cellules, une pipette d&#39;injection en verre rempli d&#39;une solution d&#39;ADNc qui est connecté à un N 2 (g) le système de livraison de pression, et d&#39;un micromanipulateur. Le micromanipulateur coordonne le mouvement injection d&#39;une pipette de microinjection avec une brève impulsion de pression de N 2 pour éjecter solution d&#39;ADNc de la pointe de la pipette. Cette technique n&#39;a pas la toxicité associée à de nombreuses méthodes de transfection et permet d&#39;autres constructions d&#39;ADN multiples d&#39;être exprimée à un taux uniforme. Le faible nombre de cellules injectées rend la procédure microinjection bien adapté pour les études de la cellule unique, comme les enregistrements électrophysiologiques et d&#39;imagerie optique, mais peut-être pas idéal pour les dosages biochimiques qui exigent un plus grand nombre de cellules et des efficacités de transfection supérieur. Bien microinjections intranucléaires nécessitera un investissement de l&#39;équipement et le temps, la capacité à atteindre des niveaux élevés d&#39;expression de protéines hétérologues dans un environnement physiologiquement pertinents rend cette technique un outil très utile pour étudier la fonction des protéines.

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Injection directe intranucléaire d&#39;ADNc est une technique de transfection efficaces pour les cellules post-mitotiques. Cette méthode fournit des niveaux élevés d&#39;expression de protéines hétérologues dans un ou plusieurs des constructions d&#39;ADNc et la fonction des protéines permet d&#39;être étudiée dans un environnement physiologiquement pertinents avec une variété de dosages seule cellule.

Microinjection d&#39;ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

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Biology

16.8K vues.  National Institutes of Health (NIH). Injection directe intranucléaire d'ADNc est une technique de transfection efficaces pour les cellules post-mitotiques. Cette méthode fournit des niveaux élevés d'expression de protéines hétérologues dans un ou plusieurs des constructions d'ADNc et la fonction des protéines permet d'être étudiée dans un environnement physiologiquement pertinents avec une variété de dosages seule cellule.

Vidéo: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

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Biologie

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

Transfection d&#39;ADN des mammifères muscles squelettiques à l&#39;aide In Vivo L&#39;électroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

L&#39;analyse de l&#39;ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.