Nos recherches portent principalement sur le lien entre la réparation de l’ADN et le vieillissement. Plus précisément, nous examinons différents troubles de la laminopathie et nous voulons savoir comment ils peuvent avoir un impact sur la réparation de l’ADN. Nous avons démontré qu’un trouble de laminopathie associé à un vieillissement prématuré et à une courte durée de vie, connu sous le nom de syndrome de progéria de Hutchinson-Gilford, est en fait associé à une augmentation des dommages à l’ADN et à une réparation imprécise de l’ADN.
Notre laboratoire aimerait étudier l’effet des thérapies potentielles pour les patients atteints de laminopathie afin de savoir si ces approches auront également un impact positif sur la réparation et les dommages à l’ADN. Pour commencer, placez une gaine dans chaque puits d’une plaque stérile à 6 puits à l’aide d’une pince. Ajoutez deux millilitres de Dulbecco’s Modified Eagle Medium, ou DMEM, dans chaque puits de la plaque à 6 puits.
Aspirez le milieu des cellules HeLa cultivées dans le ballon et lavez les cellules en ajoutant 15 millilitres de PBS. Faites tourner doucement le ballon pour laver les cellules, aspirez le PBS et ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA pour enrober les cellules. Placez le flacon recouvert de trypsine dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant deux minutes pour permettre aux cellules de se détacher.
Ajoutez ensuite huit millilitres de DMEM supplémenté dans le flacon contenant les cellules trypsinisées et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour séparer les cellules agglomérantes. Recueillir la suspension cellulaire du ballon dans un tube en polystyrène de 15 millilitres. Après avoir compté les cellules, ajoutez 500 000 cellules goutte à goutte directement sur chacune des lamelles de la plaque à 6 puits.
Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pour permettre aux cellules de se développer pendant la nuit. Pour la fixation cellulaire, aspirez le milieu des puits de la plaque à 6 puits le lendemain. Ajoutez deux millilitres de PBS dans chaque puits pour laver les cellules et aspirez complètement tout le PBS des puits.
Ajoutez ensuite deux millilitres de solution de formaldéhyde à 4 % dans chaque puits pendant 10 minutes à température ambiante et aspirez complètement la solution des puits. Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution de perméabilisation dans chaque puits. Laissez la solution reposer pendant 10 minutes à température ambiante, puis aspirez-la complètement.
Lavez les cellules trois fois avec deux millilitres de PBS dans chaque puits. Aspirez complètement après chaque lavage. Une fois que tout le PBS est aspiré des puits, ajoutez deux millilitres de tampon de diluant d’anticorps, ou ADB, dans chaque puits pour bloquer les cellules pour la coloration par immunofluorescence.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes en secouant doucement l’orbite. Vers la fin de la période de blocage. Préparez la dilution primaire de l’anticorps en mélangeant la lumière B1 et les anticorps à ADN double brin dans l’ADB.
À la fin de l’incubation, aspirez l’ADB des puits. Collez un morceau de film de paraffine sur une surface plane, en vous assurant que la zone est suffisamment grande pour accueillir tous les lamelles en cours de traitement. Pour chaque lamelle, pipetez 75 microlitres de dilution de l’anticorps primaire sur le film de paraffine en évitant toute bulle.
À l’aide d’une pince, placez chaque glissière de couverture, côté cellule vers le bas, sur la gouttelette d’anticorps. Couvrez les lamelles d’incubation avec le couvercle de la plaque à 6 puits et laissez les lamelles incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez soigneusement les lamelles de couverture du film de paraffine et remettez-les dans la plaque à 6 puits avec le côté de la cellule vers le haut.
Lavez les lamelles en les secouant trois fois pendant cinq minutes avec deux millilitres de PBST. Lors du lavage final, préparez la dilution secondaire des anticorps. Après le dernier lavage, aspirez complètement le PBST.
Ajoutez l’anticorps secondaire au film para et placez les lamelles sur le film de paraffine, côté cellule vers le bas. Placez ensuite un couvercle de protection léger sur les cales pour protéger les cellules de la lumière et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement les lamelles de couverture du film de paraffine et remettez-les dans la plaque à 6 puits, en vous assurant que le côté de la cellule est orienté vers le haut, puis déshydratez les lamelles en ajoutant séquentiellement deux millilitres de 70 % 90 % et 100 % d’éthanol dans les puits, en laissant chaque solution reposer pendant une à deux minutes avant de la retirer.
À l’aide d’une pince, retirez les lamelles des puits et placez-les sur une lingette non pelucheuse pour les faire sécher à l’air libre, à l’abri de la lumière. Montez les lamelles côté cellule vers le bas sur des lames de microscope en verre à l’aide de 20 microlitres de support de montage par lamelle. La bulle nucléaire était plus fréquente dans les cellules HeLa ZMPST24 knock-out, avec environ 50 % des noyaux présentant des bulles, contre 17 % dans les cellules témoins HeLa.
Une fuite d’ADN a été observée principalement dans les cellules HeLa ZMPSTE24 knock-out, tandis qu’aucune fuite d’ADN n’a été observée dans les cellules de contrôle HeLa, une fuite d’ADN s’est produite dans certaines cellules knock-out ZMPSTE24, même en l’absence de bulle nucléaire visible.
