Nous essayons de déterminer la meilleure méthode à utiliser pour prédire la signification des anticorps anti-globules rouges. L’essai monocyte-macrophage semble être plus sensible que l’essai monocouche monocytaire. La question à laquelle nous essayons de répondre est donc de savoir si le test monocyte-macrophage est un meilleur test pour prédire la signification des anticorps anti-globules rouges, meilleur que le test monocouche monocytaire.
Les défis expérimentaux liés à la fois au test monocouche de monocytes et au test monocyte-macrophage consistent à optimiser leur efficacité pour permettre une réalisation plus rapide, tout en éliminant la nécessité d’une évaluation manuelle de la phagocytose. En d’autres termes, le défi consiste à essayer de semi-automatiser ces tests. Le test monocouche de monocytes, dont j’ai été le pionnier en 1980, est utilisé régulièrement par le laboratoire de référence en immunohématologie depuis 1983 pour aider à décider quels auto-anticorps ou allo-anticorps de globules rouges ont le potentiel de provoquer une hémolyse lorsque le sang d’un donneur est transfusé à des patients ayant ces anticorps.
Ainsi, le MMA utilise des monocytes dans le test, mais l’hémolyse médiée par les anticorps est généralement causée par les macrophages de la rate ou du foie. Nous explorons donc ici si l’utilisation de macrophages primaires dans ce test serait meilleure que celle des monocytes en tant que prédicteurs de la signification clinique potentielle des anticorps. Il serait souhaitable d’essayer de rendre le dosage monocyte-macrophage plus convivial, plus rapide et ne nécessitant pas de microscopie optique, mais peut-être un mécanisme automatisé de lecture de la phagocytose.
Pour commencer, diluez le sang entier avec le milieu complet RPMI-1640 et superposez-le sur un milieu à gradient de densité pour la centrifugation. Après la centrifugation, récupérer la couche leucocytaire contenant les cellules mononucléées du sang périphérique ou PMBC. Après avoir granulé les PBMC obtenus, mettez-les en suspension dans 10 millilitres de RPMI-1640 Complete Medium préchauffé.
Déterminez le numéro de cellule à l’aide de l’équipement approprié avant de commencer le processus d’isolement des monocytes. Suivez les instructions du kit d’isolement des monocytes et transférez l’échantillon dans un tube de propylène de taille appropriée. Ajouter le cocktail d’enrichissement à l’échantillon à une concentration de 50 microlitres par millilitre de l’échantillon.
Après avoir pipeté l’échantillon de haut en bas, agitez-le pour bien mélanger et incubez l’échantillon à deux à huit degrés Celsius pendant 10 minutes dans un seau à glace. Maintenant, faites vortex les particules magnétiques pendant 30 secondes pendant cette période d’incubation. Après l’incubation, ajoutez des particules magnétiques à l’échantillon à une concentration de 100 microlitres par millilitre d’échantillon.
Vortex l’échantillon et incubez-le à deux à huit degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite le milieu isolant pour augmenter le volume à 2,5 millilitres ou 10 millilitres selon les besoins, à l’aide d’une pipette graduée, et mélangez. Ensuite, placez le tube de propylène sans son couvercle dans l’aimant et incubez à température ambiante pendant environ 2,5 minutes.
Ensuite, prenez l’aimant et inversez-le en un mouvement continu pour verser la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 5 ou 14 millilitres. Remettez en suspension les cellules isolées dans le milieu RPMI-1640. Pour commencer, ajoutez cinq millilitres de solution de poly-D-lycine dans un flacon de 25 millilitres pour chaque population de macrophages, M1 et M2, et laissez les flacons dans le capot pendant au moins une heure.
Après avoir déterminé le nombre de cellules, ajoutez cinq millilitres de milieu RPMI-1640, puis ensemencez entre une et cinq fois, 10 à la puissance de six monocytes dans chaque flacon précodé de 25 millilitres. Incuber le ballon à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins deux heures. Après la période d’incubation, laver le ballon une fois avec du PBS et deux fois avec du milieu RPMI-1640 complet.
Ajoutez 10 millilitres de milieu de différenciation M1 ou M2 dans le ballon selon le type de cellule souhaité, et laissez les cellules se différencier dans l’incubateur pendant six jours à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le sixième jour, ajoutez cinq millilitres de milieu de polarisation M1 ou M2 dans chaque fiole au besoin. Laissez les macrophages se polariser dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins deux jours.
Avant de récolter les macrophages M1 ou M2 le huitième jour, recueillez le surnageant dans un tube de 15 millilitres pour une utilisation ultérieure, si nécessaire. Ajouter un millilitre de solution de décollement cellulaire dans la fiole et incuber. Pour arrêter la réaction, ajoutez trois millilitres de milieu RPMI-1640 complet dans le ballon et recueillez le milieu dans un tube de 15 millilitres.
Après avoir ajouté trois millilitres supplémentaires de fluide dans le flacon, utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules du bas. Collectez les cellules détachées dans un tube frais de 15 millilitres. Pour déterminer la qualité des macrophages M1 et M2, lavez les cellules deux fois avec du PBS et remettez-les en suspension dans le milieu RPMI-1640 complet à 0,5 fois, 10 à la puissance de six cellules par tube.
Ensuite, analysez les deux populations de cellules à l’aide d’un test de cytométrie en flux. Compter les macrophages M1 et M2 obtenus à l’aide d’un hémocytomètre dans un rapport de coloration biunivoque avec du bleu trypan. Reconstituez les macrophages à une concentration de 1 fois 10 à la puissance six cellules par millilitre dans le milieu complet RPMI-1640.
À l’aide d’une micro-pipette, ensemencez 400 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits de la lame de la chambre à huit puits et incubez la lame à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 1,5 heure dans un incubateur de culture de tissus entièrement humidifié. Pour laver les globules rouges R2R2 à RhD positif, ajoutez du PBS à pH 7,4 dans les cellules et centrifugez l’échantillon à 350 G pendant cinq minutes. Après deux autres lavages de ce type, opsonisez l’échantillon de RBC de test avec les anticorps d’intérêt.
Incuber les globules rouges opsonisés et non opsonisés par anticorps à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Agiter par intermittence toutes les 15 minutes pour empêcher les globules rouges de se déposer. Ensuite, lavez les globules rouges opsonisants trois fois avec du PBS à pH 7,4, comme démontré précédemment.
Pour vérifier l’opsonisation des globules rouges, effectuez un test d’antiglobuline indirect avec un anticorps anti-opsonisant humain secondaire à l’anticorps opsonisant primaire. Après avoir lu le test d’antiglobuline indirecte, reconstituer des RHD opsonisés lavés et des globules rouges R2R2 dans une suspension volume par volume à 1,25 % avec le milieu complet RPMI-1640. Après 1,5 heure d’incubation des macrophages M1 et M2, aspirer et jeter doucement le milieu surnageant le long du coin du puits.
Ajoutez ensuite 400 microlitres du mélange de globules rouges à 1,25 % dans chaque puits de la configuration en trois exemplaires. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures sans être dérangé. Versez maintenant 100 millilitres de PBS à pH 7,4 dans deux béchers.
Immergez la glissière dans le premier bécher et déplacez-la lentement d’avant en arrière pendant 20 à 30 coups. Ensuite, transférez la diapositive dans le deuxième bécher et lavez pendant 20 à 30 coups. Retirez la lame du PBS et tamponnez l’excès de liquide sur une serviette en papier.
Immergez la lame dans du 100 % de méthanol pendant 45 secondes pour fixer les cellules. Faites sécher la diapositive à l’air libre et montez-la à l’aide d’un support de montage préparé en interne. Ajouter une lamelle et laisser sécher la lame pendant la nuit avant de quantifier la phagocytose.
Les macrophages M1 et M2 ont été polarisés et cultivés avec succès pendant huit jours, avec des caractéristiques morphologiques distinctes observées sur les images de microscopie. Dans la cytométrie en flux, les macrophages M1 ont montré environ 86,1 % d’expression de CD80 et 0,17 % d’expression de CD209. Les macrophages M2 ont montré 97,3 % de l’expression de CD209 et 0,003 % de l’expression de CD80.
Les histogrammes d’intensité de fluorescence ont confirmé une expression plus élevée de CD80 dans les macrophages M1 par rapport aux macrophages M2. Alors que les macrophages M2 ont montré une expression CD209 significativement plus élevée par rapport aux macrophages M1. Les macrophages M2 ont montré un indice phagocytaire significativement plus élevé que les macrophages M1.
Les images microscopiques ont montré des preuves claires d’une phagocytose accrue dans les macrophages M2 par rapport aux macrophages M1. Cette étude visait à évaluer le potentiel de l’utilisation de macrophages au lieu de monocytes pour prédire la signification des anticorps anti-globules rouges. Ce tableau montre que les macrophages M2 phagocytent mieux que les macrophages ou monocytes M1 avec des anticorps considérés comme cliniquement significatifs.
Ainsi, avec des études plus approfondies, un test utilisant des macrophages M2 pourrait être utilisé pour une meilleure prédiction de la signification clinique des anticorps.
