Je tiens à remercier Sreemanti Basu pour fournir les données de la figure 1. Ce travail a été soutenu en partie par NIH AI069358 et la Fondation de recherche BloodCenter.

Complément de lapin A. <ol><li> Complément de lapin stock doivent être décongelés à température ambiante, puis répartie dans des 0,5 et / ou volumes de 1 ml et congelé à -20 à 80 ° C pour stockage à long terme. </li><li> Chaque lot de complément doit être titré pour déterminer la concentration optimale de travail. Généralement, une dilution de 1:10-1:20 est optimale. </li><li> Le complément de lapin n&#39;est pas toujours préstérilisés avant la vente, en fonction de l&#39;utilisation finale des cellules, le complément doit être filtrée stérilisée quand aliquotés et congelés ou avant l&#39;addition aux cellules. </li></ol> Sélection d&#39;anticorps B. <ol><li> Pas tous les anticorps sont efficaces à l&#39;activation du complément, ainsi que les anticorps doivent d&#39;abord être testées pour leur activité. </li><li> Les deux souris et le rat mAb sont efficaces à l&#39;activation du complément. </li><li> Les anticorps IgM sont généralement les plus efficaces pour une utilisation dans la lyse cellulaire induite par complètent suivie par des IgG. Les isotypes IgG mieux pour l&#39;activation du complément varient entre les espèces. </li><li> Chaque anticorps doit être adaptée pour une utilisation optimale à une densité cellulaire de 10 7 cellules / ml. </li></ol> C. Protocole de base <ol><li> Ajustez la population de cellules commencent à 5 x 10 7 cellules / ml dans le milieu de la chaleur contenant FCS inactivé. Le volume final des cellules sera le double du volume de départ. N&#39;oubliez pas de sauvegarder certaines cellules de sorte que l&#39;épuisement peut être quantifiée. </li><li> Chaque anticorps devrait être ajoutée à la suspension cellulaire à la bonne concentration prédéterminée ou de dilution. Mélanger les cellules bien par inversion. </li><li> Calculez le montant du complément nécessaire. Décongelez le stock de compléter à la température ambiante. Si le complément n&#39;est pas stérile, stériliser l&#39;aide d&#39;un filtre à faible liaison protéique bout de la seringue. Pour la seringue, ajouter quelques ml de milieu avant l&#39;ajout du complément et le filtre directement dans le tube contenant les cellules et d&#39;anticorps. </li><li> Ajuster le volume final dans le tube de sorte que les cellules sont à 1 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant une heure, en mélangeant toutes les 15 minutes. </li><li> Centrifuger les cellules et jeter le surnageant. </li><li> Laver avec support double. Les débris cellulaires seront adhérer à la paroi des tubes en polystyrène. Les cellules mortes et les débris peuvent être éliminés à l&#39;aide d&#39;une passoire cellulaire ou par centrifugation en gradient de densité. </li><li> Vérifiez la pureté des cellules en comparant la population cellulaire d&#39;intérêt avant et après l&#39;épuisement. La cytométrie en flux et d&#39;immunohistochimie sont deux bonnes méthodes de détermination de la pureté des cellules. </li></ol> Les résultats représentatifs Lorsque vous utilisez un mAb qui est très efficace à l&#39;activation de la déplétion des cellules de compléter, après une ronde est supérieure à 95%. Ceci est illustré dans la figure 1, où nous avons commencé avec des splénocytes de souris composé de 32,2% des cellules T αβ détectée par l&#39;expression de TCRβ (eBioscience, San Diego, Californie) par cytométrie en flux. Nous appauvri cellules T en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques pour les Thy1, une protéine exprimée par toutes les cellules T, mais pas les autres leucocytes. L&#39;anticorps a été utilisé, nous Y-19 un rat IgG2c 2. Suite à la procédure décrite, la population a été réduite TCRβ à 1,56%, soit une réduction supérieure à 95%. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. L&#39;épuisement des Thy1 + cellules T spléniques par l&#39;activation du complément. Splénocytes de souris totales ont été obtenues par l&#39;homogénéisation de la rate et la lyse des globules rouges. Anti-Thy1 et complètent bébé lapin à des concentrations prédéterminées ont été ajoutés à une suspension cellulaire unique de splénocytes telle que la concentration cellulaire finale était de 1 x 10 7 cellules / ml. Après une incubation de 1 heure à 37 ° C, les cellules ont été lavées deux fois et évalué par exclusion du bleu trypan pour la viabilité cellulaire. L&#39;efficacité de la déplétion a été évaluée par cytométrie en flux comparant le pourcentage de TCRβ + cellules avant l&#39;épuisement (à gauche) et après épuisement (panneau de droite). La barre horizontale indique coloration positive et le nombre au-dessus du bar est le pour cent positif.

<ol>
	<li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Health+and+Disease.">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , (1994).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation.">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li></ol>

La purification des populations de cellules est une procédure commune nécessaires à l&#39;étude de leurs fonctions. Nous décrivons ici une méthode rapide et efficace de l&#39;épuisement des populations de cellules en utilisant un antigène-anticorps spécifiques et de l&#39;appauvrissement de complément. L&#39;épuisement de toute la population de cellules peut être réalisé si un anticorps activant le complément est disponible à un marqueur de la lignée spécifique. Ici, nous avons démontré l&#39;épuisement des cellules T en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques pour les Thy1, une protéine exprimée par la quasi-totalité des populations de cellules T. Nous appauvri plus de 95% des cellules T αβ et les splénocytes restants ont été augmenté de 68% à 98%. Ce niveau de pureté des cellules est similaire à d&#39;autres stratégies de purification dont FACS et séparation magnétique perle. L&#39;épuisement du complément est une technique rapide qui peut être effectué en 1,5 heures une fois que la population de cellules de départ est obtenu. Un autre avantage de l&#39;épuisement du complément est que tout laboratoire peut effectuer la technique car elle ne nécessite pas de matériel coûteux et des réactifs. Les seuls éléments majeurs de l&#39;équipement requis sont un bain d&#39;eau et une centrifugeuse. Le complément de lapin peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs, à un coût raisonnable (voir le tableau des réactifs) et de nombreux anticorps monoclonaux peuvent être achetés auprès de CIFA et cultivé localement pour contrôler les coûts. En revanche, FACS nécessite un cytomètre en flux avec une capacité de tri de cellules, qui coûtera dans les six chiffres marqués par fluorescence et coûteux mAb. Séparation magnétique perle est à prix modéré, mais nécessite l&#39;achat d&#39;un aimant et les billes magnétiques, qui peut être coûteux. En outre, certaines stratégies de séparation magnétique perles exigent également l&#39;achat de colonnes. La principale pierre d&#39;achoppement à l&#39;utilisation du complément pour la déplétion des cellules est la disponibilité du complément activant mAb avec la spécificité d&#39;antigène nécessaire. Bien que des anticorps humains, de souris et de rats ont tous la capacité à fixer le complément, certains isotypes sont mieux que d&#39;autres. Bien que les IgM de ces trois espèces est très efficace pour la fixation de compléter les isotypes IgG varier. Ainsi, chaque mAb doit d&#39;abord être testée dans une étude pilote pour déterminer son efficacité. Pour les anticorps qui ne sont pas très efficaces, deux tours de l&#39;épuisement du complément peut être réalisée sans affecter la viabilité des populations de cellules restantes. Comme une des économies de coûts, les anticorps doivent être titrés pour une efficacité optimale. En outre, les anticorps utilisés n&#39;ont pas besoin d&#39;être purifié. Surnageants d&#39;hybridome et travailler liquide d&#39;ascite tout aussi efficacement, ce qui est particulièrement pratique pour les anticorps IgM, qui sont difficiles à purifier. Comme avec les anticorps, il est impératif que le complément sera titré en une étude pilote. Un haut trop de concentration va entraîner la perte de viabilité des populations de cellules non ciblées. Il est également important que le temps d&#39;incubation ne dépasse pas 60 minutes. Dans notre protocole, nous avons co-incubation de l&#39;anticorps et le complément ensemble. Cependant, les cellules peuvent être étiquetés avec l&#39;anticorps pendant 15-30 minutes et lavés avant l&#39;ajout du complément. Lorsque vous utilisez cette stratégie, assurez-vous d&#39;effectuer les incubations d&#39;anticorps sur la glace pour empêcher la perte de l&#39;antigène des cellules à la surface cellulaire, comme c&#39;est le cas avec certaines protéines en patchant et le plafonnement ou l&#39;internalisation du récepteur. Bien que très efficace, le principal inconvénient pour compléter l&#39;épuisement par rapport à d&#39;autres méthodes, c&#39;est qu&#39;il ne peut pas être utilisé pour la sélection positive. Ainsi, il est difficile d&#39;obtenir des sous-populations de cellules. Par exemple, il serait difficile de purifier les cellules B de la zone marginale des cellules B folliculaire, qui serait mieux fait par FACS. Dans cette situation, l&#39;activation du complément peut être utilisé pour épuiser les cellules T afin de réduire le nombre de cellules à trier. Cette stratégie permettrait de réduire le temps de trier, ce qui permettrait d&#39;économiser de l&#39;argent et serait moins sévère sur les cellules. Depuis la purification des populations spécifiques de cellules est une exigence commune d&#39;un certain nombre de stratégies ont été développées. Les principaux avantages de la stratégie de l&#39;épuisement du complément sont son prix abordable, simplicité technique et des économies de temps.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-4 week baby rabbit complement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pel-Freez Biologicals</td>
<td>31061-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>various </td>
<td>An incubator set at 37 &deg;C can also be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

depletion of specific cell populations by complement depletion

La purification des populations de cellules immunitaires est souvent nécessaire afin d&#39;étudier leurs fonctions uniques. En particulier, les approches moléculaires comme la PCR en temps réel et de l&#39;analyse par microréseau nécessite l&#39;isolement des populations de cellules avec une grande pureté. Stratégies de purification couramment utilisés comprennent le tri de cellules fluorescentes (FACS), séparation magnétique et l&#39;épuisement des billes complément. Parmi les trois stratégies, l&#39;épuisement de compléter offre l&#39;avantage d&#39;être rapide, peu coûteuse, doux sur les cellules et un rendement élevé de cellules. Le système du complément est composé d&#39;un grand nombre de protéines plasmatiques qui lorsqu&#39;il est activé initier une cascade protéolytique aboutissant à la formation d&#39;un complexe membranaire d&#39;attaque qui forme un pore sur une surface cellulaire entraînant la mort cellulaire<sup&gt; 1</sup&gt;. La voie classique est activée par anticorps IgM et IgG et a d&#39;abord été décrite comme un mécanisme pour tuer les bactéries. Avec la génération d&#39;anticorps monoclonaux (mAb), la cascade du complément peut être utilisé pour lyser toute population de cellules d&#39;une manière spécifique de l&#39;antigène. L&#39;épuisement des cellules par la cascade du complément est réalisé par l&#39;ajout du complément spécifique de l&#39;antigène de fixation des anticorps et de complément de lapin à la population de cellules de départ. Les cellules sont incubées pendant une heure à 37 ° C et les cellules lysées sont ensuite éliminés par deux tours de lavage. MAB avec une grande efficacité pour la fixation du complément normalement épuiser les 95-100% de la population cellulaire ciblée. Selon la stratégie de purification pour la population de cellules cibles, l&#39;épuisement du complément peut être utilisé pour la purification de cellules ou pour l&#39;enrichissement des populations de cellules qui peuvent ensuite être purifié par une méthode ultérieures.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Pour bien étudier la fonction des populations de cellules immunitaires leur purification est souvent nécessaire. L&#39;épuisement du complément est une technique rapide et peu coûteuse pour l&#39;isolement des populations de cellules immunitaires avec une grande pureté.

Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l&#39;épuisement Complément

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K vues.  Blood Research Institute. Pour bien étudier la fonction des populations de cellules immunitaires leur purification est souvent nécessaire. L'épuisement du complément est une technique rapide et peu coûteuse pour l'isolement des populations de cellules immunitaires avec une grande pureté.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Purification de population cellulaire spécifique par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Recherche

Immunologie et infection

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual complement components can be quantified however this does not provide any information as to the activity of the pathway. The CH50 is a screening assay for the activation of the classical complement pathway (Fig 1) and it is sensitive to the reduction, absence and/or inactivity of any component of the pathway. The CH50 tests the functional capability of serum complement components of the classical pathway to lyse sheep red blood cells (SRBC) pre-coated with rabbit anti-sheep red blood cell antibody (haemolysin). When antibody-coated SRBC are incubated with test serum, the classical pathway of complement is activated and haemolysis results. If a complement component is absent, the CH50 level will be zero; if one or more components of the classical pathway are decreased, the CH50 will be decreased. A fixed volume of optimally sensitised SRBC is added to each serum dilution. After incubation, the mixture is centrifuged and the degree of haemolysis is quantified by measuring the absorbance of the haemoglobin released into the supernatant at 540nm. The amount of complement activity is determined by examining the capacity of various dilutions of test serum to lyse antibody coated SRBC. This video outlines the experimental steps involved in analysing the level of complement activity of the classical complement pathway.

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

The classical pathway is activated by antibody and culminates in target cell lysis. The CH50 assay provides a measure of the complement activity of a serum sample. This video demonstrates the steps involved in determining the CH50 of a serum sample, the calculations and interpreting of results.

Mesurer le complément hémolytique 50% (CH 50) Activité de Sérum

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

L&#39;épuisement et la reconstitution des macrophages chez la souris

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

Les méthodes de détection quantitative d&#39;anticorps induite par l&#39;activation du complément sur les globules rouges

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d&#39;utilisation efficace<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l&#39;antigène

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...