Non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה Spruce ומגוון של מיני צמחים

Summary

אנו מתארים DIG שונה באתרו פרוטוקול הכלאה, אשר הוא מהיר החלים על מגוון רחב של מיני צמחים כולל נורבגיה אשוח. עם רק כמה התאמות, כולל שינה RNase טיפול וריכוז proteinase K, הפרוטוקול ניתן להשתמש במחקרים של רקמות מינים שונים.

Abstract

תפוקה גבוהה ניתוח טכנולוגיות ביטוי הזמינים כיום לתת למדענים הצפת פרופילים הביטוי אך ההחלטה שלהם במונחים של הביטוי רקמות ספציפיות מוגבל בגלל בעיות לנתח רקמות הפרט. נתונים הביטוי צריך להיות אישר השלימו עם דפוסי ביטוי באמצעות למשל הכלאה באתרו, טכניקה המשמשת למקם mRNA התא ביטוי ספציפי. בשיטת הכלאה באתרו הוא מייגע, זמן רב ולעיתים קרובות דורש אופטימיזציה נרחב בהתאם מינים ורקמות. בניסויים באתרו יחסית קשה יותר לבצע מינים עציים, כגון נורווגיה כוניפאר אשוחית (Picea אשוח). כאן אנו מציגים DIG שונה בפרוטוקול הכלאה באתרו, אשר הוא מהיר החלים על מגוון רחב של מיני צמחים כולל פ אשוח. עם רק כמה התאמות, כולל שינה RNase טיפול וריכוז proteinase K, אנחנו יכולים להשתמש בפרוטוקול ללמוד ביטוי רקמות ספציפיות של גנים הומולוגיים איברי הרבייה הגברית gymnosperm אחד ושני מינים angiosperm: פ אשוח, thaliana ארבידופסיס ו Brassica napus. פרוטוקול עבדו באותה מידה עבור מינים גנים למד. AtAP3 ו BnAP3 נצפו השני והשלישי איברים פרחים במערבולת א ' thaliana ו-B napus ו DAL13 ב microsporophylls של האצטרובלים הזכריים מ פ אשוח. עבור פ אשוח K proteinase ריכוז, המשמש permeablize הרקמות, היה צריך להיות גדל ל 3 גרם / מ"ל במקום 1 גרם / מ"ל, ככל הנראה בשל רקמות יותר קומפקטי רמות גבוהות יותר של phenolics ופוליסכרידים. עבור כל המינים הטיפול RNase הוסר בשל עוצמת האות מופחת ללא גידול מקביל סגוליות. על ידי השוואת ספציפיים רקמות ביטוי דפוסים של גנים הומולוגיים משני הצמחים ועץ מחטניים אנו מראים כי ה-DIG בפרוטוקול באתרו שהוצגו כאן, רק עם שינויים מזעריים, ניתן ליישם במגוון רחב של מיני צמחים. לפיכך, פרוטוקול נמנע גם אופטימיזציה של מינים ספציפיים נרחב ושימוש מייגע של בדיקות שכותרתו רדיואקטיבית לטובת בדיקות DIG שכותרתו. בחרנו להדגים את השלבים טכנית בדרישה של פרוטוקול בסרט שלנו.

אנה Karlgren וג'ני Carlsson תרמו באופן שווה על מחקר זה.

המחברים מקבילים: אנה Karlgren ב Anna.Karlgren @ ebc.uu.se ו Jens Sundström פ ב Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Protocol

MRNA זה לא רדיואקטיבי בפרוטוקול הכלאה באתרו הוא מותאם במיוחד ברקמות נורבגיה אשוחית ותיאר בפרוטרוט. היא מבוססת על ארבידופסיס / לפתית בפרוטוקול הכלאה באתרו אופטימיזציה בקבוצות שלנו, אשר בתורו מבוסס על פרוטוקולים מן Meyerowitz והאירים מעבדות אופטימיזציה על ידי ויויאן אירי, סינדי לינקולן ג'ף לונג בין היתר ^1-4.

נוהל

1. קיבעון והטבעה

כדי לספק לרקמות RNA שימור צריך להיות מקובע ומוטבעים בשעווה לפני בניסוי באתרו מבוצע. קיבעון והטבעה הוא שלב קריטי שכן חומרים קבועים גרוע עשוי לתת אות נמוכה או בלתי מורגשת אף mRNA הוא עשיר מאוד. הרקמות הן התייבשות, מפונה מוטבע שעווה שינויים הדרגתיים כדי למנוע נזק לרקמות. כדי להמשיך למנוע הצטמקות ונפיחות של תאים 0.85% NaCl מתווסף הצעדים אתנול הראשון התייבשות של רקמות נורבגיה אשוח. אפשר להשאיר את NaCl באתנול (למשל הוא נשאר בחוץ בפרוטוקול ארבידופסיס / לפתית). צעד התייבשות במהלך הטבעה עשוי להתבצע על קרח כדי לשמור על פעילות RNase לפחות או 4 ° C. בפרוטוקול זה לתקן את 4% פתרון paraformaldehyde מכיל glutaraldehyde 0.25%, שאמור לתת שימור טוב יותר RNA אף כי יש הטוענים כי זה כנראה לא משנה (למשל, הוא נשאר בחוץ בפרוטוקול ארבידופסיס / לפתית). סביר להניח קיבעון כל תקן פרוטוקול הטבעה ניתן להשתמש. כפי שנראה להלן הטבעת נורבגיה אשוחית שונה במקצת פרוטוקול ארבידופסיס / לפתית.

1.1 יום 1 איסוף צמח החומר קיבעון paraformaldehyde

1. איסוף חומר צמחי עניין לנתח את זה במידת הצורך. שמור את הרקמות על הקרח ומניחים אותם בפתרון קר כקרח לתקן (ראו מתכונים בהמשך), במישרין או בהקדם האפשרי. NB! שמור על הקרח כל הזמן!
2. החל ואקום של דגימות עד paraformaldehyde מתחיל לבעבע. החזק את ואקום של עד שלוש שעות (לדוגמא: 2 x 15 דקות עבור ארבידופסיס ורקמות לפתית פרחוני או שעה אחת עבור קונוסים נורבגיה אשוחית זכר) לשחרר את הוואקום לאט. רקמות אמורים לשקוע לאחר חדירת אבק של מקבע, אבל עבור רקמות מסוימות המכילות הרבה אוויר זה לא אפשרי (ארבידופסיס פרחים למשל). פיסת גזה ניתן להשתמש כדי להפוך את הרקמות להישאר מקבע.
3. החלף את מקבע ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (~ 12-16 שעות) בעדינות רועד.

אפשרות 1

נ.ב.! נורבגיה אשוחית גרסה הטבעה להלן (שלבים 4-8). הפוך את צינורות scintillation בטוח או צלוחיות זכוכית משמשים, לפחות בשלב 5.

1.2 יום 2 התייבשות NB! נורבגיה אשוחית גרסה הטבעה.

4. 0.85% NaCl	30 דקות	על הקרח
   50% EtOH + NaCl 0.85%	90 דקות	על הקרח
   70% EtOH + NaCl 0.85%	90 דקות	על הקרח

   השהה! אפשר לעצור כאן ולאחסן את הרקמות EtOH 70% + NaCl 0.85% ב 4 ° C למשך מספר חודשים.

   85% EtOH + NaCl 0.85%	90 דקות	4 ° C
   95% EtOH (+ eosin)	90 דקות	4 ° C

   נ.ב.! Eosin מתווסף כתם הרקמות ורוד מה שהופך אותם יותר קל לזהות במהלך הטבעה וכן חתך אבל זה יכול להיות שליליים.

   100% EtOH (+ eosin)	90 דקות	4 ° C
   100% EtOH (+ eosin)	בין לילה	4 ° C

1.3 יום 3 התייבשות והטבעה NB! נורבגיה אשוחית גרסה הטבעה.

טארט = "5">

1. 100% EtOH (+ eosin)	2 שעות	טמפרטורת החדר
   50% + 50% EtOH Histoclear II	1 ש '	טמפרטורת החדר
   100% Histoclear II	1 ש '	טמפרטורת החדר
   100% Histoclear II	1 ש '	טמפרטורת החדר
   50% Histoclear II + Histowax 50%	בין לילה	40-50 ° C

   נ.ב.! בשלב האחרון ריכוז Histowax אינו מכריע, רק לשפוך כמה שבבי שעווה.

1.4 יום 4 והטבעה NB! נורבגיה אשוחית גרסה הטבעה.

6. 100% Histowax נמס

   60 ° C

   (בוקר וערב שינוי)

1.5 יום 5 והטבעה NB! נורבגיה אשוחית גרסה הטבעה.

7. 100% Histowax נמס

   60 ° C

   (בוקר וערב שינוי)

1.6 יום 6 והטבעה NB! נורבגיה אשוחית גרסה הטבעה.

8. 100% Histowax נמס

   60 ° C

   (בוקר וערב שינוי)

   נ.ב.! זה בסדר אם את השעווה מדי פעם משתנה פעם ביום, אבל אז זה לוקח יומיים כדי להשלים יום אחד של שינויים. השינוי שעווה יכול גם להמשיך יומיים נוספים ללא כל בעיה. זו מומלצת עבור דגימות גדולות שכן הוא מסייע חדירת השעווה למרכז של רקמות אלה.

אפשרות 2

נ.ב.! ארבידופסיס / לפתית הטבעה גרסה להלן (שלבים 4-8).

1.2 יום 2 התייבשות NB! ארבידופסיס / הטבעה גרסה לפתית.

4. נ.ב.! כל הצעדים על 4 מעלות צלזיוס בעדינות רועדת, אם לא נאמר אחרת.

   1x PBS	30 דקות
   1x PBS	30 דקות
   30% EtOH	60 דקות
   40% EtOH	60 דקות
   50% EtOH	60 דקות
   60% EtOH	60 דקות
   70% EtOH	60 דקות

   השהה! אפשר לעצור כאן ולאחסן את הרקמות EtOH 70% ב 4 ° C למשך מספר חודשים.

   85% EtOH	60 דקות
   95% EtOH (+ eosin)	בין לילה

   נ.ב.! Eosin מתווסף כתם הרקמות ורוד מה שהופך אותם יותר קל לזהות במהלך הטבעה וכן חתך אבל זה יכול להיות שליליים.

1.3 יום 3 התייבשות embedding NB! ארבידופסיס / הטבעה גרסה לפתית.

5. נ.ב.! כל הצעדים בטמפרטורת החדר בעדינות רועדת, אם לא נאמר אחרת.

   100% EtOH (+ eosin)	30 דקות
   100% EtOH (+ eosin)	30 דקות
   100% EtOH (+ eosin)	60 דקות
   100% EtOH (+ eosin)	60 דקות

   נ.ב.! העברת רקמות צלוחיות scintillation או אחר (זכוכית) צלוחיות.

   75% + 25% EtOH Histoclear II	30 דקות
   50% + 50% EtOH Histoclear II	30 דקות
   25% + 75% EtOH Histoclear II	30 דקות
   100% Histoclear II	60 דקות
   100% Histoclear II	60 דקות
   100% Histoclear II + ¼ כרכים שבב Histowax	לילה (לא רועד)

   נ.ב.! בשלב האחרון ריכוז Histowax אינו מכריע, רק לשפוך כמה שבבי שעווה.

1.4 יום 4 והטבעה NB! ארבידופסיס / הטבעה גרסה לפתית.

6. מניחים את צלוחיות עם רקמות על 42 מעלות צלזיוס עד שבבי השעווה נמסה לחלוטין. לאחר מכן להוסיף ¼ נפח של שבבי שעווה ולתת להם להתמוסס לחלוטין. העבר 60 ° C ולהשאיר את בקבוקוני במשך כמה שעות. לבסוף, להחליף שעווה / Histoclear II עם שעווה מותכת טרי לדגור על הלילה 60 ° C.

1.5 יום 5 והטבעה NB! ארבידופסיס / הטבעה גרסה לפתית.

7. 100% Histowax נמס

   60 ° C

   (בוקר וערב שינוי)

1.6 יום 6 והטבעה NB! ארבידופסיס / הטבעה גרסה לפתית.

8. 100% Histowax נמס

   60 ° C

   (בוקר וערב שינוי)

   נ.ב.! בפרוטוקול ארבידופסיס / לפתית (לעומת אשוחית נורבגיה פרוטוקול) יש 7 ימים והטבעה באותה דרך כמו יום 5-6, כלומר Histowax מומסת 100% ב 60 ° C ולשנות בוקר וערב
   נ.ב.! זה בסדר אם את השעווה מדי פעם משתנה פעם ביום, אבל אז זה לוקח יומיים כדי להשלים יום אחד של שינויים. השינוי שעווה יכול גם להמשיך יומיים נוספים ללא כל בעיה. זו מומלצת עבור דגימות גדולות שכן הוא מסייע חדירת השעווה למרכז של רקמות אלה.

1.7 7 והטבעה (יום 8 בפרוטוקול ארבידופסיס / לפתית) (פרטים טכניים Film! מוצגים בסרט)

9. מחממים בצלחות פטרי ו / או תבניות ב 60 ° C. הפוך על צלחת חמה (60 ° C) ולוודא Histowax נמס זמין.
10. יוצקים את רקמות Histowax נמס לתוך צלחת פטרי (או עובש) הניח על הפלטה החשמלית. הוסף Histowax יותר כך רקמות מכוסים. מחממים פינצטה ולהפיץ את הרקמות באופן שווה בתבנית. מלאו את צלחת פטרי (או עובש). אם השעווה מתקשה לפני ברקמות נמצאים בעמדה הנכונה, לחמם אותו שוב או להסיר את השעווה הקשה עם הצמד הלוהט של פינצטה.
11. בואו השעווה לחסום להקשיח בטמפרטורת החדר לפני הצבת אותו 4 ° C. עדיף לעשות שעווה כמה בלוקים במקום הטבעה הרקמות חזק מדי מאז לחסום שעווה עלול להיסדק כאשר החלקים הם לגזור במהלך חתך.
    השהה! חנות ב 4 &מעלות; ג רקמות יציבים במשך שנים.
    נ.ב.! עבודה RNase ללא שלב זה ואילך. השתמש בכפפות, DEPC לטיפול MilliQ מים, מאגרים, זכוכית וכו ', מאגרים החיטוי ואופים זכוכית וכו' בעת הצורך.

2. חתך (פרטים טכניים Film! מוצגים בסרט)

12. הפעל שתי פלטות (60 ° C ו 42 ° C) ולוודא Histowax נמס זמין.
13. מחממים אזמל בזהירות לחתוך את גוש השעווה של רקמה צלחת פטרי (זה עלול להיסדק אם הוא אלים מדי), או להסיר אותו מן התבנית. כאשר בלוק שעווה יחיד הופרד, הצורה לתוך חתיכת גודל וצורה הנכון כדי להקל על חיתוך ב microtome.
14. חתיכת שעווה צריך שעווה נוספת "העקב" מתחת לרקמה, כך שהוא יכול להיות קשור לבעל לחסום. מחממים את בעל לחסום את העקב על הצלחת חם (60 ° C) הפתיל אותם יחד. יתכן שיהיה צורך לשים על ירידה של Histowax השנייה לבצע היתוך יציב. תן לזה להקשיח ב 4 ° C.
15. חותכים את גוש השעווה לתוך סעיפים 6-8 מיקרומטר עבה קשור בסרט ארוך באמצעות microtome.
    נ.ב.! זה יהיה קל יותר אם לחסום שעווה היא חנות קר, כלומר לחסום שעווה על 4 מעלות צלזיוס ולהביא אותו מהמקרר כאשר מתחילים החיתוך. זה גם יכול להיות מועיל כדי לשמור על קור הסכין.
16. לחקר הסרטים של מקטעים זכוכית מגדלת ולסמן את אלה לשמש.
17. שים RNase ללא MilliQ מים על השקופיות (Probe Plus מ-On פישר ביוטכנולוגיה, אשר מראש ניקה טעונה). לגזור את הסרט לחתיכות קטנות ולשים אותם ("אחורה" או לצד "מבריק" למטה) על השקופיות. שקופיות עם סרטים צריך להיות ממוקם על צלחת 42 מעלות צלזיוס. הסרט אמור לצאת לשטח (זה חשוב!) במים. בואו הסעיפים לשבת במשך כמה דקות ולאחר מכן להשתמש בנייר Kimwipe / רקמה לניקוז המים.
18. השאירו את השקופיות על הצלחת של 1-2 שעות.
19. דגירה השקופיות ב 42 ° C במשך הלילה, כך רקמות לדבוק שקופיות.
    השהה! מומלץ להשתמש בסעיפים בהקדם האפשרי, אבל הם יכולים להיות מאוחסנים יבש בקופסאות סגורות עם יבוש עד כמה ימים 4 ° C.

3. The Making of בדיקות

ב הכלאה באתרו מזהה ביטוי באמצעות תוויות בדיקה ספציפית עבור ה-mRNA מסוים. החללית, אשר לרוב חתיכת RNA משלים, יכול להיות מתוייגים עם digoxigenin, לחפור. DIG היא מולקולה כימית קטנה, אשר יכול להיות קשור uridine ושילבו ובכך ב בדיקה RNA ולאחר מכן זוהה באמצעות DIG נוגדנים ספציפיים.

בתכנון וביצוע של החללית היא השלב הקריטי ביותר RNA בניסוי הכלאה באתרה. יש להקפיד על מנת לוודא בדיקה יש סגוליות גבוהה התווית UTPs באיכות גבוהה. לפעמים הטמפרטורה הכלאה ו / או אורך התגובה צריך להיות מותאם בדיקות ספציפיות. כמו תמיד, יש להיזהר כדי למנוע זיהום RNase.

לפני תיוג, לבודד תבנית פי פרוטוקולים סטנדרטיים, השתמש שיבוטים cDNA למשל, PCR, שברים, ו linearize את התבנית. שברי תבונה antisense מבודדות מוגבר מהתבנית בעזרת primers גנים ספציפיים. עבור שברי PCR מוגבר לא להשתמש אנזימים המייצרים המסוכך '3. לכל שברי הסככה (או SP6 או T3) T7 נוסף באמצעות primers נושאת את T7-רצף או באמצעות וקטור עם האמרגן-T7.

התחושה (mRNA או (- גדיל)) בדיקה יש את רצף ה-mRNA כמו היעד לא להכליא את ה-mRNA המטרה, בעוד antisense (אנטי mRNA או (+) גדיל) בדיקה יש את רצף משלים ובכך להכליא ל המטרה לתת את האות של עניין. בדיקה תחושת משמש כביקורת שלילית אין אות יושג אם הניסוי עבד כמו שצריך. בקרה חיובית נחוץ גם, למשל, בדיקה המזהה גן בית שמירה. רוב השקופיות צריך להיות הכלאה עם בדיקות antisense, ואילו רק כמה שקופיות צריך להיות הכלאה של בדיקות בקרה שונים.

3.1 בדיקה באמצעות תיוג ב שעתוק במבחנה

ריאגנטים מן RNA DIG תיוג Kit (SP6/T7: 11175025910, רוש יישומי המדע, מנהיים, גרמניה) או דומים משמשים כאשר תיוג בדיקות. תגובת 20 μl המתואר כאן צריך להניב ~ 10 מיקרוגרם של DIG שכותרתו RNA.

20. תן שעתוק במבחנה לשלב שכותרתו נוקלאוטידים. מוסיפים את ריאגנטים הבא צינור (לשמור על הקרח):

    מרכיב	נפח / כמות
    10 x NTP תערובת תיוג	2 μl
    10 x חיץ תמלול	2 μl
    מגן RNase המעכב	1 μl (20U)
    RNA פולימראז T7 (SP6 או T3)	2 μl
    תבנית ה-DNA (500-1000 ng)	x μl
    RNase ללא MilliQ מים	μl y, לנפח סופי של μl 18

21. מערבבים את תערובת תיוג NTP, חיץ שעתוק, RNase המעכב (NB! בדיקה אם הוא קצר, למשל <500bp, אתה עלול להגדיל את ריכוז מעכב RNase עד 40U), תבנית ה-DNA פולימראז ומים ואחר כך בקצרה צנטריפוגות.
22. דגירה תמהיל תגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות (NB! בדיקה אם הוא קצר, למשל <500bp, להגדיל את זמן התגובה 4-6 שעות).
23. הוסף 2 μl DNase ואני דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
24. עצור את התגובה על ידי הוספת 2 μl 0.2 M EDTA (pH 8.0). בדוק את המוצר ג'ל.
25. להאיץ את החללית על ידי הוספת 2.5 μl של 4 מ 'LiCl ו 75 μl של אתנול> 99.5%. מערבבים היטב דגירה ב -20 ° C במשך הלילה (NB! אין להשתמש tRNA כנשא. במקום להשתמש גליקוגן או acrylamide לפי יצרנים).
26. צנטריפוגה (13 000 סל"ד) למשך 30 דקות 4 ° C ולהסיר את supernatant. שטפו את גלולה (לפחות 10 דק '13 000 סל"ד) שתי פעמים באתנול 70% (~ 150-300 μl).
27. הסר את supernatant ולתת יבש גלולה. Resuspend בדיקה במים 30 RNase ללא μl במשך 1-2 שעות על הקרח.
    השהה! החללית ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס במשך יותר משנה.
    נ.ב.! שמור μl 0.5 דגימות משלב 21 (לפני בתעתיק חוץ גופית), שלב 23 (לפני הטיפול DNase), שלב 24 (לאחר הטיפול DNase, אבל לפני המשקעים) ו 1 מדגם μl משלב 27 (כאשר החללית כבר resuspended). הפעל את דגימות על ג'ל 1% nondenaturating TBE. אם התגובה DNase עבד כראוי את תבנית-band תיעלם. שעתוק במבחנה צריך ליצור רצועה עבה RNA בגודל כ נכונה. אם אתה רואה להקות מרובות, denaturate דגימות ב 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו מרווה על הקרח לפני הטעינה. אם ההתאוששות משלב 27 נראה רע זה יכול להיות כל כך כי החללית לא היה resuspended היטב. דגירה RNA על 55 מעלות צלזיוס 50-10 דקות כדי לקבל אותו לתוך פתרון.

3.2 הידרוליזה של בדיקות ארוכות

נ.ב.! אם החללית שלך הוא גדול יותר מאשר 150 נ"ב זה צריך להיות מופחת 50-150 נ"ב לתת אות גבוה, עקב חדירה טובה יותר. בדיקה יכול להיות מושפל כימית חיץ קרבונט (pH 10.2). אם החללית היא בגודל הנכון לדלג לשלב הידרוליזה, אך יש לזכור להוסיף אחד לפוראמיד נפח, μl 30 כלומר, כדי לחקור את.

28. הכן 0.2 M ביקרבונט הנתרן (NaHCO ₃₎ ו - 0.2 מ 'נתרן פחמתי (Na ₂ CO _3). שניהם צריכים להיות טריים.
29. מבחן שני מאגרים על ידי ערבוב 5 מ"ל H ₂ O, 2 מ"ל 0.2 M NaHCO ₃ ו - 3 מ"ל 0.2 M Na ₂ CO _3. PH צריך להיות ~ 10.2.
30. חשב את זמן הדגירה:

    זמן דגירה (דקות) = (0 L ו-L) / (K * L * L 0 ו)

    L 0 = אורך התחלתי של בדיקה של kb

    L f = אורך הסופי של החללית ב kb = 0.100 למשל kb

    שיעור K = קבוע הידרוליזה = 0.11 kb-1min-1

31. Hydrolyze מחצית בדיקה שלך, שמור את השאר מאוחר יותר. מדולל בדיקה μl 50 עם מים RNase חופשי להוסיף 20 μl 0.2 M NaHCO ₃ (להוסיף הראשונה) ו 30 μl 0.2 M Na ₂ CO _3. מערבבים לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך זמן הדגירה מחושב.
32. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 μl של 1 M NaOAc pH 4.7.
33. להאיץ את החללית על ידי הוספת 10 μl 4 M LiCl ₂ ו 300 ethano μll (גליקוגן NB! שימוש או acrylamide כנשא, אם יש צורך). דגירה ב -20 ° C במשך הלילה.
34. צנטריפוגה (13 000 סל"ד) למשך 30 דקות 4 ° C ולהסיר את supernatant. שטפו את שתי פעמים גלולה באתנול 70% (~ 300 μl). (13 000 סל"ד) צנטריפוגה לפחות 10 דקות כל אחד בכביסה ב 4 ° C.
35. הסר את supernatant ולתת יבש גלולה. Resuspend בדיקה של 30 μl מים MilliQ RNase חינם. מוסיפים לפוראמיד נפח, μl 30 כלומר, כדי לחקור את.
    השהה! החללית ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס במשך יותר משנה.
    נ.ב.! קח 2 μl של החללית unhydrolyzed ו 2 μl של החללית הידרוליזה (לפני לפוראמיד נוסף) ולבדוק ג'ל 1% nondenaturating TBE. לא צריך להיות הבדל בגודל בין שתי דגימות. הבדיקות ייתכן שיהיה צורך denaturated על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו מרווה על הקרח לפני הטעינה.

4. IN הכלאה באתרו (פרטים טכניים Film! מוצגים בסרט)

ודא כי כל הפתרונות הם RNase בחינם! אין זה הכרחי לכל DEPC לטיפול, אך השימוש autoclaved לפחות MilliQ מים. ודאו כי כל כלי זכוכית מחוממים ב 200 מעלות צלזיוס למשך הלילה או לפחות למשך 5 שעות. פנקו את מיכלי פלסטיק ומערבבים ברים עם 0.1 M NaOH בהתרגשות הלילה. שוטפים את מיכלי פלסטיק מספר פעמים עם autoclaved MilliQ מים (~ 500 מ"ל / מיכל). זה חיוני כדי לשטוף את מיכלי בזהירות כדי למנוע עקבות של NaOH שעשוי להפריע הכלאה. DEPC לטיפול כל פתרונות מניות, למעט טריס-buffers. בדוק את כל פתרונות וכו 'לפני תחילת הניסוי כדי לוודא שהכל זמין. עד שלב 61 (למעט צעדים 51-52) אנחנו ממשיכים את השקופיות במעמד, אשר מועבר בקלות בין מיכלים.

4.1 ב המקדים סעיף באתרו

36. Deparaffinize / ליבש חלקים:

    2x 10 דקות Histoclear II (להשתמש מיכלי זכוכית)

    2x 1-2 דקות EtOH 100%

    1-2 דקות 95% EtOH

    1-2 דקות 90% EtOH

    1-2 דקות 80% EtOH

    1-2 דקות 60% EtOH

    1-2 דקות 30% EtOH

    1-2 דקות H 2 O

37. שטפו את השקופיות עבור 15-20 דקות ב 2x SSC בחדר זמני (NB! הכן את paraformaldehyde בשימוש בשלב 42 בזמן הדגירה).
38. פנקו את הרקמות למשך 30 דקות עם proteinase K ב 37 ° C עם תסיסה עדינה (למשל, 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור ארבידופסיס / לפתית ו -3 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור נורווגיה אשוח). מערבבים מחממים עד 37 מעלות צלזיוס 100 מ"מ טריס pH 8 ו - 50 mM EDTA. הוסף proteinase K מיד לפני טיפול שקופיות. NB! הטיפול K proteinase צריך להיות מותאם בהתאם רקמות, מיני צמחים וגיל. (NB! הכן את triethanolamine בשימוש בשלב 45 בזמן הדגירה).
39. פנקו את השקופיות עבור 2 דקות עם 2mg/ml גליצין ב 1x PBS בטמפרטורת החדר. (NB! מערבבים את גליצין עם PBS יום לפני השימוש בו כדי להבטיח את גליצין הוא מומס כראוי).
40. שטפו את השקופיות עבור 2 דקות 1x PBS בטמפרטורת החדר.
41. שטפו את השקופיות עבור 2 דקות 1x PBS בטמפרטורת החדר.
42. דגירה השקופיות במשך 10 דקות עם 4% (w / v) paraformaldehyde (עשה טריים) ב 1x PBS pH 7 בטמפרטורת החדר. השתמש מיכל זכוכית.
43. שטפו את השקופיות עבור 5 דקות 1x PBS בטמפרטורת החדר.
44. שטפו את השקופיות עבור 5 דקות 1x PBS בטמפרטורת החדר. (לוותר אנהידריד אצטית לתוך הפתרון בשלב 45).
45. דגירה השקופיות במשך 10 דקות ב 0.1M triethanolamine (pH עשוי טריים, 8) ו אנהידריד אצטית בטמפרטורת החדר.
46. שטפו את השקופיות עבור 5 דקות 1x PBS בטמפרטורת החדר.
47. שטפו את השקופיות עבור 5 דקות 1x PBS בטמפרטורת החדר.
48. ליבש:

    30 שניות 30% EtOH

    30 שניות 60% EtOH

    30 שניות 80% EtOH

    30 שניות 90% EtOH

    30 שניות 95% EtOH

    2x 30 שניות EtOH 100%

    השהה! אפשר לעצור כאן ולאחסן את השקופיות במיכל עם כמות קטנה של EtOH בתחתית ב 4 ° C למשך מספר שעות.

4.2 ב הכלאה באתרו (פרטים טכניים Film! מוצגים בסרט)

החלט אילו שקופיות להשתמש בה בדיקות, אל תשכח להשתמש בשתי לחוש בדיקות antisense כמו גם שליטה חיובית. (NB! ProbeOn פלוס שקופיות ביוטכנולוגיה פישר יש זיגוג לבן המאפשר להם להיות דחוקה לתוך זוגות במהלך ההכלאה / איתור צעדים לפרוטוקול). החללית אותו עם ריכוז זהה אמור לשמש זוג שקופית ספציפית. קביעת פתרון הכלאה הרבה איך לעשות על בסיס המספר הכולל של זוגות שקופיות. מחממים את סולפט dextran ב 60 ° C. הפתרון הוא הכלאה צמיגה מאוד סולפט dextran. שים את הפתרון הכלאה של 60 מעלות צלזיוס, יהיה קל יותר להתמודד. אוויר יבש השקופיות על מגבות נייר נקי או Kimwipe / רקמה ניירות לפני בדיקה מוחל. מגלשות חייב להיות יבש לחלוטין. עבור כל זוג של שקופיות להוסיף את החללית. חשוב לבדוק ריכוזי בדיקה שונים (לדוגמא: 0.5, 2 ו 4 μl) כדי למצוא את הריכוז האופטימלי לפני הניסוי בפועל preformed.

הכלאה פתרון	שקופית 5 זוגות	10 שקופיות זוגות	15 שקופיות זוגות	20 שקופיות זוגות
10x ב מלחים באתרו	100 μl	200 μl	300 μl	400 μl
deionized לפוראמיד	400 μl	800 μl	1200 μl	1600 μl
50% dextran סולפט (60 ° C)	200 μl	400 μl	600 μl	800 μl
50x Denhardt של פתרון	20 μl	40 μl	60 μl	80 μl
tRNA (100mg/ml)	10 μl	20 μl	30 μl	40 μl
H 2 O (DEPC שטופלו)	70 μl	140 μl	210 μl	280 μl
סך נפח	800 μl	1600 μl	2400 μl	3200 μl

49. לדלל את החללית במים MilliQ RNase ללא לנפח סופי של μl 20. הוסף כרך אחד (כלומר 20 μl) לפוראמיד לחקור את מתן בנפח כולל של 40 μl. מחממים את החללית עד 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מניחים על קרח דק '2. ספין למטה. שמור את החללית על הקרח. בדיקה זו, תערובת מספיק זוג אחד של שקופיות. תכפיל פי המספר הכולל של זוגות שקופיות עבור בדיקה ספציפית.
50. הוסף 160 μl של הכלאה פתרון עבור כל זוג של שקופיות נותן נפח סופי של μl 200 (כלומר 160 פתרון הכלאה μl 40 + בדיקה μl) עבור כל זוג שקופיות. מערבבים מבלי ליצור בועות.
51. החל את החללית להחליק אחד לאט הפתיל שתי שקופיות יחד. (הרבדה NB! יכול להיעשות רק עם Probe Plus-On שקופיות, שקופיות או שווה ערך. אם שקופיות ללא זיגוג משמשים להשתמש תלושי לכסות במקום הרבדה.)
52. שפר שקופיות מעל מגבות נייר רטוב במיכל פלסטיק (אשר חותמות חזק) באמצעות טפטפות פלסטיק. להכליא 50-55 מעלות צלזיוס למשך הלילה (12-16 שעות).

4.3 ב הכלאה לפרסם באתרו (פרטים טכניים Film! מוצגים בסרט)

53. הכן של הכלאה לפרסם באתרו על ידי ההתחממות ~ 2 ל 0.2x SSC (55 ° C) ~ 2 L 1x NTE (37 ° C) למשך הלילה. עוד SSC ו NTE אם יש צורך בטיפול RNase (שלבים 57-59 להלן) מבוצע.
54. טובלים כל זוג להחליק לתוך חם 0.2x SSC (ראה לעיל) כדי להפריד ולשטוף אותם. ואז למקם אותם במעמד במיכלעם חם 0.2x SSC.
55. שטפו את השקופיות עבור 60 דקות של 0.2x SSC עם תסיסה עדינה ב 55 ° C. (NB! הכן את פתרון לחסום Boehringer בשימוש בשלב 63 בזמן הדגירה.)
56. חזור על להתרחץ 0.2x SSC עבור 60 דקות. (NB! אם הצעד RNase מבוצע לתת להפשיר RNase במהלך הדגירה זה, אם לא המשך לשלב 60.)
57. אופציונלי: שטפו את השקופיות עבור 5 דקות ב חם 1x NTE (ראה לעיל) בשעה 37 ° C עם תסיסה עדינה.
58. אופציונלי: חזור על להתרחץ NTE 1x חם 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם agtation עדין.
59. אופציונלי: פנקו את השקופיות עם RNase (20 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase ב 1x NTE) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. לאחר מכן לשטוף 5 דקות בתוך NTE 1x ב 37 ° C עם תסיסה עדינה. חזור על לשטוף NTE 1x.
60. שטפו את השקופיות עבור 60 דקות של 0.2x SSC ב 55 ° C עם תסיסה עדינה. (NB! הכן את פתרון לחסום שימוש צעדים 64-65 ו - 67 בזמן הדגירה.)
61. שטפו את השקופיות דקות 5 1x PBS על טמפ 'חדר (Pause! אתה יכול לאחסן שקופיות 1XPBS ב 4 ° C במשך הלילה אם אתה רוצה להמשיך למחרת.)
62. מניחים את שקופיות בתחתית מיכל פלסטיק גדול עם עד הצד המדגם.
63. דגירה השקופיות עם בלוק Boehringer 1% 100 מ"מ טריס pH 7.5, 150 mM NaCl 45 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. רק לכסות את השקופיות עם הפתרון חוסם. יוצקים את הפתרון תוך חסימת השקופיות עדיין במיכל פלסטיק או במקום שקופיות במיכל חדש. כאשר מוזג את הפתרון שקופיות בדרך כלל לדבוק מיכל הפלסטיק, אבל לוודא שהם לא נופלים החוצה את המיכל.
64. החלף את פתרון לחסום Boehringer עם BSA 1.0% ב 100 מ"מ טריס pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% Triton X-100. בצע את הדגירה כמו בשלב 63.
65. לדלל את אנטי לחפור נוגדנים (1:1250, כלומר 8 נוגדנים μl ב 10 מ"ל BSA) בתמיסה BSA / טריס / NaCl / טריטון מ 64 שלבים. הפוך את שלולית של פתרון נוגדן פלסטיק לשקול מנה. סנדוויץ שקופיות יחד כדי לאפשר לכוחות נימי להרים את הפתרון. מסננים על נייר Kimwipe / רקמה וחזור, נסו להימנע בועות.
66. שפר שקופיות מעל מגבות נייר רטוב מיכל פלסטיק ולאפשר השקופיות לשבת ליד חדר זמני למשך 2 שעות.
67. מסננים שקופיות על Kimwipe / נייר נפרד. מניחים על החלק התחתון של מיכל פלסטיק כמו בשלב 63. לשטוף 4x בפתרון BSA / טריס / NaCl / טריטון. 15 דקות בכל פעם, תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר.
68. 10 דקות 100 מ"מ טריס pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 מ"מ MgCl _2. מניחים על החלק התחתון של מיכל פלסטיק כמו בשלב 63.
69. שקופית טובלים בתמיסה טריס pH ₂ 9.5/NaCl/MgCl כדי להבטיח את כל חומר ניקוי היא לשטוף.
70. בצע כריכים להכין פתרון כחול המערבי כמו 65. חזור פעם אחת.
71. המקום שקופיות מיכל פלסטיק מעל מגבות נייר רטוב בחשיכה מוחלטת (לעטוף בנייר כסף פח) במשך 1-5 ימים בטמפרטורת החדר. בדוק לאחר 6 שעות, 12 ו - 24 אז פעם אחת כל יום.
72. מגלשות מסננים, שוטפים ב 1xTE להפסיק התגובה. שימי על תלושי לכסות את השקופיות לפני נבחנים תחת מיקרוסקופ. השקופיות ניתן לשמור 1x TE במשך כמה חודשים אבל לצלם בהקדם האפשרי.

מתכונים / פתרונות STOCK

נ.ב.! השתמש RNase ללא MilliQ במים ככל האפשר, למשל DEPC לטיפול MilliQ מים (הוסף DEPC 0.1%. תשאיר החיטוי לילה. (20 דקות ב 15 psi, כלומר 1.05 ק"ג / ² ס"מ, על מחזור נוזלי) או להשתמש ב לפחות autoclaved MilliQ מים. בעת הכנת מאגרי פתרונות המניות אפשר גם לפזר RNase ללא מלחים וכו 'במים DEPC שטופלו במקום DEPC-בטיפול מאגרים ופתרונות המניות עצמם. אם לא DEPC לטיפול במים , מאגרים ומלאי פתרונות, לפחות לעקר החיטוי או לסנן אותם.
השהה! מאגרים חנות ומלאי פתרונות בטמפרטורת החדר, אם לא נאמר אחרת.
נ.ב.! אתה יכול למצוא רבים של מאגרים, וכן רמזים על איך לעשות אותם שיבוט מולקולרי (Sambrook, ג', ו DW ראסל. 2001. שיבוט מולקולרית מעבדה ידני. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory לחץ, Cold Spring Harbor, ניו יורק, ארה"ב).

אנהידריד אצטית ב 0.1M triethanolamine (pH 8, נפח: 800 מ"ל).

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
Triethanolamine	10.4 מ"ל	0.1 מ triethanolamine
MilliQ מים	786.4 מ"ל	נפח סופי 800 מ"ל
HCl	3.2 מ"ל	מתן pH8.0
אצטית אנהידריד	4.8 מ"ל	0.6%

• כדי להפוך 0.1 M triethanolamine חיץ, pH 8.0, לדלל 10.4 מ"ל של triethanolamine ב 786.4 מ"ל של H ₂ O ומוסיפים 3.2 מ"ל של HCl להביא את ה-pH ל 8.0 (לבדוק עם אינדיקטור pH).
• שפר את השקופית עם מתלה שבור pipettes פלסטיק 10 מ"ל או דומה במיכל של triethanolamine עם בר ומערבבים בתחתית.
• לוותר על 4.8 מ"ל אנהידריד אצטית לתוך triethanolamine כמה דקות לפני שמכניסים שקופיות כך מעורבב היטב.

נ.ב.! הפוך את triethanolamine 0.1M טריים אנהידריד אצטית להוסיף ממש לפני הדגירה.
נ.ב.! השתמש מיכל זכוכית. Triethanolamine חיץ יש להשתמש כי אנהידריד אצטית אינה יציבה במים.

Agarose (1%) ג'ל 1 x TBE (נפח: 100 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
Agarose	1 גרם	1%
1 x TBE	עד 100 מ"ל

מערבבים עם agarose 1 x TBE. חום / להרתיח עד agarose נמס. מבצע ג'ל. הפעל את ג'ל חיץ 1 TBE x.

Dextran סולפט

מדולל 5 גרם סולפט dextran עד 10 מ"ל עם DEPC שטופלו MilliQ מים (כלומר 50% (w / v)) ו להמיס 60 ° C.
השהה! חנות ב -20 ° C.

0.5 M EDTA pH8.0 (titriplex השלישי, בנפח 500 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
EDTA (372.24 g / mol)	93.06 גרם	0.5 M EDTA
MilliQ מים	עד 500 מ"ל
NaOH	~ 10 גרם כדורי	מתן pH 8.0
DEPC	0.5 מ"ל	0.1% DEPC

ממיסים EDTA במים (קורה ב-pH 8.0), להתאים את נפח סופי של 500 מ"ל. הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.

תקן פתרון / מקבע (שלבים 1-3, 42) - 4% (w / v) paraformaldehyde ב 1x PBS, pH 7.0 (650 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
MilliQ מים	585 מ"ל
10x PBS	65 מ"ל	1x PBS
10M NaOH	520 μl	pH מתן ~ 11
Paraformaldehyde	26 גרם	4%
ריכוז HCl	449 μl	pH מתן ~ 7

• מערבבים מים, PBS ו NaOH ו חום 60-70 מעלות צלזיוס (הטמפרטורה ה-pH גבוה יקל לפזר את paraformaldehyde.
• הוסף (במנדף קטר) paraformaldehyde.
• כאשר הפתרון פינתה מקום זה על קרח כדי להתאים את pH 7.0 ידי הוספת 449 μl HCl מרוכזת.

נ.ב.! בצע טרי.
נ.ב.! ב glutaraldehyde פרוטוקול אשוחית נוספה ריכוז סופי של 0.25%, כלומר 6.5 מ"ל glutaraldehyde 25% מהנפח הכולל של 650 מ"ל או 10 מ"ל glutaraldehyde 25% מהנפח הכולל של 1000 מ"ל (זוכרים להפחית את המים עם שווה נפח).
נ.ב.! הוסף כמה טיפות של Tween 20 ו / או טריטון X-100, אחרי ה-pH מותאם, כדי להפחית את מתח הפנים כדי להקל על קיבעון בשלבים 1-3. אין להשתמש בשלב 42!
נ.ב.! כאשר תיקון רקמות הצמח נפח קטן יותר (למשל 100-200 מ"ל) של מקבע נדרשת בדרך כלל.

10x ב מלחים באתרו (בנפח 100 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
5 M NaCl	60 מ"ל	3M NaCl
1 M-Cl טריס pH 8.0	10 מ"ל	0.100 M טריס
1 M Na פוספט pH 6.8	10 מ"ל	0.100 M Na פוספט
0.5 M EDTA	10 מ"ל	0.050 M EDTA
MilliQ מים	עד 100 מ"ל

מערבבים חיץ פוספט Na עם pH 6.8 (46.3 מ"ל 1 M Na ₂ HPO ₄ + 53.7 מ"ל 1 M לאא ₂ PO _4). מערבבים NaCl, טריס, Na פוספט חיץ, EDTA ומים. החיטוי. השהה! חנות ב -20 ° C.

4 M LiCl ₂ (כלוריד ליתיום, נפח: 100 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
LiCl 2 (42.39 g / mol)	16.956 גרם	4M LiCl 2
MilliQ מים	עד 100 מ"ל
DEPC	0.1 מ"ל	0.1% DEPC

ממיסים LiCl ₂ במים, להתאים את נפח סופי של 100 מ"ל. הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.
השהה! חנות ב 4 ° C.

1 M MgCl _{2 ·} H ₂ O (מגנזיום כלוריד, נפח: 100 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
MgCl 2 · H 2 O (203.30 g / mol)	20.33 גרם	1 M MgCl 2 · H 2 O
MilliQ מים	עד 100 מ"ל
DEPC	0.1 מ"ל	0.1% DEPC

ממיסים MgCl ₂ במים, להתאים את נפח סופי של 100 מ"ל. הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.
נ.ב.! MgCl ₂ הוא hygroscopic מאוד. אין לאחסן בקבוקי פתח לתקופות זמן ארוכות.

5 M NaCl (נתרן כלורי, נפח: 1 ליטר)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
NaCl (58.44 g / mol)	292.2 גרם	5 M NaCl
MilliQ מים	עד 1 ליטר
DEPC	1 מ"ל	0.1% DEPC

ממיסים NaCl במים, להתאים את נפח סופי של 1 ל הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.

1 M NaOAc pH 4.7 (נתרן אצטט, נפח: 100 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
NaOAc (82.03 g / mol)	0.8203 גרם	1 M NaOAc
MilliQ מים	עד 100 מ"ל
חומצה אצטית		מתן pH 4.7
DEPC	0.1 מ"ל	0.1% DEPC

ממיסים NaOAc במים. התאם את ה-pH ל 4.7. התאם לנפח סופי של 100 מ"ל. הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.

0.2 M Na ₂ CO ₃ pH11.4 (סודיום קרבונט, נפח: 10 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
Na 2 CO 3	0.21198 גרם	0.2 M Na 2 CO 3 pH = 11.4
MilliQ מים	עד 10 מ"ל

ממיסים Na ₂ CO ₃ במים; להתאים לנפח סופי של 10 מ"ל. PH צריך להיות 11.4.
נ.ב.! בצע טרי.

0.2 מ 'NaHCO ₃ pH8.2 (סודיום ביקרבונט, נפח: 10 מ"ל)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
NaHCO 3	0.16802 גרם	0.2 מ 'NaHCO 3: pH = 8.2
MilliQ מים	עד 10 מ"ל

ממיסים NaHCO ₃ במים; להתאים לנפח סופי של 10 מ"ל. PH צריך להיות 8.2.
נ.ב.! בצע טרי.

1 M Na ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O (500 מ"ל נפח)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177.99 g / mol)	88.995 גרם	1 M Na 2 HPO 4
MilliQ מים	עד 500 מ"ל
DEPC	0.5 מ"ל	0.1% DEPC

ממיסים Na ₂ HPO ₄ במים, להתאים את נפח סופי של 500 מ"ל. הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.

1 M לאא ₂ PO _{4 °} H ₂ O (500 מ"ל נפח)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
לאא 2 PO 4 ° H 2 O (137.99 g / mol)	68.995 גרם	1 M לאא 2 PO 4
MilliQ מים	עד 500 מ"ל
DEPC	0.5 מ"ל	0.1% DEPC

ממיסים לאא ₂ PO ₄ במים, להתאים את נפח סופי של 500 מ"ל. הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.

NTE 5x (הנפח הכולל: 1 ליטר)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
5 M NaCl	500 מ"ל	2.5 M NaCl
1 M-Cl טריס pH 8	25 מ"ל	50 מ"מ טריס Cl-pH 8
0.5 M EDTA	5 מ"ל	5 mM EDTA
MilliQ מים	470 מ"ל	נפח סופי 1 ליטר

מערבבים NaCl, טריס, EDTA ומים. אל DEPC לטיפול. החיטוי.

10 x PBS (פוספט שנאגרו מלוחים) pH 7.0 (הנפח הכולל: 1 ליטר)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
5 M NaCl	260 מ"ל	1.3 M NaCl
1 M Na 2 HPO 4	70 מ"ל	70 mM Na 2 HPO 4
1 M לאא 2 PO 4	30 מ"ל	30 מ"מ לאא 2 PO 4
MilliQ מים	640 מ"ל	נפח סופי 1 ליטר
DEPC	1 מ"ל	0.1% DEPC

מערבבים NaCl, Na ₂ HPO _4, נה ₂ PO ₄ ומים. התאם את ה-pH ל pH 7.0 עם HCl. הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.

20x SSC-pH 7.0 (הנפח הכולל: 1 ליטר)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
NaCl (58.44 g / mol)	175.32 גרם	3 M NaCl
Na ציטראט (294.1 g / mol)	88.23 גרם	0.300 M ציטראט Na
MilliQ מים	אני עד 1
HCl		מתן pH 7.5
DEPC	1 מ"ל	0.1% DEPC

ממיסים NaCl ו ציטראט Na במים 800 מ"ל ~. התאם את ה-pH ל pH 7.0 עם HCl. התאם את עוצמת הקול l 1 עם מים. הוסף DEPC 0.1%. השאירו למשך הלילה. החיטוי.

5 x TBE (נפח: 1 ליטר)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
טריס (121.14 g / mol)	54 גרם	~ 0.45 M טריס
בור חומצה (61.83 g / mol)	27.5 גרם	~ 0.45 M חומצה בורית
EDTA (372.24 g / mol)	3.7 גרם	~ 0.01 M EDTA
MilliQ מים	עד 1 ליטר

מערבבים טריס, חומצת בור, EDTA ומים. PH צריך להיות ~ 8.3. מדולל עד 1 x TBE לפני השימוש.

10 x TE-pH 8.0 (טריס EDTA, נפח: 1 ליטר)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
1 M טריס-Cl, pH 8.0	100 מ"ל	0.100 M טריס-Cl
0.5 M EDTA pH8.0	100 מ"ל	0.050 M EDTA
MilliQ מים	עד 1 ליטר

מערבבים טריס, EDTA ומים. אל DEPC לטיפול. החיטוי.
נ.ב.! טריס לא צריך להיות DEPC שטופלו! השתמש RNase ללא אבקת לדלל עם DEPC-treated/RNase-free MilliQ מים.

1 M טריס-HCl pH 7.5-9.5 (500 מ"ל נפח)

מרכיב	נפח / כמות	הריכוז הסופי
טריס (121.14 g / mol)	60.57 גרם	1 M טריס
MilliQ מים	עד 500 מ"ל
HCl		מתן pH 7.5
HCl		מתן pH 8.0
NaOH		מתן pH 9.5

ממיסים טריס במים DEPC שטופלו. התאם את ה-pH הרצוי. התאם לנפח סופי של 500 מ"ל. החיטוי.
נ.ב.! טריס לא צריך להיות DEPC שטופלו! השתמש RNase ללא אבקת לדלל עם DEPC-treated/RNase-free MilliQ מים.
נ.ב.! בשנת שיבוט מולקולרי (ראה לעיל) יש טבלה המתארת ​​כמה להתרכז HCl הוא זקוק כדי להשיג את ה-pH נכונה.

חומרים ושיטות

בפרוטוקול באתרו מוצגת מעל בסרט. מידע נוסף כאן החומר המפעל בדיקות המשמשים דוגמה ספציפית זו מתוארים.

הצמח חומר עיצוב ניסיוני

האצטרובלים הזכריים מ Picea אשוח [ל] הקארסט. (נורבגיה אשוחית) נאספו אופסלה, שוודיה, סתיו 2007. שמונה גביעי נותחו וחתכים מקונוס כל שימשו כל טיפול. שלושה ריכוזים proteinase K נבדקו: 1, 3 ו - 5 מיקרוגרם / μl וכל ריכוז טופלו עם או בלי RNase. שקופיות שלא טופלו RNase נותרו PBS במהלך הטיפול RNase. Thaliana ארבידופסיס [ל] Heynh. ו Brassica napus ל ', גדלו בתנאים מבוקרים בתוך חדר תרבות עם 22 ° C/18 ° C יום / לילה בטמפרטורות photoperiod של 16 ח Inflorescences יאנג המכילה בלוטות פרחוני, בשלבים 00-10 (בשלבים על פי סמית ⁵⁾ נחקרו.

Crna בדיקות

סה"כ היה RNA שבודד פ האצטרובלים הזכריים אשוח כפי שתואר לעיל 6 מ א thaliana ו-B napus באמצעות TRIzol (BRL Gibco, פרדריק, מרילנד, ארה"ב) ואת RNeasy Qiagen הצמח Mini Kit (Qiagen, Hilden, גרמניה), בהתאמה, בהתאם להמלצות היצרן. CDNA היה מסונתז 0.5-1 סך RNA מיקרוגרם, בהתאם למין, באמצעות כתב עילי III Reverse transcriptase (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה, ארה"ב) להלן הוראות היצרן. AtAP3 ו BnAP3 תחושה ושברי antisense ו פ שברי תחושה אשוח היו מבודדים מוגבר באמצעות primers גן מסוים (טבלה 1). DAL13 שברי antisense היו מבודדים מוגבר באמצעות primers כמו 7. הסככה T7 נוספה שברי מ א thaliana ו פ אשוח באמצעות primers הפוכה שונה נושאת את T7-רצף (טבלה 1). שבר 500 נ"ב היה מבודד באמצעות BnAP3 פריימרים ספציפיים (טבלה 1) ו משובטים לתוך וקטור pGEM טריקו עם T7-promotor. עבור אשוח פ שברי כל התגובות PCR בוצעו נפח סופי של 20 μl המכיל 0.2 Phusion U Fidility High-DNA פולימראז (Finnzymes, Espoo, פינלנד), 1x Phusion HF חיץ, 200 מיקרומטר של כל dNTP, 0.3 מיקרומטר של כל אחד פריימר ו 25-50 cDNA ng ותוכנית תקן ה-PCR היה בשימוש עם חישול בטמפרטורה 60-55 ° C (מגע למטה -1 ° C / מחזור) ואחריו 55 ° C. תבונה antisense בדיקות Crna עבור כל שלושת המינים היו מסונתז עם ב שעתוק במבחנה באמצעות RNA DIG תיוג Kit (SP6/T7; רוש יישומי המדע, מנהיים, גרמניה) על פי ההמלצות של היצרן בדיקות ארוכות היו מתעכלים כ 100-150 bp שברי באמצעות Na ₂ CO ₃ חיץ פי ^3.

תוצאות

כאן התוצאה בסעיף נתאר שלוש דוגמאות שונות של תוצאות אופייני בניסויים באתרה.

המנגנון הגנטי המווסת את התפתחות הרבייה חשופי הזרע ואת angiosperms ידי זהות ציון איבר זכר ונקבה כנראה ^7-9 שימור אבולוציוני למרות ששתי השושלות מפעל הזרע מופרד 285000000 ¹⁰ שנים. בתוך א ' thaliana הגנים ההומאוטית פרחים APETALA3 (AP3 ¹¹⁾ ו PISTILLATA (PI ¹²⁾ הם הכרחי ומספיק כדי לציין התפתחות הרבייה של הגבר בהקשר של פרח, ותפקוד זה נראה נשמרת בתוך angiosperm את השושלת ^13. ב חשופי הזרע, אשר חוסר פרחים יש איברי הרבייה שלהם מסודרים קונוסים זכר ונקבה נפרדים (איור 1A-C), גנים הומולוגיים ל AP3 ו PI באים לידי ביטוי במיוחד האיברים נושאות אבקה חרוט זכר, microsporophylls ^7,14. לפיכך, סט דומה של גנים הומולוגיים הן angiosperms ו חשופי הזרע מגדיר את נושא האבקה איברים.

בדיקות ג'ין ספציפי כנגד AtAP3 ו BnAP3, בהתאמה, נתן אותות שלב 3 ב ניצני פרחים צעירים באזור המתאים במערבולת שתיים לשלוש א thaliana ו-B napus. מאוחר יותר ביים ניצנים האותות הוגבלו כותרת בפיתוח אבקנים (איור 2A ו-B). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים קודמים ^11,15,16. בדיקות מכוונת homologue AP3 ב פ אשוח, DAL13, המיוצר אותות microsporophylls של פ האצטרובלים הזכריים אשוח גם לפני וגם אחרי סיום meristem apical (איור 2C ו-D), כצפוי ממחקרים קודמים ^7,14. בדיקות Sense לא נתן אות מעל הרקע (איור 3A-B ו מידע לא מוצג). יחדיו, תוצאות אלה ממחישות הביטוי של א ' thaliana AP3 ו orthologs שלה ב napus ו פ אשוח בפיתוח אברי הרבייה הגברית.

באיור 1. A.thaliana ו-B פרחים napus ואבקה לייצור האצטרובלים הזכריים של פ כוניפאר תמונות אשוח להראות inflorescences עם ניצני פרחים פרחים פתוחים A.thaliana ו B.napus ב A ו-B בהתאמה. שים לב פרחים angiosperm מלבד עטיף הסטרילי נמלים איברי הרבייה גם זכר וגם נקבה, אבקנים ו carpels. מוצג ב-C היא ענף של gymnosperm פ אשוח עם מחטים צמח ירוק ואדום האצטרובלים הזכריים הרבייה.

איור 2. הביטוי של א ' thaliana AP3 ו הומולוגיים גנים ב ' napus ו פ אשוח. Micrographs להראות קטעים האורך של A. thaliana ו-B inflorescences napus ב A ו-B, בהתאמה ו פ האצטרובלים הזכריים אשוח ב C ו-D. מדורים הכלאה עם בדיקות antisense נגד AtAP3 האות A ו-B ב BnAP3 להצגה שנייה ושלישית איברים פרחים במערבולת. מספרים מציין שלבים פרחים על פי סמית ^5. Antisense בדיקה מכוונת גן DAL13 נתן את האות microsporophylls נושאות אבקה של פ האצטרובלים הזכריים אשוח, כפי שמוצג CD. דוגמאות microsporophylls מסומנים על ידי חצים. ראשי חץ בנקודה לספירה לאותת הכלאה, המופיע כמו סגול. ב C ו-D תרכובות פנוליות לתת צבע חום נוקבים לתאים בודדים שעם המרכזי. ים, עלה גביע, p, עלה כותרת, רחוב, אבקן, ג, carpel; ms, microsporophyll; pi, שעם, עמ '; מראש אבקה תאים. בר: 100 מיקרומטר.

3. איור DAL13 ביטוי האצטרובלים הזכריים מ פ אשוח. כל micrographs (א.ה.), מראים קטעים האורך של האצטרובלים הזכריים לאחר סיום meristem apical. ראשי חץ הצבע על סוגי תאים בהם DAL13 באה לידי ביטוי. סעיפים ב A ו-B הם הכלאה עם בדיקה תחושת השליטה כדי לקבוע מכתים רקע. Micrographs C ל H הם הכלאה עם בדיקה antisense DAL13. מדורים מניסויים עם או בלי טיפול RNase מוצגים D, F, H ו-C, E, G, בהתאמה. Micrographs מניסויים עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteinase K מוצגים C ו-D, 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב E ו F, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב G ו H. בר: 100 מיקרומטר.

Discussion

שני היבטים של פ אשוח פרוטוקול היו אופטימיזציה לעומת A. thaliana / B. napus פרוטוקול, RNase טיפול וריכוז proteinase K. RNase מסיר אותות רקע ובכך מגביר את האות ¹⁷ סגוליות. הטיפול K proteinase יש צורך permeabilize הרקמות כך לחקור את יכולה להיכנס לבריכה להכליא RNA של עניין. Antisense DAL13 בדיקה נתן את האות גבוה ללא RNase הטיפול (איור 3C, E, G) לעומת סעיפים שטופלו RNase למשך 30 דקות (איור 2 ד, F ו-H). מאז RNase טיפול לא לשפר את האות הוא הוסר מן הפרוטוקול. הטיפול K proteinase נבדקו בשלושה ריכוזים שונים: 1, 3 ו - 5 מיקרוגרם / מ"ל. במקרה של פ אשוח אות נמוך או לא נצפתה באמצעות 1 מיקרוגרם / מ"ל proteinase K (איור 3C-D). איתות חזק הושג עם 3 מיקרוגרם הן / מ"ל ​​(איור 3E-F) 5 ​​מיקרוגרם / מ"ל ​​(איור 3G-H) proteinase ק מאז שום הבדל ניכר עוצמת האות נמצא בשימוש 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteinase K לעומת 3 מיקרוגרם / מ"ל, בחרנו להשתמש 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​בפרוטוקול שלנו. סביר להניח כי הצורך של ריכוז גבוה proteinase K ב פ האצטרובלים הזכריים אשוח לעומת A. thaliana ו-B ניצנים napus פרחוני בשל רקמת יותר קומפקטי עם רמות גבוהות יותר של phenolics ופוליסכרידים.

במהלך קיבעון והטבעה כמה הבדלים בין א ' thaliana / B. napus פרוטוקול פ אשוח פרוטוקול ניכרים. הרקמה עניין קבוע לספק שמירה רנ"א זה הוא שלב קריטי שכן חומרים קבועים גרוע עשוי לתת אות נמוכה או בלתי מורגשת אף mRNA הוא נרחב ביותר. רקמה היא התייבשות, מפונה מוטבע שעווה שינויים הדרגתיים כדי למנוע נזק לרקמות, ובחלק NaCl פרוטוקולים 0.85% מתווסף אתנול של התייבשות נוספת למנוע הצטמקות ונפיחות של התאים ^3. צעד התייבשות במהלך הטבעה יכול להתבצע על קרח כדי לשמור על פעילות RNase לפחות. ב פ אשוח פרוטוקול לתקן את 4% פתרון paraformaldehyde מכיל glutaraldehyde 0.25%, שאמור לתת שימור טוב יותר RNA ¹⁷ אף כי יש הטוענים כי זה כנראה לא ישנה ^3. לאחר חתך את החומר הוא קבוע על גבי שקופיות pretreated (כלומר dewaxed, rehydrated, permeabilized, טיפול להפחתת הלא ספציפית מחייב בדיקה ומיובש סוף סוף) לפני הכלאה.

בפרוטוקול המובא כאן הליך זיהוי כל יכול להתבצע במעבדות רגילות, אות מתפתחת בדרך כלל בתוך 1-3 ימים ואת היחס בין אות על רקע יכול להיות במעקב רציף. DIG שכותרתו בדיקות בדרך כלל לתת איתות מובהק יותר לעומת בדיקות שכותרתו רדיואקטיבי, יציבים יותר, וניתן לעשות בה שימוש חוזר בניסויים עוקבים. מצד שני, רגישות מופחתת לעומת בדיקות רדיואקטיבית ^17. הכלאה In situ מזהה ביטוי באמצעות תוויות בדיקה ספציפית mRNA מסוים. רדיו תיוג היא שיטת תיוג חזקים רגיש אבל זה דורש טיפול של רדיואקטיביות וזה לוקח כמה שבועות לפני התוצאות ניתן לאתרם. Antigen שכותרתו בדיקות מצד שני, הם יציבים יותר, מסוכנים פחות דורשים חשיפה בינונית גילוי לכמה ימים רק ^17. לפיכך, אנטיגן תיוג שיטות כרגע שולט. השלב הקריטי ביותר ללא תלות בפרוטוקול הוא העיצוב בדיקה. יש להקפיד על מנת לוודא בדיקה יש סגוליות גבוהה התווית UTPs באיכות גבוהה. לפעמים הטמפרטורה הכלאה ו / או אורך התגובה צריך להיות מותאם בדיקות ספציפיות.

פרוטוקול שונה שלנו מבוסס על DIG שכותרתו בדיקות יקל לוקליזציה של ביטוי mRNA בו זמנית מינים החל א thaliana ל פ אשוח, ויש עם שינויים קלים להיות שמיש בכל מיני צמחים אחרים. יש פרוטוקול, ליד האצטרובלים הזכריים, גם נבדק על שלבים שונים של צמח יורה ועל שניהם עוברים zygotic ו סומטיים מ פ אשוח עם תוצאות טובות (תוצאות לא פורסם;. Karlgren ואח').

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride		Sigma-Aldrich	A6404-200ml	minimum 98%
Acrylamide, linear		Ambion	9520
Anti-DIG-antibodies		Roche Applied Science
Blocking reagent		Roche Applied Science	11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A7030-50g	minimum 98%
Deionized formamide		Sigma-Aldrich
Denhardts solution		Sigma-Aldrich	D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate		Sigma-Aldrich
Dextran sulfate		Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)		Roche Applied Science	11175025910
Glutaraldehyde (25%)		Histolab products AB
Glycogen		Ambion	9510G
Histoclear II		Histolab products AB		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax		Histolab products AB		Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde		Sigma-Aldrich	P6148-500g
Paraplast plus		Sigma-Aldrich	P3683-1kg	Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase		Finnzymes
Probe-on Plus slides		Fischer Scientific	22-230-900
Proteinase K		Sigma-Aldrich	P2308-5mg
RNase A		Sigma-Aldrich	R5503-100mg
Tissue-clear		Sakura Finetek Europé BV		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine		Sigma-Aldrich	T1377-100ml	minimum 98%
Triton X-100		use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA		Sigma-Aldrich	83853-100mg
Tween-20		use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue		Promega Corp.