Não-radioativo In situ Protocolo de hibridação Aplicável para a Noruega Spruce e uma variedade de espécies de plantas

Resumo

Nós descrevemos um DIG modificado In situ Protocolo de hibridização, que é rápido e aplicável em uma ampla gama de espécies de plantas, incluindo a Noruega abeto. Com apenas alguns ajustes, incluindo alteradas RNase tratamento e concentração proteinase K, o protocolo pode ser utilizado em estudos de diferentes tecidos e espécies.

Resumo

A tecnologias de alta capacidade de análise de expressão disponíveis hoje dar aos cientistas um estouro de perfis de expressão, mas a sua resolução em termos de expressão tecido específico é limitado devido a problemas em dissecar tecidos individual. Dados de expressão deve ser confirmado e complementado com padrões de expressão usando, por exemplo hibridização in situ, uma técnica utilizada para localizar a expressão de RNAm de células específicas. O método de hibridização in situ é trabalhoso, demorado e muitas vezes exige otimização extensa dependendo da espécie e do tecido. Em experimentos in situ são relativamente mais difíceis de executar em espécies lenhosas, como a Noruega coníferas spruce (Picea abies). Aqui apresentamos uma DIG modificado no protocolo de hibridização in situ, que é rápido e aplicável em uma ampla gama de espécies de plantas, incluindo P. abies. Com apenas alguns ajustes, incluindo alteradas RNase tratamento e concentração proteinase K, poderíamos usar o protocolo para estudar a expressão tecido específico de genes homólogos nos órgãos reprodutivos masculinos de uma gimnosperma e duas espécies de angiospermas; P. abies, Arabidopsis thaliana e Brassica napus. O protocolo funcionou tão bem para as espécies e genes estudados. AtAP3 e BnAP3 foram observados no segundo e terceiro whorl órgãos florais em A. thaliana e B. napus e DAL13 em microsporophylls de cones masculinos de P. abies. Para P. abies a concentração de K proteinase, usado para permeablize os tecidos, teve que ser aumentada para 3 g / ml em vez de 1 g / ml, possivelmente devido aos tecidos mais compactos e níveis mais elevados de compostos fenólicos e polissacarídeos. Para todas as espécies o tratamento RNase foi removido devido a intensidade do sinal reduzida sem um aumento correspondente na especificidade. Ao comparar os padrões de expressão tecido específico de genes homólogos de ambas as plantas floridas e uma árvore conífera demonstramos que a DIG situ no protocolo aqui apresentado, com apenas pequenos ajustes, pode ser aplicado a uma grande variedade de espécies de plantas. Assim, o protocolo evita tanto a otimização espécies extensa específicas ea utilização de sondas trabalhoso marcado radioativamente, em favor de sondas DIG rotulados. Nós escolhemos para ilustrar os passos tecnicamente exigente do protocolo em nosso filme.

Anna Karlgren e Jenny Carlsson contribuíram igualmente para este estudo.

Autores correspondentes: Anna Karlgren em Anna.Karlgren @ ebc.uu.se e Sundström Jens F. em Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Protocolo

Este mRNA não-radioativo em protocolo de hibridização in situ é otimizado para tecidos Noruega spruce e descritos em detalhe. É baseado em uma Arabidopsis / colza no protocolo de hibridização in situ otimizado em nossos grupos, que por sua vez é baseado em protocolos da Meyerowitz e laboratórios de irlandeses e otimizado por Vivian irlandês, Lincoln Cindy e Long Jeff entre outros ^1-4.

PROCEDIMENTO

1. FIXAÇÃO e incorporação de

Para fornecer tecidos retenção de RNA devem ser fixados e embebidos em cera antes de uma experiência in situ é realizada. A fixação e incorporação é um passo crítico, pois materiais mal fixa pode dar um sinal de baixa ou indetectável mesmo que o mRNA é altamente abundante. Os tecidos são desidratadas, limpas e embebidos em cera em mudanças graduais para evitar danos aos tecidos. Também para evitar o encolhimento e inchaço das células de 0,85% NaCl é adicionada ao etanol primeiro passos na desidratação dos tecidos Noruega abeto. É possível deixar de fora o NaCl no etanol (por exemplo, é deixado de fora no protocolo de Arabidopsis / colza). A etapa de desidratação durante a incorporação pode ser realizada no gelo para manter a atividade RNase no mínimo ou no 4 ° C. Neste protocolo a solução correção de 4% paraformaldeído contém glutaraldeído 0,25%, o que é suposto dar uma melhor retenção de RNA, apesar de que alguns argumentam que ele provavelmente não faz diferença (por exemplo, é deixado de fora no protocolo de Arabidopsis / colza). Mais provável de qualquer fixação padrão e protocolo de incorporação pode ser usado. Como pode ser visto abaixo da incorporação spruce Noruega difere ligeiramente do protocolo de Arabidopsis / colza.

1.1 Dia 1 Coleta de material vegetal e fixação paraformaldeído

1. Coletar o material vegetal de interesse e dissecá-lo, se necessário. Manter os tecidos em gelo e colocá-los em solução gelada fix (veja receitas abaixo) direta ou o mais rapidamente possível. NB! Manter no gelo o tempo todo!
2. Aplicar vácuo para as amostras até que o paraformaldeído começa a borbulhar. Manter o vácuo por até três horas (por exemplo 2 x 15 min para Arabidopsis e tecidos florais de colza ou uma hora para cones Noruega spruce masculino) e liberar o vácuo devagar. Os tecidos devem afundar após a infiltração de vácuo do fixador, mas para certos tecidos que contêm uma grande quantidade de ar que não é possível (flores Arabidopsis, por exemplo). Um pedaço de gaze pode ser usada para fazer os tecidos permanecer no fixador.
3. Substituir o fixador e incubar a 4 ° C durante a noite (~ 12-16 horas) agitando.

Opção 1

NB! Noruega versão incorporação enfeitar a seguir (passos 4-8). Faça tubos de cintilação certeza ou frascos de vidro são usadas, pelo menos na etapa 5.

Dia 2 1,2 Desidratação NB! Noruega versão incorporação abeto.

4. 0,85% NaCl	30 min	com gelo
   50% EtOH + NaCl 0,85%	90 min	com gelo
   70% EtOH + NaCl 0,85%	90 min	com gelo

   Pausa! É possível parar por aqui e armazenar os tecidos em 70% EtOH + NaCl 0,85% a +4 ° C durante vários meses.

   85% EtOH + NaCl 0,85%	90 min	4 ° C
   EtOH 95% (+ eosina)	90 min	4 ° C

   NB! Eosina é adicionado para manchar os tecidos rosa tornando-os mais fáceis de detectar, durante a incorporação e de corte, mas pode ser excluída.

   100% EtOH (+ eosina)	90 min	4 ° C
   100% EtOH (+ eosina)	durante a noite	4 ° C

1,3 Dia 3 desidratação e incorporação NB! Noruega versão incorporação abeto.

1. 100% EtOH (+ eosina)	2 h	temperatura ambiente
   EtOH 50% + 50% Histoclear II	1 h	temperatura ambiente
   100% Histoclear II	1 h	temperatura ambiente
   100% Histoclear II	1 h	temperatura ambiente
   50% Histoclear II + Histowax 50%	durante a noite	40-50 ° C

   NB! Na última etapa a concentração de Histowax não é crucial, basta derramar em alguns chips de cera.

Dia 4 1,4 Incorporação NB! Noruega versão incorporação abeto.

6. 100% Histowax derretida

   60 ° C

   (Manhã e noite Alterar)

1,5 Dia 5 Incorporação NB! Noruega versão incorporação abeto.

7. 100% Histowax derretida

   60 ° C

   (Manhã e noite Alterar)

1,6 Dia 6 Incorporação NB! Noruega versão incorporação abeto.

8. 100% Histowax derretida

   60 ° C

   (Manhã e noite Alterar)

   NB! É ok se a cera, ocasionalmente, é alterada uma vez por dia, mas depois leva dois dias para completar um dia de mudanças. A mudança de cera também pode continuar por mais dois dias sem nenhum problema. Isto é recomendado para grandes amostras uma vez que ajuda a infiltração da cera no centro desses tecidos.

Opção 2

NB! Arabidopsis / colza versão incorporação abaixo (passos 4-8).

Dia 2 1,2 Desidratação NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza.

4. NB! Todos os passos a +4 ° C e agitando, se não for indicado outra coisa.

   1x PBS	30 min
   1x PBS	30 min
   30% EtOH	60 min
   40% EtOH	60 min
   50% EtOH	60 min
   60% EtOH	60 min
   70% EtOH	60 min

   Pausa! É possível parar por aqui e armazenar os tecidos em EtOH 70% no 4 ° C durante vários meses.

   85% EtOH	60 min
   EtOH 95% (+ eosina)	durante a noite

   NB! Eosina é adicionado para manchar os tecidos rosa tornando-os mais fáceis de detectar, durante a incorporação e de corte, mas pode ser excluída.

1,3 Dia 3 Desidratação e embedding NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza.

5. NB! Todas as medidas à temperatura ambiente e agitando, se não for indicado outra coisa.

   100% EtOH (+ eosina)	30 min
   100% EtOH (+ eosina)	30 min
   100% EtOH (+ eosina)	60 min
   100% EtOH (+ eosina)	60 min

   NB! Transfira o tecido para frascos de cintilação ou outras (vidro) frascos.

   EtOH 75% + 25% Histoclear II	30 min
   EtOH 50% + 50% Histoclear II	30 min
   EtOH 25% + 75% Histoclear II	30 min
   100% Histoclear II	60 min
   100% Histoclear II	60 min
   100% Histoclear II + ¼ volumes de chips Histowax	durante a noite (sem agitação)

   NB! Na última etapa a concentração de Histowax não é crucial, basta derramar em alguns chips de cera.

Dia 4 1,4 Incorporação NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza.

6. Coloque os frascos com os tecidos na 42 ° C até que a cera derreter completamente fichas. Em seguida adicione ¼ do volume de chips de cera e deixe-os derreter completamente. Mover-se para 60 ° C e deixe os frascos por várias horas. Finalmente, substituir a cera / Histoclear II com cera derretida e recém-incubar durante a noite com 60 ° C.

1,5 Dia 5 Incorporação NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza.

7. 100% Histowax derretida

   60 ° C

   (Manhã e noite Alterar)

1,6 Dia 6 Incorporação NB! Arabidopsis / versão incorporação de colza.

8. 100% Histowax derretida

   60 ° C

   (Manhã e noite Alterar)

   NB! No protocolo de Arabidopsis / colza (comparado com o abeto da Noruega protocol) há um Dia 7 Incorporação da mesma forma como no dia 06/05, ou seja, 100% Histowax derretidos em 60 ° C e mudar manhã e à noite
   NB! É ok se a cera, ocasionalmente, é alterada uma vez por dia, mas depois leva dois dias para completar um dia de mudanças. A mudança de cera também pode continuar por mais dois dias sem nenhum problema. Isto é recomendado para grandes amostras uma vez que ajuda a infiltração da cera no centro desses tecidos.

1,7 Dia 7 Embedding (Dia 8 no protocolo de Arabidopsis / colza) (Film! Detalhes técnicos são mostrados no filme)

9. Pré-aqueça pratos petri e / ou moldes em +60 ° C. Vire sobre um prato quente (60 ° C) e certifique-se Histowax derretido está disponível.
10. Despeje a tecidos e Histowax derretido em uma placa de Petri (ou um molde) colocada sobre a placa quente. Adicione mais Histowax para que os tecidos são cobertos. Aqueça um par de pinças e distribuir os tecidos uniformemente no prato. Encha o prato de petri (ou bolor). Se a cera endurece antes que os tecidos estão na posição certa, aquecê-lo novamente ou remover a cera endureceu com o par de pinças aquecida.
11. Deixe a cera bloco endurecer em temperatura ambiente antes de colocá-lo em 4 ° C. É melhor fazer blocos de cera em vez de incorporar vários tecidos com muita força desde o bloco de cera pode rachar quando as peças são cortadas durante o corte.
    Pausa! Guarde-o em quatro edeg; C. Os tecidos são estáveis ​​durante anos.
    NB! Trabalho livre de RNase esta etapa e partir. Use luvas, DEPC de tratamento de água MilliQ, buffers, copos etc, buffers autoclave e asse vidro etc, quando apropriado.

2. Seccionamento (detalhes Film! técnicas são mostradas no filme)

12. Ligar duas placas quentes (60 ° C e 42 ° C) e certifique-se Histowax derretido está disponível.
13. Aqueça um bisturi e cuidadosamente cortar um bloco de cera de tecido da placa de Petri (pode rachar se um é muito violento), ou removê-lo do molde. Quando um bloco de cera única foi separada, de forma a peça no tamanho certo e de forma para facilitar o corte no micrótomo.
14. A peça de cera deve ter um extra de cera "calcanhar" por baixo do tecido para que ele possa ser anexado ao titular bloco. Aqueça o titular bloco eo calcanhar no prato quente (60 ° C) e fundi-las em conjunto. Pode ser necessário colocar uma gota de Histowax II para fazer a fusão estável. Deixá-lo endurecer a +4 ° C.
15. Corte o bloco de cera em 6-8 mM de espessura conectados em uma longa fita usando um micrótomo.
    NB! Este será mais fácil se o bloco de cera é, entreposto frigorífico ou seja, o bloco de cera no 4 ° C e trazê-lo da geladeira quando se inicia o corte. Ele também pode ser benéfico para manter o frio faca.
16. Estudar as fitas de seções em uma lupa e marcar os únicos a ser usado.
17. Coloque RNase MilliQ água nos slides (Probe-On Plus da Fisher Biotecnologia, que são pré-limpeza e cobrados). Corte a fita em pedaços pequenos e colocá-los ("back" ou no lado "brilhante" para baixo) nos slides. Os slides com as fitas devem ser colocadas em uma placa de 42 C °. A fita deve achatar (isto é importante!) Na água. Deixe as seções sentar por alguns minutos e depois usar um papel Kimwipe / tecido para drenar a água.
18. Deixar as lâminas sobre a placa por 1-2 horas.
19. Incubar as lâminas em 42 ° C durante a noite para que os tecidos aderir a slides.
    Pausa! É recomendável usar as seções o mais rapidamente possível, mas eles podem ser armazenados em caixas fechadas seco com dessecante até vários dias a +4 ° C.

3. O MAKING OF SONDAS

Hibridização in situ detecta expressão usando uma sonda marcada específica para um determinado mRNA. A sonda, que é na maioria das vezes um pedaço de RNA complementar, pode ser marcado com digoxigenina, DIG. DIG é uma molécula pequena, que pode ser conectado a uridina e, assim, incorporado na sonda de RNA e depois detectados usando DIG anticorpos específicos.

A concepção e construção da sonda é o passo mais crítico em um RNA no experimento de hibridização in situ. Cuidados devem ser tomados para garantir que a sonda tem uma alta especificidade e é rotulado com UTPs de alta qualidade. Às vezes, a temperatura de hibridação e / ou comprimento de reação tem que ser ajustado para sondas específicas. Como sempre, os cuidados devem ser tomados para evitar a contaminação RNase.

Antes de rotulagem, isolar um modelo de acordo com os protocolos padrão, por exemplo, utilização de clones de cDNA, PCR-fragmentos, e linearizar o modelo. Fragmentos de sentido e antisense são isoladas e amplificado a partir do modelo utilizando primers gene específico. Para fragmentos de PCR amplificados não usam enzimas que produzem overhangs 3 '. Para todos os fragmentos de uma saliência T7 (ou SP6 ou T3) é adicionada usando primers carregando a T7-seqüência ou usando um vetor com um promotor T7.

O sentido (mRNA ou (- vertente)) sonda têm a mesma sequência do mRNA alvo e não hibridizam ao mRNA alvo, enquanto o antisense (anti-mRNA ou (+) fio) da sonda tem a seqüência complementar e, portanto, hibridizar o alvo dando o sinal de interesse. A sonda sentido é usado como um controle negativo e nenhum sinal será obtida se o experimento funcionou corretamente. Um controle positivo também é necessário, por exemplo, uma sonda que detecta um gene de manutenção da casa. A maioria dos slides deve ser hibridizado com sondas antisense, enquanto apenas alguns slides deve ser hibridizado com as sondas de controle diferentes.

3,1 rotulagem Probe usando transcrição in vitro

Reagentes do RNA DIG Labeling Kit (SP6/T7; 11175025910, Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) ou similares são usados ​​quando a rotulagem das sondas. A reação 20 l descrito aqui deve render ~ mcg 10 de DIG marcado RNA.

20. Fazer uma transcrição in vitro para incorporar nucleotídeos rotulados. Adicionar os seguintes reagentes a um tubo (manter no gelo):

    Ingrediente	volume / quantidade
    10 x mistura rotulagem NTP	2 l
    10 x tampão de transcrição	2 l
    Protector RNase inibidor	1 ml (20U)
    RNA polimerase T7 (SP6 ou T3)	2 l
    DNA molde (500-1000 ng)	mL x
    RNase MilliQ-água	y mL, para um volume final de 18 mL

21. Misture a mistura de rotulagem NTP, tampão de transcrição, RNase inibidor (NB! se a sonda é curto, por exemplo <500bp, você pode aumentar a concentração de inibidor de RNase 40U), DNA polimerase modelo, e água e, em seguida, brevemente centrífuga.
22. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C por 2 horas (NB! se a sonda é curto, por exemplo <500bp, aumente o tempo de reação a 4-6 horas).
23. Adicione 2 mL DNase I e incubar a 37 ° C por 15 min.
24. Parar a reacção adicionando 2 mL 0,2 M EDTA (pH 8,0). Verifique o produto em gel.
25. Precipitar a sonda, adicionando 2,5 mL de 4 M LiCl e 75 mL de> 99,5% de etanol. Misturar bem e incubar a -20 ° C durante a noite (NB! Não use tRNA como operadora. Ao invés disso use glicogênio ou acrilamida de acordo com os fabricantes).
26. Centrifugação (13 000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lave o pellet (pelo menos 10 min 13 000 rpm), duas vezes em etanol 70% (~ 150-300 mL).
27. Remover o sobrenadante e deixar o pellet secar. Ressuspender a sonda em 30 de água livre de RNase mL por 1-2 horas no gelo.
    Pausa! A sonda pode ser armazenado a -20 ° C por mais de um ano.
    NB! Salvar 0,5 mL de amostras a partir do passo 21 (antes da transcrição in vitro), passo 23 (antes do tratamento DNase), passo 24 (após o tratamento DNase, mas antes da precipitação) e 1 mL da amostra a partir do passo 27 (quando a sonda foi ressuspenso). Executar os exemplos em um gel TBE nondenaturating 1%. Se a reação DNase tem trabalhado adequadamente o modelo de banda irá desaparecer. A transcrição in vitro deve gerar uma banda de RNA de espessura de aproximadamente o tamanho correto. Se você ver várias bandas, denaturate as amostras a 80 ° C por 5 minutos seguido de resfriamento em gelo antes de carregar. Se a recuperação a partir do passo 27 parece ruim pode ser assim porque a sonda não foi ressuspenso bem. Incubar a RNA em 55 minutos 50-10 ° C para obtê-lo na solução.

3,2 Hidrólise de sondas de longa

NB! Se a sua sonda é maior do que 150 pb que deve ser reduzida para 50-150 bp para dar um sinal de alta, devido a uma melhor penetração. A sonda pode ser quimicamente degradados em um tampão carbonato (pH 10,2). Se a sonda é do tamanho correto pular a etapa de hidrólise, mas lembre-se de adicionar uma formamida volume, ou seja, 30 mL, para a sonda.

28. Prepare 0,2 M de bicarbonato de sódio (NaHCO ₃₎ e carbonato de sódio 0,2 M (Na ₂ CO _3). Ambos devem ser frescos.
29. Teste os dois buffers através da mistura de 5 ml H ₂ O, 2 ml 0,2 M NaHCO ₃ e ₃ ml 0,2 M Na ₂ CO _3. O pH deve ser 10,2 ~.
30. Calcular o tempo de incubação:

    Tempo de incubação (em minutos) = (L 0 L-f) / (K * L * L 0 f)

    L 0 = comprimento inicial da sonda em kb

    L f = comprimento final da sonda em kb por exemplo = 0,100 kb

    K = taxa constante de hidrólise = 0,11 kb-1min-1

31. Hidrolisar a metade de sua sonda, guardar o resto para mais tarde. Diluir sonda para 50 ul com água livre de RNase e adicionar 20 mL 0,2 M NaHCO ₃ (add primeiro) e 30 mL 0,2 M Na ₂ CO _3. Misturar e incubar a 60 ° C para o tempo de incubação calculado.
32. Pare a reação adicionando 10 ml de 1 M pH 4,7 NaOAc.
33. Precipitar a sonda, adicionando 10 ml 4 M LiCl ₂ e 300 mL ethanol (NB! glicogênio Use ou acrilamida como portador, se necessário). Incubar a -20 ° C durante a noite.
34. Centrifugação (13 000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lave o pellet duas vezes em etanol 70% (~ mL 300). Centrifugação (13 000 rpm), pelo menos, 10 min em cada lavagem a +4 ° C.
35. Remover o sobrenadante e deixar o pellet secar. Ressuspender a sonda em 30 mL RNase MilliQ-água. Adicionar um formamida volume, ou seja, 30 mL, para a sonda.
    Pausa! A sonda pode ser armazenado a -20 ° C por mais de um ano.
    NB! Take 2 mL da sonda unhydrolyzed e 2 mL da sonda hidrolisada (antes da formamida é adicionado) e verificar um gel TBE nondenaturating 1%. Deve haver uma diferença de tamanho entre as duas amostras. As sondas podem precisar ser desnaturado a 80 ° C por 5 minutos seguido de resfriamento em gelo antes de carregar.

4. Hibridização In Situ (detalhes Film! técnicas são mostradas no filme)

Certifique-se que todas as soluções são RNase free! Não é necessário tratar-DEPC tudo, mas usar pelo menos MilliQ autoclavada água. Certifique-se que todos os vidros são aquecidos a 200 ° C durante a noite ou, pelo menos, durante 5 horas. Tratar recipientes de plástico e mexa bares com NaOH 0,1 M com agitação durante a noite. Lavar as embalagens de plástico várias vezes com MilliQ autoclavada-água (~ 500 ml / recipiente). É fundamental lavar os recipientes com cuidado para evitar traços de NaOH que possa perturbar a hibridização. DEPC de tratar todas as soluções estoque, exceto o Tris-buffers. Verifique todas as soluções etc antes de iniciar o experimento para garantir que tudo está disponível. Até a etapa 61 (exceto passos 51-52) mantemos os slides em um rack, que é facilmente movidos entre recipientes.

4.1 No pré-tratamento seção situ

36. Deparaffinize / desidratar seções:

    2x 10 min Histoclear II (use recipientes de vidro)

    2x 1-2 min EtOH 100%

    1-2 min EtOH 95%

    1-2 min EtOH 90%

    1-2 min EtOH 80%

    1-2 min EtOH 60%

    1-2 min EtOH 30%

    1-2 min H 2 O

37. Lavar as lâminas de 15-20 minutos em 2x SSC na sala temp (NB! Prepare o paraformaldeído usado na etapa 42, durante o tempo de incubação).
38. Tratar os tecidos por 30 min com proteinase K a 37 ° C com agitação suave (por exemplo, 1 mg / ml para a Arabidopsis / colza e 3 mg / ml para a Noruega spruce). Mistura e pré-aquecer a 37 ° C 100 mM Tris pH 8 e 50 mM EDTA. Adicionar proteinase K imediatamente antes de tratar os slides. NB! O tratamento proteinase K precisa ser otimizado, dependendo do tecido, espécies de plantas e idade. (NB! Prepare a trietanolamina usado na etapa 45, durante o tempo de incubação).
39. Tratar os slides durante 2 min com 2mg/ml glicina em 1x PBS à temperatura ambiente. (NB! Misture a glicina com PBS um dia antes de usá-lo para garantir que a glicina é devidamente dissolvido).
40. Lavar as lâminas durante 2 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente.
41. Lavar as lâminas durante 2 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente.
42. Incubar as lâminas por 10 minutos com 4% (w / v) paraformaldeído (feito fresco) em 1x PBS pH 7 à temperatura ambiente. Use recipiente de vidro.
43. Lavar as lâminas por 5 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente.
44. Lavar as lâminas por 5 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente. (Dispense anidrido acético na solução no passo 45).
45. Incubar as lâminas por 10 minutos em 0,1 M trietanolamina (pH feitos, frescos 8) e anidrido acético à temperatura ambiente.
46. Lavar as lâminas por 5 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente.
47. Lavar as lâminas por 5 minutos em PBS 1x à temperatura ambiente.
48. Desidratar:

    30 seg EtOH 30%

    30 seg EtOH 60%

    30 seg EtOH 80%

    30 seg EtOH 90%

    30 seg EtOH 95%

    2x 30 seg EtOH 100%

    Pausa! É possível parar aqui e armazenar os slides em um recipiente com uma pequena quantidade de etanol na parte inferior a +4 ° C por várias horas.

4.2 Em hibridização in situ (Film! Detalhes técnicos são mostrados no filme)

Decidir qual slides para usar com as sondagens, não se esqueça de usar os dois sentidos e sondas antisense, bem como um controle positivo. (NB! ProbeOn Além disso slides de Biotecnologia Fisher tem uma cobertura branca que lhes permite ser imprensado em pares durante as etapas de hibridização / detecção do protocolo.) A mesma sonda com a mesma concentração deve ser usado em um par slide específico. Determine solução de hibridização quanto fazer com base no número total de pares de slides. Pré-aqueça o sulfato de Dextran em +60 ° C. A solução de hibridação é muito viscoso do sulfato de dextrano. Colocar a solução de hibridização em 60 ° C e será mais fácil de manusear. Secar as lâminas sobre papel toalha limpo ou Kimwipe / tecido papéis antes de a sonda é aplicada. Os slides devem estar completamente secos. Para cada par de slides adicionar a sonda. É importante testar as concentrações de sonda diferentes (por exemplo, 0,5, 2 e 4 mL) para encontrar a concentração ideal antes do experimento real é pré-formada.

Solução de hibridização	5 pares de diapositivos	10 pares de diapositivos	15 pares de diapositivos	20 pares de diapositivos
10x em sais situ	100 l	200 mL	300 ml	400 mL
formamida deionizada	400 mL	800 mL	1200 mL	1600 mL
50% de sulfato de Dextran (+60 ° C)	200 mL	400 mL	600 mL	800 mL
50x de solução Denhardt	20 l	40 mL	60 mL	80 mL
tRNA (100mg/ml)	10 ml	20 l	30 mL	40 mL
H 2 O (DEPC tratados)	70 mL	140 mL	210 mL	280 mL
Volume total	800 mL	1600 mL	2400 mL	3200 mL

49. Diluir a sonda em água MilliQ-RNase-free para um volume final de 20 mL. Adicionar um volume (mL ou seja 20) formamida à sonda dando um volume total de 40 mL. Aqueça a sonda a 80 ° C por 2 minutos. Colocar no gelo por 2 min. Spin down. Manter a sonda no gelo. Esta sonda-mistura é suficiente para um par de slides. Multiplicam de acordo com o número total de pares de slides para a sonda específica.
50. Adicione 160 ml de solução de hibridização para cada par de slides dando um volume final de 200 mL (ou seja, 160 mL de solução de hibridização da sonda + 40 mL) para cada par de slides. Mix sem gerar bolhas.
51. Aplicar a sonda a um slide e, lentamente, fundir os dois slides juntos. (Imprensando NB! só pode ser feito com Probe-On slides Plus ou slides equivalente. Se slides sem cobertura são usados ​​use lamínulas em vez de sanduíche).
52. Elevar slides acima toalhas de papel molhado em um recipiente de plástico (que veda bem) usando pipetas de plástico. Hibridizar 50-55 ° C durante a noite (12-16 horas).

4.3 Na hibridização in situ de pós (Film! Detalhes técnicos são mostrados no filme)

53. Prepare o de hibridização in situ de pós pelo aquecimento ~ 2 L 0.2x SSC (+55 ° C) e ~ 2 L 1x NTE (+37 ° C) durante a noite. Mais SSC e NTE são necessários se o tratamento RNase (57-59 passos abaixo) é executada.
54. Dip cada par deslizar quente 0.2x SSC (veja acima) para separar e enxaguá-los. Em seguida, colocá-los em um rack em um recipientecom água morna 0.2x SSC.
55. Lavar as lâminas por 60 min em 0,2 x SSC com agitação suave a +55 ° C. (NB! Prepare a solução de bloco Boehringer usado na etapa 63, durante o tempo de incubação).
56. Repita o lava-0.2x SSC por 60 min. (NB! Se o passo RNase é realizada deixar o degelo RNase durante esta incubação, se não continue com a etapa 60.)
57. Opcional: Lavar as lâminas por 5 minutos em água morna 1x NTE (veja acima) a +37 ° C com agitação suave.
58. Opcional: Repita o lava-NTE 1x quente durante 5 min a 37 ° C com agtation gentil.
59. Opcional: Trate os slides com RNase (20 mg / ml de RNase A em 1x NTE) por 30 min a 37 ° C com agitação suave. Em seguida, lave por 5 min no NTE 1x a +37 ° C com agitação suave. Repita a lavagem NTE 1x.
60. Lavar as lâminas por 60 min em 0,2 x SSC a 55 ° C com agitação suave. (NB! Prepare a solução de bloco usado nas etapas de 64-65 e 67, durante o tempo de incubação).
61. Lavar as lâminas por 5 min em 1x PBS à temperatura ambiente (Pause! Você pode armazenar em slides 1XPBS a +4 ° C durante a noite se você quiser continuar no dia seguinte.)
62. Colocar as lâminas no fundo de um recipiente de plástico grande com o lado da amostra.
63. Incubar as lâminas com um bloco% Boehringer em 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl por 45 min em temperatura ambiente com agitação suave. Apenas cobrir as lâminas com a solução de bloqueio. Decantar a solução de bloqueio, enquanto as lâminas ainda estão no recipiente de plástico ou coloque as lâminas em um novo recipiente. Quando vazar fora a solução que o slides geralmente aderir ao recipiente de plástico, mas certifique-se que eles não caem fora do recipiente.
64. Substitua a solução de bloco Boehringer com BSA 1,0% em 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% Triton X-100. Realizar a incubação como na etapa 63.
65. Diluir os anticorpos anti-dig (1:1250, ou seja, 8 mL de anticorpos em 10 ml BSA) na solução de BSA / Tris / NaCl / Triton das 64 etapas. Faça uma poça de solução de anticorpos em um plástico pesam prato. Sanduíche de slides em conjunto para permitir que as forças capilares para puxar para cima a solução. Escorra em Kimwipe / lenço de papel e repita, para tentar evitar bolhas.
66. Elevar slides acima toalhas de papel molhado no recipiente plástico e deixe os slides para sentar-se à temperatura ambiente por 2 horas.
67. Dreno slides sobre Kimwipe / papel de seda e separado. Lugar no fundo do recipiente de plástico como na etapa 63. Lave 4x na solução BSA / Tris / NaCl / Triton. 15 min cada vez, agitação suave na temperatura ambiente.
68. 10 min 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl _2. Lugar no fundo do recipiente de plástico como na etapa 63.
69. Dip de slides em Tris pH 9.5/NaCl/MgCl _dois solução para garantir que todas as de detergente é lavado.
70. Fazer sanduíches e elaborar solução de azul ocidental como em 65. Repetir uma vez.
71. Colocar as lâminas em recipiente plástico acima toalhas de papel molhado na escuridão total (embrulhe em papel alumínio) para 1-5 dias em temperatura ambiente. Verifique após 6, 12 e 24 horas, em seguida, uma vez a cada dia.
72. Slides Escorra, lave em 1xTE para parar a reação. Coloque em lamínulas antes do slides são examinados em microscópio. Os slides podem ser salvos em 1x TE por vários meses, mas tirar fotos o mais rapidamente possível.

RECEITAS / SOLUTIONS STOCK

NB! Use RNase MilliQ água, tanto quanto possível, por exemplo, tratar-DEPC MilliQ-água (Adicionar DEPC 0,1%. Deixe Autoclave durante a noite. (20 minutos a 15 psi, ou seja, 1,05 kg / cm ^2, no ciclo de líquido) ou utilizadas em pelo MilliQ autoclavada água. Ao preparar buffers e soluções estoque também é possível dissolver RNase sais etc DEPC em água tratada, em vez de DEPC-tratamento da buffers e soluções de ações próprias. Se você não tratar a água DEPC- , buffers e ações de soluções, pelo menos esterilizar autoclave ou filtrá-los.
Pausa! Buffers loja e estoque de soluções em temperatura ambiente, se não for indicado outra coisa.
NB! Você pode encontrar muitos dos buffers, bem como dicas sobre como fazê-los em Clonagem Molecular (Sambrook, J., e DW Russell. 2001. Clonagem Molecular Um Manual de Laboratório. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EUA).

Anidrido acético 0,1 M em trietanolamina (pH 8, volume: 800 ml).

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
Trietanolamina	10,4 ml	0,1 M trietanolamina
MilliQ-água	786,4 ml	volume final de 800 ml
HCl	3,2 ml	dando pH8
Anidrido acético	4,8 ml	0,6%

• Para fazer trietanolamina 0,1 M, pH 8,0, diluir 10,4 ml de trietanolamina em 786,4 ml de H ₂ O e adicionar 3,2 ml de HCl para trazer o pH para 8,0 (verifique com indicador de pH).
• Elevar o porta-lâminas com quebrado pipetas de plástico 10 ml ou similar em um recipiente de trietanolamina com uma barra de agitação no fundo.
• Dispensar 4,8 ml de anidrido acético na trietanolamina alguns minutos antes de colocar em slides de modo que é bem misturada.

NB! Fazer a trietanolamina 0,1 M fresco e anidrido acético adicionar um pouco antes de incubação.
NB! Use recipiente de vidro. Trietanolamina tampão tem que ser usado porque o anidrido acético é instável na água.

Gel de agarose (1%) em 1 x TBE (volume: 100 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
Agarose	1 g	1%
1 x TBE	até 100 ml

Mix agarose com 1 x TBE. Calor / ferver até que a agarose derreter. Lançar um gel. Executar o gel em um 1 x TBE.

Sulfato de dextrano

Diluir 5 g de sulfato de Dextran a 10 ml com DEPC tratados MilliQ-água (ou seja, 50% (w / v)) e dissolver em 60 ° C.
Pausa! Armazenar a -20 ° C.

0,5 M EDTA pH8.0 (Titriplex III, volume 500 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
EDTA (372,24 g / mol)	93,06 g	0,5 M EDTA
MilliQ-água	até 500 ml
NaOH	~ 10 g pellets	dando pH 8,0
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Dissolver o EDTA na água (ocorre em pH 8,0), ajustado a um volume final de 500 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.

Fix solução / fixador (passos 1-3, 42) - 4% (w / v) paraformaldeído em PBS 1x, pH 7,0 (650 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
MilliQ-água	585 ml
PBS 10x	65 ml	1x PBS
NaOH 10M	520 mL	pH ~ 11 dando
Paraformaldeído	26 g	4%
HCl concentrado	449 mL	pH ~ 7 dando

• Água de amassamento, PBS e NaOH e calor para 60-70 ° C (a temperatura eo pH elevado irá torná-lo mais fácil de dissolver o paraformaldeído.
• Adicionar (em capela) paraformaldeído.
• Quando a solução cancelou colocá-lo no gelo e ajustar o pH para 7,0 pela adição de 449 mL de HCl concentrado.

NB! Faça fresco.
NB! No glutaraldeído protocolo spruce foi adicionado para uma concentração final de 0,25%, ou seja, 6,5 ml de glutaraldeído 25% para o volume total de 650 ml ou 10 ml de glutaraldeído 25% para o volume total de 1000 ml (lembre-se de reduzir a água com um igual volume).
NB! Adicione algumas gotas de Tween 20 e / ou Triton X-100, após o pH é ajustado, para reduzir a tensão superficial para facilitar a fixação nos passos 1-3. NÃO USE EM PASSO 42!
NB! Ao fixar tecidos da planta um volume menor (por exemplo, 100-200 ml) de fixador é geralmente necessário.

10x em sais situ (volume 100 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
5 M NaCl	60 ml	3M NaCl
1 M pH Tris-Cl 8,0	10 ml	0,100 M Tris
1 M Na fosfato pH 6,8	10 ml	0,100 M Na Fosfato
0,5 M EDTA	10 ml	0,050 M EDTA
MilliQ-água	até 100 ml

Misture um tampão fosfato com pH 6.8 Na (46,3 ml 1 M Na ₂ HPO ₄ + 53,7 ml 1 M NaH ₂ PO _4). Mix NaCl, Tris, Na tampão fosfato, EDTA e água. Autoclave. Pause! Armazenar a -20 ° C.

4 M LiCl ₂ (cloreto de lítio, volume: 100 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
LiCl 2 (42,39 g / mol)	16,956 g	4M LiCl 2
MilliQ-água	até 100 ml
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Dissolver LiCl ₂ em água, ajustar a um volume final de 100 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.
Pausa! Guarde-o em 4 ° C.

1 M MgCl _{2 ·} H ₂ O (cloreto de magnésio, volume: 100 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol)	20,33 g	1 M MgCl 2 · H 2 O
MilliQ-água	até 100 ml
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Dissolver MgCl ₂ na água, ajustar a um volume final de 100 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.
NB! MgCl ₂ é muito higroscópico. Não guarde frascos abertos por longos períodos de tempo.

5 M NaCl (cloreto de sódio, volume: 1 l)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
NaCl (58,44 g / mol)	292,2 g	5 M NaCl
MilliQ-água	até 1l
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

NaCl dissolver na água, ajustar a um volume final de 1 l. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.

1 M pH 4,7 NaOAc (acetato de sódio, volume: 100 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
NaOAc (82,03 g / mol)	0,8203 g	1 M NaOAc
MilliQ-água	até 100 ml
Ácido acético		dando pH 4,7
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Dissolver NaOAc na água. Ajustar o pH para 4,7. Adaptar a um volume final de 100 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.

0,2 M Na ₂ CO ₃ pH11.4 (carbonato de sódio, volume: 10 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
Na 2 CO 3	0,21198 g	0,2 M Na 2 CO 3 pH = 11,4
MilliQ-água	até 10 ml

Dissolver Na ₂ CO ₃ em água; ajustar a um volume final de 10 ml. O pH deve ser 11,4.
NB! Faça fresco.

0,2 M NaHCO ₃ pH8.2 (bicarbonato de sódio, volume: 10 ml)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
NaHCO 3	0,16802 g	0,2 M NaHCO 3: pH = 8,2
MilliQ-água	até 10 ml

Dissolver NaHCO ₃ em água; ajustar a um volume final de 10 ml. O pH deve ser 8.2.
NB! Faça fresco.

1 M Na ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O (ml de volume 500)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol)	88,995 g	1 M Na 2 HPO 4
MilliQ-água	até 500 ml
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Dissolver Na ₂ HPO ₄ em água, ajustar a um volume final de 500 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.

1 M NaH ₂ PO _{4 ·} H ₂ O (ml de volume 500)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol)	68,995 g	1 M NaH 2 PO 4
MilliQ-água	até 500 ml
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Dissolver NaH ₂ PO ₄ em água, ajustar a um volume final de 500 ml. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.

NTE 5x (volume total: 1l)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
5 M NaCl	500 ml	2,5 M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8	25 ml	50 mM Tris-Cl pH 8
0,5 M EDTA	5 ml	5 mM EDTA
MilliQ-água	470 ml	1l volume final

Mix NaCl, Tris, EDTA e água. Não DEPC tratar. Autoclave.

10 x PBS (tampão fosfato) pH 7,0 (volume total: 1l)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
5 M NaCl	260 ml	1,3 M NaCl
1 M Na 2 HPO 4	70 ml	70 mM Na 2 HPO 4
1 M NaH 2 PO 4	30 ml	30 mM NaH 2 PO 4
MilliQ-água	640 ml	1l volume final
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Mix NaCl, Na ₂ HPO _4, NaH ₂ PO ₄ e água. Ajustar o pH para 7,0 com HCl pH. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.

20x SSC pH 7,0 (volume total: 1l)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
NaCl (58,44 g / mol)	175,32 g	3 M NaCl
Na citrato (294,1 g / mol)	88,23 g	0,300 M citrato de sódio
MilliQ-água	até 1 l
HCl		dando pH 7,5
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Dissolva NaCl e Na citrato em ~ 800 ml de água. Ajustar o pH para 7,0 com HCl pH. Ajuste o volume para 1 l com água. Adicionar DEPC 0,1%. Deixe durante a noite. Autoclave.

5 x TBE (volume: 1l)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
Tris (121,14 g / mol)	54 g	~ 0,45 M Tris
Ácido bórico (61,83 g / mol)	27,5 g	~ 0,45 M ácido bórico
EDTA (372,24 g / mol)	3,7 g	~ 0,01 M EDTA
MilliQ-água	até 1l

Mix Tris, ácido bórico, EDTA e água. O pH deve ser ~ 8.3. Diluir a 1 x TBE antes de usar.

10 x TE pH 8,0 (Tris EDTA, volume: 1l)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
1 M Tris-Cl, pH 8,0	100 ml	0,100 M Tris-Cl
0,5 M EDTA pH8.0	100 ml	0,050 M EDTA
MilliQ-água	até 1l

Mix Tris, EDTA e água. Não DEPC tratar. Autoclave.
NB! Tris não devem ser tratados com DEPC! Use RNase em pó e diluir com DEPC-treated/RNase-free MilliQ-água.

1 M Tris-HCl pH 7,5-9,5 (ml de volume 500)

Ingrediente	volume / quantidade	concentração final
Tris (121,14 g / mol)	60,57 g	1 M Tris
MilliQ-água	até 500 ml
HCl		dando pH 7,5
HCl		dando pH 8,0
NaOH		dando pH 9.5

Dissolver em Tris-DEPC água tratada. Ajustar ao pH desejado. Adaptar a um volume final de 500 ml. Autoclave.
NB! Tris não devem ser tratados com DEPC! Use RNase em pó e diluir com DEPC-treated/RNase-free MilliQ-água.
NB! Na clonagem molecular (veja acima), há uma tabela descrevendo quantos concentram HCl é necessária para atingir o pH correto.

MATERIAL E MÉTODOS

O protocolo em situ é apresentado acima e no filme. Informações adicionais aqui do material vegetal e sondas utilizadas neste exemplo específico são descritos.

Material vegetal e delineamento experimental

Cones masculinos de Picea abies [L.] Karst. (Noruega spruce) foram coletados em Uppsala, Suécia, Outono de 2007. Oito cones foram seccionados e as secções decada cone foram utilizados em cada tratamento. Três concentrações proteinase K foram testados, 1, 3 e 5 mg / mL e cada concentração foram tratados com ou sem RNase. Lâminas não tratadas com RNase foram deixados em PBS durante o tratamento RNase. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. e Brassica napus L., foram cultivadas sob condições controladas em uma câmara de cultura com 22 ° C/18 ° C dia / noite temperaturas e fotoperíodo de 16 h. Inflorescências jovens contendo botões florais, estágios 00-10 (estágios de acordo com Smyth ⁵⁾ foram estudados.

sondas cRNA

RNA total foi isolado de P. abies cones masculinos, como descrito anteriormente e de 6 A. thaliana e B. napus usando Trizol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, EUA) e da Qiagen RNeasy Usina Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), respectivamente, de acordo com as recomendações dos fabricantes. O cDNA foi sintetizado 0,5-1 mg RNA total, dependendo da espécie, utilizando Sobrescrito III Transcriptase Reversa (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) seguindo as instruções do fabricante. AtAP3 e BnAP3 sentido e fragmentos antisense e P. fragmentos de sentido abies foram isolados e amplificado utilizando primers gene específico (Tabela 1). DAL13 fragmentos antisense foram isolados e amplificado utilizando primers como na 7. A saliência T7 foi adicionado em fragmentos de A. thaliana e P. abies usando primers reverse modificado carregando a T7-seqüência (Tabela 1). A 500 ​​pb foi isolado utilizando BnAP3 primers específicos (Tabela 1) e clonadas em um vetor pGEM-T com um T7-promotor. Para o P. abies fragmentos todas as reações de PCR foram realizadas em um volume final de 20 l contendo 0,2 U Phusion Fidility alta DNA polimerase (Finnzymes, Espoo, Finlândia), 1x tampão Phusion HF, 200 mM de cada dNTP, 0,3 mM de cada primer e 25-50 ng de cDNA e um programa de PCR padrão foi usado com recozimento temperatura 60-55 ° C (touch-down -1 ° C / ciclo), seguido de 55 ° C. Sondas sentido e antisense cRNA para todas as três espécies foram sintetizados com transcrição in vitro utilizando a DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7; Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha), de acordo com as recomendações do fabricante e sondas de longa foram digeridos para cerca de 100-150 bp fragmentos usando um Na ₂ CO ₃ tampão de acordo com a ^3.

RESULTADOS

Aqui no resultado seção descrevemos três diferentes exemplos de resultados típicos de experimentos in situ.

O mecanismo genético que regula o desenvolvimento reprodutivo em gimnospermas e angiospermas por identidade de órgão especificando masculino e feminino parece ser evolutiva ^09/07 conservada, apesar de que as duas linhagens de plantas de sementes separadas 285,000 mil anos atrás ^10. Em A. thaliana os genes floral homeóticos APETALA3 (AP3 ¹¹⁾ e pistillata (PI ¹²⁾ são necessárias e suficientes para especificar o desenvolvimento reprodutivo do sexo masculino no contexto de uma flor, e esta função parece ser conservada dentro da linhagem das angiospermas ^13. Em gimnospermas, o que falta flores e têm seus órgãos reprodutivos dispostos em separado cones masculinos e femininos (Fig. 1A-C), genes homólogos ao AP3 e PI são especificamente expressos nos órgãos levando o pólen do cone masculino, o microsporophylls ^7,14. Assim, um conjunto semelhante de genes homólogos em ambos os angiospermas e gimnospermas define os órgãos de pólen de rolamento.

Sondas genéticas específicas contra AtAP3 e BnAP3, respectivamente, deu sinais de fase 3 em jovens botões florais em uma região correspondente a whorl dois e três em A. thaliana e B. napus. Na tarde encenado buds os sinais eram restritos a pétalas de desenvolvimento e estames (Fig. 2A e B). Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores ^11,15,16. Sondas direcionados para o homólogo AP3 em P. abies, DAL13, produziu sinais no microsporophylls de P. abies cones masculinos, tanto antes como após o término meristema apical (Fig. 2C e D), como esperado a partir de estudos anteriores ^7,14. Sondas sentido não deu sinal acima de fundo (Fig. 3A-B e os dados não mostrados). Em conjunto, estes resultados demonstram a expressão de A. AP3 thaliana e seus ortólogos em B. napus e P. abies no desenvolvimento de órgãos reprodutivos masculinos.

Figura 1. A.thaliana e B. napus flores e pólen produzir cones masculinos da P. coníferas Imagens mostram abies inflorescências com botões florais e flores abertas de A.thaliana e B.napus em A e B, respectivamente. Note-se que as flores angiospermas além do perianth estéril portos de ambos os sexos órgãos reprodutivos; estames e carpelos. Mostrado na C é um ramo da gimnosperma P. abies com verde e vermelho agulhas vegetativo reprodutiva cones masculinos.

Figura 2. Expressão de A. AP3 thaliana e genes homólogos em B. napus e P. abies. Micrografias mostram cortes longitudinais de A. thaliana e B. inflorescências napus em A e B, respectivamente, e P. abies cones masculinos em C e D. Seções hibridizado com sondas antisense contra AtAP3 em A e B BnAP3 em sinal de show em segundo e terceiro whorl órgãos florais. Números indica estágios florais de acordo com Smyth ^5. Antisense sonda dirigida para o gene DAL13 deu sinal no microsporophylls levando pólen de P. abies cones masculinos, como mostrado no CD. Exemplos de microsporophylls são indicados por setas. Pontas de flecha no ponto AD para sinal de hibridação, que aparece como roxo. Em C e D compostos fenólicos dar cor acastanhada inespecífico para as células individuais da medula central. s, sepal; p, pétala; st, estame; c, carpelo; ms, microsporophyll; pi, medula; pp; pré-pólen células. Bar: 100 mm.

Figura 3. DAL13 expressão em cones masculinos de P. abies. Todos os Micrografias (AH), estão mostrando secções longitudinais de cones masculinos após o término meristema apical. Setas apontam para tipos de células em que DAL13 é expressa. Seções em A e B são hibridizados com uma sonda controle dos sentidos para determinar coloração de fundo. Micrografias C a H são hibridizados com uma sonda antisense DAL13. Seções a partir de experimentos com e sem RNase tratamento são mostrados na D, F, H e C, E, G, respectivamente. Micrografias a partir de experimentos com 1 mg / ml proteinase K são mostrados em C e D, 3 mg / ml em E e F, e 5 mg / ml em G e H. Bar: 100 mm.

Discussão

Dois aspectos do P. abies protocolo foram otimizadas em relação ao A. thaliana / B. napus protocolo, RNase tratamento e proteinase K concentração. A RNase remove sinais de fundo e assim aumentar a especificidade do sinal ^17. O tratamento proteinase K é necessária para permeabilizar o tecido para que a sonda pode entrar e hibridizar para a piscina RNA de interesse. A sonda antisense DAL13 deu um maior sinal sem RNase-tratamento (Fig. 3C, E, G) em comparação com seções tratadas com RNase por 30 min (Figura 2D, F e H). Desde a RNase-tratamento não melhorou o sinal que foi retirado do protocolo. O tratamento proteinase K foram testadas em três concentrações diferentes; 1, 3 e 5 mg / ml. No caso de P. abies um sinal de baixa ou nenhuma foi observada usando 1 mg / ml proteinase K (Fig. 3C-D). Um sinal forte foi obtida com ambos mg 3 / ml (Fig. 3E-F) e 5 mg / ml (Fig. 3G-H) proteinase K. Uma vez que não aparente diferença na força do sinal quando foi encontrado usando 5 mg / ml proteinase K em comparação com 3 mg / ml, optamos por utilizar 3 mg / ml em nosso protocolo. É provável que a necessidade de uma maior concentração proteinase K na P. abies cones masculinos em relação ao A. thaliana e B. botões florais napus é devido a mais de tecido compacto, com níveis mais elevados de compostos fenólicos e polissacarídeos.

Durante a fixação e incorporação de algumas diferenças entre o A. thaliana / B. napus protocolo eo P. abies protocolo são evidentes. O tecido de juro é fixa para fornecer retenção de RNA e este é um passo crítico, pois materiais mal fixa pode dar um sinal de baixa ou indetectável mesmo que o mRNA é altamente abundante. O tecido é desidratado, limpo e embebido em cera em mudanças graduais para evitar danos aos tecidos e, em alguns protocolos de NaCl 0,85% é adicionado ao etanol na desidratação para continuar a evitar o encolhimento e inchaço da ³ células. A etapa de desidratação durante a incorporação pode ser realizada no gelo para manter a atividade RNase no mínimo. No P. abies protocolo de corrigir a solução de 4% paraformaldeído contém glutaraldeído 0,25%, o que é suposto dar uma melhor retenção de RNA ^17, apesar de que alguns argumentam que ele provavelmente não fazem diferença ^3. Depois de cortar o material é fixado em lâminas e pré-tratados (isto é, desparafinados, reidratados, permeabilizadas, tratado para reduzir a ligação não específica da sonda e, finalmente, desidratadas) antes da hibridização.

No protocolo aqui apresentado o procedimento de detecção de todo pode ser realizado em laboratórios comuns, o sinal se desenvolve normalmente dentro de 1-3 dias ea relação entre o sinal sobre o fundo pode ser continuamente monitorado. A DIG sondas marcadas costumam dar um sinal mais distinta em comparação com sondas marcadas radioativos, são mais estáveis ​​e podem ser reutilizados em experimentos consecutivos. Por outro lado, a sensibilidade é reduzida em comparação com sondas radioativas ^17. A hibridização in situ detecta expressão usando uma sonda marcada específico para um determinado mRNA. A marcação é um método de etiquetagem robusta e sensível, mas requer a manipulação da radioatividade e leva várias semanas antes que os resultados podem ser detectados. Antígeno marcado com sondas, por outro lado, são mais estáveis, menos perigosos e exigem uma exposição para o meio de detecção por alguns dias apenas ^{17 anos.} Assim, o antígeno-rotulagem métodos são atualmente dominante. O passo mais crítico independentemente do protocolo é o projeto da sonda. Cuidados devem ser tomados para garantir que a sonda tem uma alta especificidade e é rotulado com UTPs de alta qualidade. Às vezes, a temperatura de hibridação e / ou comprimento de reação tem que ser ajustado para sondas específicas.

Nosso protocolo modificado com base na DIG sondas marcadas irá facilitar a localização de expressão de mRNA, simultaneamente, em espécies que variam de A. thaliana a P. abies, e deve, com pequenos ajustes ser usado em outras espécies vegetais. O protocolo tem, ao lado de cones masculinos, também foi testado em diferentes estágios de brotos vegetativos e em embriões de ambos os zigóticos e somáticos de P. abies com bons resultados (resultados não publicados;. Karlgren et al).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride	Sigma-Aldrich	A6404-200ml	minimum 98%
Acrylamide, linear	Ambion	9520
Anti-DIG-antibodies	Roche Group
Blocking reagent	Roche Group	11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50g	minimum 98%
Deionized formamide	Sigma-Aldrich
Denhardts solution	Sigma-Aldrich	D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich
Dextran sulfate	Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)	Roche Group	11175025910
Glutaraldehyde (25%)	Histolab
Glycogen	Ambion	9510G
Histoclear II	Histolab		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax	Histolab		Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500g
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	P3683-1kg	Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase	Finnzymes
Probe-on Plus slides	Fisher Scientific	22-230-900
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308-5mg
RNase A	Sigma-Aldrich	R5503-100mg
Tissue-clear	Sakura Finetek		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	T1377-100ml	minimum 98%
Triton X-100	use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA	Sigma-Aldrich	83853-100mg
Tween-20	use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue	Promega Corp.