Radyoaktif olmayan In situ Hibridizasyon Norveç Ladin Uygulanacak Protokol ve Bitki Türlerinin Aralığı

Özet

Biz değiştirilmiş bir DIG tarif In situ Hızlı ve bitki türlerinin Norveç ladin de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygulanabilir hibridizasyon protokol. Değişmiş RNaz tedavi ve proteinaz K konsantrasyonu da dahil olmak üzere sadece birkaç ayarlama ile protokol farklı dokular ve tür çalışmalarda kullanılıyor olabilir.

Özet

Yüksek verimlilik ifade analizi teknolojileri bugün mevcut bireysel dokuların diseksiyon sorunları nedeniyle sınırlı bilim adamları ifade profilleri taşması ancak doku özgü ifade açısından çözünürlük vermek. İfade verileri doğruladı ve lokalize hücre spesifik mRNA in situ hibridizasyon, kullanılan bir tekniktir örneğin kullanarak ifade desenleri ile tamamlanabilir. In situ hibridizasyon yöntemi zahmetli, zaman alıcı ve genellikle türler ve doku bağlı olarak kapsamlı iyileştirmeye ihtiyaç duyar. Yerinde deneylerde kozalaklı Norveç ladin (Picea abies) gibi odunsu türler gerçekleştirmek için nispeten daha zor. Burada P. de dahil olmak üzere bitki türlerinin geniş bir yelpazede hızlı ve uygulanabilir in situ hibridizasyon protokolü, modifiye edilmiş bir DIG mevcut abies. Değişmiş RNaz tedavi ve proteinaz K konsantrasyonu da dahil olmak üzere sadece birkaç ayarlama ile, doku spesifik genlerin homolog gymnosperm bir erkek üreme organları ve iki Angiosperm türler ifade çalışma protokolü kullanmak; P. abies, Arabidopsis thaliana ve Brassica napus. Protokol incelenen türler ve genler için de aynı derecede iyi çalıştı. AtAP3 ve BnAP3 A'da ikinci ve üçüncü parmak izindeki kabarıklık çiçek organları gözlendi thaliana ve B. P. erkek kozalaklar microsporophylls napus ve DAL13 abies. P. için abies dokular permeablize için kullanılan proteinaz K konsantrasyonu, 3'e yükselmiştir gerekiyordu 1 g / ml yerine muhtemelen daha kompakt bir doku ve fenolik ve polisakkaritler daha yüksek seviyelere nedeniyle g / ml. Tüm türler için RNaz tedavi özgüllüğü karşılık gelen bir artış olmadan sinyal gücünün azalması nedeniyle kaldırıldı. Çiçekli bitkiler ve iğne yapraklı ağaç hem homolog genler doku spesifik ekspresyonu karşılaştırarak, yerinde protokolde DIG sadece dakika ayarlamaları ile, burada sunulan gösteren bitki türlerinin geniş bir yelpazede uygulanabilir. Bu nedenle, protokol geniş türlerin özel optimizasyon ve zahmetli DIG etiketli probları lehine radyoaktif etiketli probların kullanımı önler. Biz filmimizde de protokolün teknik zorlu adımları göstermek için seçtik.

Anna Karlgren ve Jenny Carlsson, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

Sorumlu yazarlar: Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se Anna.Karlgren @ ebc.uu.se ve Jens F. Sundström Anna Karlgren

Protokol

Bu radyoaktif olmayan in situ hibridizasyon protokol mRNA Norveç ladin dokular için optimize edilmiş ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır. In situ hibridizasyon protokol Meyerowitz ve İrlanda laboratuarları da protokollerin dayanmaktadır ve diğerleri ^1-4 arasında Vivian İrlanda, Cindy Lincoln ve Jeff Uzun optimize gruplar, optimize edilmiş bir Arabidopsis / kolza dayanmaktadır .

PROSEDÜRÜ

1. FİKSASYON ve gömme

RNA tutma dokular sağlamak için bir yerinde deney yapılmadan önce sabitlenmiş ve balmumu gömülü gerekir. Fiksasyon ve gömme kötü sabit malzeme mRNA oldukça bol olsa da düşük veya belirlenemeyen bir sinyal verebilir kritik bir adımdır. Dokular temizlendi ve doku hasarı önlemek için yavaş yavaş değişiklikler balmumu gömülü, kurutulmuş. Norveç ladin dokuların dehidratasyon ilk etanol adımları% 0,85 NaCl eklenir hücrelerin büzülme ve şişme önlemek için. Etanol içinde NaCl (örneğin Arabidopsis / kolza protokol dışında kalan) terk etmek mümkündür. Gömme sırasında dehidrasyon adım ° C en az 4 veya az RNaz aktivite tutmak için buz üzerinde yapılabilir Bu protokolde% 4 paraformaldehid düzeltme çözüm olsa bile bazıları muhtemelen hiçbir fark yapar (örneğin Arabidopsis / kolza protokol dışında kalan) olduğunu iddia olduğunu daha iyi bir RNA tutma vermek gerekiyordu% 0.25 glutaraldehid içerir. Büyük olasılıkla, herhangi bir standart tespiti ve gömme protokol kullanılabilir. Norveç ladin gömme aşağıda görüldüğü gibi Arabidopsis / kolza protokolünden biraz farklıdır.

1.1 Gün 1 Toplama bitki materyali ve paraformaldehid fiksasyon

1. Ilgi bitki materyali toplayın ve gerekirse teşrih. Dokuların buz üzerinde tutun ve mümkün olan en kısa sürede doğrudan ya da (aşağıda tarifleri görmek) düzeltme çözüm buz koyun. NB! Buz üzerinde her zaman tutun!
2. Paraformaldehid kabarcık başlayıncaya kadar örnekleri vakum uygulayın. Üç saat kadar (örneğin 2 x 15 dakika Arabidopsis ve kolza tohumu çiçek dokuların veya Norveç ladin erkek konileri bir saat) için vakum vakum tutun ve yavaşça bırakın. Dokuların fiksatif vakum infiltrasyon sonra lavaboya gerekiyordu, ama hava çok içeren belirli dokular için mümkün değildir (örn. Arabidopsis çiçekler). Dokuların fiksatif kalmak yapmak için kullanılan gazlı bez parçası olabilir.
3. +4 ° C gece (12-16 saat) hafifçe sallayarak fiksatif ve inkübe değiştirin.

Seçenek 1

Dikkat! Aşağıdaki Norveç ladin gömme sürümü (adımları 4-8). , Emin sintilasyon tüpler olun ya da cam şişe, en az 5 adım kullanılır.

1.2 Gün 2 Dehidrasyon NB! Norveç ladin gömme versiyonu.

4. % 0,85 NaCl	30 dk.	buzlu
   % 50 EtOH +% 0.85 NaCl	90 dakika	buzlu
   % 70 EtOH +% 0.85 NaCl	90 dakika	buzlu

   Pause! +4 ° C'de birkaç ay boyunca burada durun ve dokuların% 70 EtOH +% 0.85 NaCl saklamak mümkündür.

   % 85 EtOH +% 0.85 NaCl	90 dakika	+4 ° C
   % 95 EtOH (+ eosin)	90 dakika	+4 ° C

   Dikkat! Eozin dokuların daha kolay gömme ve kesit sırasında tespit etmek için pembe leke eklendi ama dışarıda olabilir.

   % 100 EtOH (+ eosin)	90 dakika	+4 ° C
   % 100 EtOH (+ eosin)	bir gecede	+4 ° C

1.3 Gün 3 Dehidrasyon ve NB gömme! Norveç ladin gömme versiyonu.

5. % 100 EtOH (+ eosin)	2 saat	oda sıcaklığı
   % 50 EtOH +% 50 Histoclear II.	1 saat	oda sıcaklığı
   % 100 Histoclear II	1 saat	oda sıcaklığı
   % 100 Histoclear II	1 saat	oda sıcaklığı
   % 50 Histoclear II +% 50 Histowax	bir gecede	40-50 ° C

   Dikkat! Son adım Histowax konsantrasyonu önemli değildir, sadece bazı balmumu fiş dökün.

1.4 4. Gün gömülmesi NB! Norveç ladin gömme versiyonu.

6. % 100 erimiş Histowax

   +60 ° C

   (Sabah ve akşam değiştir)

1,5 Gün 5 gömülmesi NB! Norveç ladin gömme versiyonu.

7. % 100 erimiş Histowax

   +60 ° C

   (Sabah ve akşam değiştir)

1,6 Gün 6 Gömme NB! Norveç ladin gömme versiyonu.

8. % 100 erimiş Histowax

   +60 ° C

   (Sabah ve akşam değiştir)

   Dikkat! Balmumu zaman zaman günde bir kez değişti ise, bu tamam, ancak daha sonra değişikliklerin bir gün tamamlamak için iki gün sürer . Balmumu değişim de bir sorun olmadan ekstra iki gün boyunca devam edebilir. Bu dokuların merkezi haline balmumu infiltrasyon yardımcı olur bu yana büyük örnekler için tavsiye edilir .

Seçenek 2

Dikkat! Aşağıdaki Arabidopsis / kolza gömme sürümü (adımları 4-8).

1.2 Gün 2 Dehidrasyon NB! Arabidopsis / kolza gömme versiyonu.

4. Dikkat! Başka bir ifade edilmektedir ise Tüm adımları +4 ° C ve hafifçe sallayarak.

   1x PBS	30 dk.
   1x PBS	30 dk.
   % 30 EtOH	60 dakika
   % 40 EtOH	60 dakika
   % 50 EtOH	60 dakika
   % 60 EtOH	60 dakika
   % 70 EtOH	60 dakika

   Pause! +4 ° C'de birkaç ay boyunca burada durun ve dokuların% 70 EtOH saklamak mümkündür.

   % 85 EtOH	60 dakika
   % 95 EtOH (+ eosin)	bir gecede

   Dikkat! Eozin dokuların daha kolay gömme ve kesit sırasında tespit etmek için pembe leke eklendi ama dışarıda olabilir.

1.3 Gün 3 Dehidrasyon ve embedding NB! Arabidopsis / kolza gömme versiyonu.

5. Dikkat! Tüm adımları ve oda sıcaklığında yavaşça else if, titreme belirtilmiştir.

   % 100 EtOH (+ eosin)	30 dk.
   % 100 EtOH (+ eosin)	30 dk.
   % 100 EtOH (+ eosin)	60 dakika
   % 100 EtOH (+ eosin)	60 dakika

   Dikkat! Sintilasyon şişeleri veya diğer (cam) şişeleri doku aktarın.

   % 75 EtOH +% 25 Histoclear II.	30 dk.
   % 50 EtOH +% 50 Histoclear II.	30 dk.
   % 25 EtOH +% 75 Histoclear II.	30 dk.
   % 100 Histoclear II	60 dakika
   % 100 Histoclear II	60 dakika
   % 100 Histoclear II + ¼ hacimleri Histowax çip	gece (yok sallayarak)

   Dikkat! Son adım Histowax konsantrasyonu önemli değildir, sadece bazı balmumu fiş dökün.

1.4 4. Gün gömülmesi NB! Arabidopsis / kolza gömme versiyonu.

6. Balmumu yongaları tamamen eriyip +42 ° C ye kadar dokuları ile şişeleri yerleştirin. Sonraki ¼ balmumu cips hacmi ve tamamen erimesine izin verin. Ile +60 taşı ° C ve birkaç saat için şişeleri bırakın. Son olarak, gece boyunca +60 az taze erimiş balmumu ve inkübe ° C ile yerine balmumu / Histoclear II.

1,5 Gün 5 gömülmesi NB! Arabidopsis / kolza gömme versiyonu.

7. % 100 erimiş Histowax

   +60 ° C

   (Sabah ve akşam değiştir)

1,6 Gün 6 Gömme NB! Arabidopsis / kolza gömme versiyonu.

8. % 100 erimiş Histowax

   +60 ° C

   (Sabah ve akşam değiştir)

   Dikkat! Arabidopsis / kolza protokolü (Norveç ladin protokolü ile karşılaştırıldığında), aynı şekilde bir gün 5-6 Gün 7 gömülmesi, +60 yani% 100 ° C ve değişim sabah ve akşam erimiş Histowax
   Dikkat! Balmumu zaman zaman günde bir kez değişti ise, bu tamam, ancak daha sonra değişikliklerin bir gün tamamlamak için iki gün sürer . Balmumu değişim de bir sorun olmadan ekstra iki gün boyunca devam edebilir. Bu dokuların merkezi haline balmumu infiltrasyon yardımcı olur bu yana büyük örnekler için tavsiye edilir .

1,7 Gün 7 Gömme (Arabidopsis / kolza protokol Gün 8) (Film! Teknik detaylar film gösterilmiştir)

9. Onceden Petri +60 az yemekleri ve / veya kalıplar ° C Sıcak bir tabak açın (+60 ° C) ve erimiş Histowax mevcut olduğundan emin olun.
10. Doku ve erimiş Histowax sıcak plaka üzerine yerleştirilen bir petri (ya da bir kalıp) içine dökün. Dokularda kaplıdır, böylece daha fazla Histowax ekleyin. Bir cımbız Isı ve dokuların çanak eşit dağıtmak. Petri (veya kalıp) doldurun. Dokulara doğru pozisyonda önce balmumu sertleşir, tekrar ısınır veya cımbız ısıtmalı çifti ile sertleştirilmiş balmumu çıkarın.
11. +4 Koymadan önce oda sıcaklığında mum blok sertleşmesine izin verin ° C Bu parçaların kesit sırasında kesilir mum blok çatlak olabilir bu yana çok sıkı dokular gömme yerine birkaç mum blok yapmak için daha iyidir.
    Pause! 4 ve saklayınder; C. Dokular yıl boyunca stabildir.
    Dikkat! Bu adım ve sonrası RNaz ücretsiz çalışın. Eldiven kullanın, MilliQ suyu, tamponlar, cam vb, otoklav tamponlar ve fırında cam vb uygun DEPC davranın.

2. Kesit (Film! Teknik detaylar film gösterilmiştir)

12. Iki sıcak plakalar açın (+60 ° C ile +42 ° C) ve erimiş Histowax mevcut olduğundan emin olun.
13. Bir neşter Isı ve doku petri (bir çok şiddetli ise çatlak olabilir) bir mum blok dikkatli bir şekilde kesip, ya da kalıp çıkarın. Tek bir mum blok ayrılmış edildiğinde, mikrotom dilimleme kolaylaştırmak için doğru boyut ve şekil parça şekli.
14. Balmumu parçası blok tutucu takılabilir, böylece doku altında ekstra bir mum "topuk" olmalıdır. Blok tutucu ve topuk sıcak plaka (+60 ° C) Isı ve onları bir arada kaynaştırmak. Füzyon kararlı hale Histowax II bir damla koymak için gerekli olabilir. +4 Sertleşmesine Let it ° C.
15. Mum blok bir mikrotom kullanarak uzun bir şerit bağlı 6-8 mikron kalınlığında kesitler halinde kesin.
    Dikkat! Mum blok soğuk, yani mağaza +4 mum blok ise, bu daha kolay olacaktır ° C ve kesme başlatırken buzdolabı getirmek. Ayrıca bıçak soğuk tutmak için yararlı olabilir.
16. Bir büyüteç bölümlere kurdeleler Eğitim ve kullanılacak olanları işaretleyiniz.
17. (Probe-Plus Fisher Biyoteknoloji, önceden temizlenmiş ve tahsil edilir) slaytlar RNaz ücretsiz MilliQ su koyun. Küçük parçalar halinde kesin ve şerit slaytlar (aşağı "geri" ya da "parlak" tarafı) koyun. Slaytlar kurdeleler ile +42 ° C plaka konulmalıdır. Şerit su (bu çok önemli!) Düzleştirmeniz gerekir. Bölümlerde birkaç dakika otur ve sonra su drenaj Kimwipe / kağıt mendil kullanın.
18. 1-2 saat için plaka üzerinde slaytlar bırakın.
19. Dokuların slaytlara uygun ° C gecede böylece 42 slaytları inkübe edin.
    Pause! Kısa sürede bölümleri kullanılması tavsiye edilir, ama onlar 4 birkaç gün kadar kurutucu ° C ile kapalı kutular içinde kuru saklanabilir

3. PROBLARI VE VERME

In situ hibridizasyon etiketli belirli bir mRNA'nın prob özgü kullanarak ifade algılar. En sık, tamamlayıcı RNA bir parçası olan prob, digoxigenin, DIG ile etiketlenir. DIG üridin bağlanır ve böylece DIG-spesifik antikorların kullanılarak tespit RNA prob dahil olabilir, küçük bir moleküldür.

In situ hibridizasyon deneyi bir RNA prob tasarımı ve yapımında en önemli adımdır. Bakım prob yüksek bir özgüllük ve yüksek kalite UTPs ile etiketlenmiş emin olmak için alınmalıdır. Bazen hibridizasyon sıcaklık ve / veya spesifik problar için tepki süresini ayarlanması gerekir. Her zaman olduğu gibi, RNaz kirlenmesini önlemek için dikkat edilmelidir.

Tanımlamadan önce, standart protokollere göre bir şablon izole, örneğin cDNA klonları, PCR-parçaları, kullanımı ve şablonu linearize. Duyu ve antisens parçaları izole ve gen spesifik primerler kullanılarak şablon güçlendirilir. PCR amplifiye parçaları 3 'çıkıntılar üreten enzimler kullanmayın. Bütün parçaları bir T7 (veya SP6 veya T3) çıkıntı T7-dizisi taşıyan primerler kullanılarak ya da bir T7-organizatörü bir vektör kullanılarak eklenir.

Duygusu (mRNA veya (-) iplikçik) prob hedef mRNA aynı dizi var ve hedef mRNA melezler, antisens (anti-mRNA veya (+) iplikçik) prob tamamlayıcı bir dizisi var ve böylece melezler ilgi sinyal veren hedef. Anlamda prob negatif kontrol olarak kullanılır ve deney düzgün çalışıp çalışmadığını hiç sinyal elde edilecektir. Pozitif kontrol probu, örneğin, bir ev tutarak gen tespit ihtiyaç vardır. Yalnızca birkaç slayta farklı kontrol probları melezleşmiştir olmalıdır slaytlar çoğunluğu, antisens problar ile melezleşmiştir olmalıdır.

3.1 in vitro transkripsiyon kullanarak Probe etiketleme

DIG RNA Etiketleme Kit (SP6/T7; 11175025910 Roche, Uygulamalı Bilimler, Mannheim, Almanya) Reaktifler probları etiketleme veya benzer kullanılır. ~ 10 mg DIG etiketli RNA verim 20 ul tepki olarak tanımlanmıştır.

20. Etiketli nükleotidler dahil etmek için bir in vitro transkripsiyon olun. Bir tüp (buz üzerinde) tutmak için aşağıdaki reaktifler ekleyin:

    Bileşen	birim / miktar
    10 x NTP etiketleme karışımı	2 ul
    10 x Transkripsiyon tampon	2 ul
    Protector RNaz inhibitörü	1 ul (20U)
    RNA T7 polimeraz (SP6 veya T3)	2 ul
    DNA (500-1000 ng)	x ul
    RNaz-free MilliQ su	y son hacim 18 ul ul,

21. NTP etiketleme karışımı, transkripsiyon tampon, RNaz inhibitörü Mix (NB! probu kısa ise, örneğin <500bp 40U için RNaz inhibitörü konsantrasyonu artırabilir), polimeraz, DNA ve su ve ardından kısa bir süre santrifüj.
22. Reaksiyon karışımı inkübe 37 ° C 2 saat boyunca (NB! probu kısa ise, örneğin <500bp, tepki süresi 4-6 saat artış).
23. 15 dakika için 37 az 2 ul DNaz I ve inkübe ° C ekleyin.
24. 2 ul 0.2 M EDTA (pH 8.0) ekleyerek reaksiyonu durdurun. Jel ürünü kontrol edin.
25. 4 M LiCl ve 75 ul>% 99,5 oranında etanol 2.5 ul ekleyerek prob çöktürün. İyice karıştırın ve -20 inkübe ° C gecede (taşıyıcı olarak NB! tRNA kullanmayın. Glikojen veya akrilamid üreticilerine göre yerine kullanın).
26. +4 Az 30 dakika santrifüj (13 000 rpm) ° C ve süpernatant kaldırmak. % 70 etanol pelet (en az 10 dk 13 000 rpm) iki kez yıkayın (~ 150-300 ul).
27. Süpernatantı ve pelet kurumaya bırakın. Buz üzerinde 1-2 saat 30 ul RNaz içermeyen su prob tekrar
    Pause! Prob bir yıldan fazla bir süre -20 ° C'de saklanabilir .
    Dikkat! Adım 21 (in vitro transkripsiyon önce), 23 (DNaz tedavi öncesi) adım adım 24 adım 27 (prob edildiğinde (DNaz tedavi sonrası, ancak yağış önce) 0.5 ul örnekleri kaydedin ve 1 ul örnek ) yeniden süspanse. Nondenaturating 1% TBE jel örnekleri çalıştırın. DNaz reaksiyon çalıştı düzgün bir şablon-band kaybolacaktır. In vitro transkripsiyon yaklaşık olarak doğru boyutta, kalın bir RNA bant oluşturmak gerekir . Birden fazla bantları görürseniz, yüklemeden önce buz üzerinde su verme takiben 5 dakika için +80 ° C'de örnekleri denaturate. 27 adım kurtarma kötü görünüyorsa, prob yeniden süspanse değildi çünkü o kadar olabilir . ° C'de 5-10 dakikada bir çözüm içine almak için +55 RNA inkübe edin.

3.2 Hidroliz uzun problar

Dikkat! Prob 150 bp daha büyükse daha iyi nüfuz nedeniyle yüksek sinyal vermek için 50-150 bp azaltılmalıdır. Prob kimyasal karbonat tamponu (pH 10.2) bozulmuş olabilir. Prob, hidroliz adımı atlayın doğru boyutu, ancak prob bir hacim formamid, yani 30 ul eklemeyi unutmayın .

28. 0.2 M sodyum bikarbonat (NaHCO ₃₎ ve 0.2 M sodyum karbonat (Na ₂ CO ₃₎ hazırlayın. Her ikisi de taze olmalıdır.
29. Karıştırma 5 ml H ₂ O, 2 ml 0.2 M NaHCO ₃ ve 3 ml 0,2 M Na ₂ CO ₃ ile iki tamponlar sınayın. PH ~ 10.2 olmalıdır.
30. Inkübasyon süresi hesaplayın:

    Kuluçka süresi (dakika) = (L 0-L f) / (K * L 0 * L f)

    Kb probu L 0 = başlangıç ​​süresini

    L f = prob kb son uzunluğu = örneğin 0.100 kb

    Hidroliz = 0.11 kb-1dk-1 için K = hız sabiti

31. Hidroliz prob yarısı, daha sonra geri kalanını kurtarmak. RNaz ücretsiz su ile 50 ul prob seyreltilir ve 20 ul 0.2 M NaHCO ₃ (ilk yorum) ve 30 ul 0,2 M Na ₂ CO ₃ ekleyin. Mix ve hesaplanan inkübasyon süresi +60 ° C'de inkübe.
32. 1 M NaOAc pH 4.7 10 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun.
33. 10 ul 4 M LiCl ₂ ve 300 ul ethano ekleyerek prob çöktürünl (Gerekirse taşıyıcı olarak NB! Kullanım glikojen veya akrilamid,). Gecede -20 ° C'de inkübe edin.
34. +4 Az 30 dakika santrifüj (13 000 rpm) ° C ve süpernatant kaldırmak. % 70 etanol (~ 300 ul) pelet iki kez yıkayın. Her yıkama +4 Santrifüj (13 000 rpm) en az 10 dakika ° C
35. Süpernatantı ve pelet kurumaya bırakın. 30 ul RNaz ücretsiz MilliQ su prob tekrar Prob bir hacim formamid, yani 30 ul ekleyin.
    Pause! Prob bir yıldan fazla bir süre -20 ° C'de saklanabilir .
    Dikkat! Hidrolize olmamış prob 2 ul ul ve hidrolize prob 2 (formamid eklenir önce) alın ve bir nondenaturating% 1 TBE jel üzerinde olmadığını kontrol edin. Iki örnek arasındaki boyut farkı olmamalıdır. Probları yüklemeden önce buz üzerinde su verme takiben 5 dakika için +80 ° C'de denatüre edilmesi gerekebilir.

4 in situ hibridizasyon (Film! Teknik detaylar film gösterilmiştir)

Tüm çözümler RNaz ücretsiz olduğunu emin olun! Her şey DEPC tedavisi için gerekli değildir, ama en azından otoklavlanmış MilliQ-su kullanmayın. Tüm cam 200 ısıtılmış olduğundan emin olun ° C gece veya en az 5 saat. Plastik kaplar davranın ve 0.1 M NaOH ile barlar gece ajitasyon ile karıştırın. Otoklavlanmış MilliQ-su (~ 500 ml / konteyner) ile plastik kaplarda birkaç kez durulayın. Hibridizasyon rahatsız olabilir NaOH izlerini önlemek için kaplar dikkatle durulamak için çok önemlidir. DEPC tedavi Tris-tamponlar hariç, tüm hisse senedi çözümleri. Her şeyin mevcut olduğunu garanti deney başlamadan önce tüm çözümler vb kontrol edin. Adım 61 (hariç adımları 51-52) kadar konteynerler arasında kolayca taşınır bir raf, slaytlar tutun.

4.1 yerinde bölümünde tedavi öncesi

36. Deparaffinize / kurutmak bölümleri:

    2x 10 dakika Histoclear II (cam kaplar kullanın)

    2x 1-2 dk% 100 EtOH

    1-2 dakika% 95 EtOH

    1-2 dakika% 90 EtOH

    1-2 dakika% 80 EtOH

    1-2 dakika% 60 EtOH

    1-2 dk 30% EtOH

    1-2 dk H 2 O

37. Slaytlar, oda sıcaklığında (NB! adım 42 inkübasyon süresi boyunca kullanılan paraformaldehid hazırlayın), 2x SSC 15-20 dk yıkayınız .
38. 37 proteinaz K ile 30 dakika dokuların davranın ° C yavaşça sallanarak (örneğin 1 Arabidopsis / kolza için mcg / ml ve Norveç ladin için 3 mg / ml). 37 ile karıştırın ve ön ısıtma ° C 100 mM Tris pH: 8 ve 50 mM EDTA. Proteinaz K slaytlar tedavisinde hemen önce ekleyin. NB! Proteinaz K tedavisi, doku, bitki türleri ve yaşa bağlı olarak optimize edilmesi gerekiyor . (NB! inkübasyon süresi boyunca 45 adım kullanılan trietanolamin hazırlayın).
39. 1x PBS içinde 2mg/ml glisin ile oda sıcaklığında 2 dakika süreyle slaytlar davranın. (NB! glisin düzgün bir şekilde çözülmüş olduğundan emin olmak için bir gün önce PBS ile glisin Mix).
40. Slaytlar 1x PBS içinde oda sıcaklığında 2 dakika yıkayın.
41. Slaytlar 1x PBS içinde oda sıcaklığında 2 dakika yıkayın.
42. Slaytları 1x PBS pH 7 oda sıcaklığında% 4 (w / v) paraformaldehid (taze yapılmış) ile 10 dakika inkübe edin. Cam kap kullanın.
43. Slaytlar, oda sıcaklığında 1x PBS 5 dakika yıkayınız.
44. Slaytlar, oda sıcaklığında 1x PBS 5 dakika yıkayınız. (45 adım çözüm asetik anhidrit Uygulama).
45. Slaytlar 0.1M trietanolamin (taze, pH 8 yapılan) ve asetik anhidrit oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
46. Slaytlar, oda sıcaklığında 1x PBS 5 dakika yıkayınız.
47. Slaytlar, oda sıcaklığında 1x PBS 5 dakika yıkayınız.
48. Dehydrate:

    30 sn% 30 EtOH

    30 sn 60% EtOH

    30 sn% 80 EtOH

    30 sn% 90 EtOH

    30 sn% 95 EtOH

    2x 30 sn 100% EtOH

    Pause! +4 ° C'de birkaç saat boyunca burada durdurmak ve slaytlar alt EtOH küçük bir miktar ile bir kapta saklamak mümkündür.

4.2 in situ hibridizasyon (Film! Teknik detaylar film gösterilmiştir)

Hangi probları ile kullanmak için slaytlar karar duygusu ve antisens probların yanı sıra pozitif kontrol etmeyi unutmayın. (NB! ProbeOn Plus Fisher Biyoteknoloji slaytlar onları protokol hibridizasyon / algılama adımları sırasında çiftleri içine sıkışmış olmasını sağlar beyaz buzlanma var.) Belirli bir slayt çifti aynı konsantrasyon ile aynı prob kullanılmalıdır. Toplam slayt çiftleri sayısı dayalı yapmak için ne kadar hibridizasyon çözümü belirleyin. Onceden +60 ° C Dextran'ın sülfat Hibridizasyon çözüm Dekstran sülfat çok viskoz. Hibridizasyon çözümü koyun +60 ° C ve kolay olacaktır. Prob uygulanmadan önce temiz bir kağıt havlu ya da Kimwipe / doku kağıtları slaytlar kurumaya. Slaytlar tamamen kuru olmalıdır. Slaytlar her çifti için prob ekleyin. Gerçek deneme preformed önce optimal konsantrasyonunu bulmak için farklı prob konsantrasyonları (örneğin 0.5, 2 ve 4 ul) test etmek için çok önemlidir.

Hibridizasyon çözüm	5 slayt çifti	10 slayt çifti	15 slayt çifti	20 slayt çiftleri
10x in situ tuzları	100 ul	200 ul	300 ul	400 ul
deiyonize formamid	400 ul	800 ul	1200 ul	1600 ul
% 50 Dekstran sülfat (+60 ° C)	200 ul	400 ul	600 ul	800 ul
50x Denhardt çözümü	20 ul	40 ul	60 ul	80 ul
tRNA (100mg/ml)	10 ul	20 ul	30 ul	40 ul
H 2 O (DEPC tedavi)	70 ul	140 ul	210 ul	280 ul
Toplam hacim	800 ul	1600 ul	2400 ul	3200 ul

49. 20 ul nihai hacmi RNaz ücretsiz MilliQ su prob sulandırınız. Toplam hacmi 40 ul veren prob formamid bir hacmi (yani 20 ul) ekleyin. Sıcaklık ° C 2 dakika 80 prob. 2 dakika süreyle buz koyun. Aşağı spin. Prob buz üzerinde tutun. Bu prob-karışımı bir çift slayt yeterlidir. Göre belirli bir prob için slayt çifti toplam sayısı çarpın.
50. Her slayt çifti için 200 ul son bir hacmi (yani 160 ul hibridizasyon çözümü + 40 ul prob) veren slaytlar her çifti için 160 ul hibridizasyon çözüm ekleyin. Kabarcıkları üreten olmadan karıştırın.
51. Prob bir slayt uygulayın ve yavaş yavaş birlikte iki slayt sigorta. (NB! sandviç sadece buzlanma olmadan slaytlar kullanılır Probe-Plus slaytlar, ya da eşdeğer slaytları sandviç yerine kapak fişleri ile yapılabilir.)
52. Plastik pipetler kullanarak bir plastik kap (contalar sıkıca), ıslak kağıt havlu üzerinde slaytlar yükseltin. Melezleşme 50-55 ° C gece (12-16 saat).

4.3, in situ yazılan hibridizasyon (Film! Teknik detaylar film gösterilmiştir )

53. In situ hibridizasyon sonrası ısınma hazırlayın ~ 2 L 0.2x SSC (+55 ° C) ve yaklaşık 2 L 1x NTE (+37 ° C) bir gecede. RNaz tedavi (aşağıdaki adımları 57-59) ise daha SSC ve NTE ihtiyaç vardır.
54. Onları ayrı ve durulama için her slayt çifti sıcak 0.2x SSC (bkz. yukarıda) içine batırın. Sonra bir kapta bir rafa koyunsıcak 0.2x SSC.
55. +55 Yavaşça sallanarak 0.2x SSC 60 dakika slaytlar yıkayın ° C (NB! inkübasyon süresi boyunca 63 adım kullanılan Boehringer blok çözüm hazırlayın.)
56. 60 dakika 0.2x SSC yıkama tekrarlayın. (RNaz adım 60 adım devam değilse, bu kuluçka sırasında RNaz çözülme izin yapılmazsa NB!.)
57. İsteğe Bağlı: 37 az 5 dakika ılık 1x NTE (bkz. yukarıda) slayt yıkayın ° C yavaşça sallanarak.
58. İsteğe Bağlı: 37 az 5 dakika boyunca ılık 1x NTE yıkama tekrarlayın ° C nazik agtation.
59. İsteğe Bağlı: +37 30 dakika RNaz (20 mg / ml 1x NTE RNaz A) ° C yavaşça sallanarak slaytları davranın. Sonra 37 1x NTE 5 dakika yıkayın ° C yavaşça sallanarak. 1x NTE yıkama tekrarlayın.
60. Slaytlar yavaşça sallanarak ile +55 ° C 0.2x SSC 60 dakika yıkayın. (NB! inkübasyon süresi boyunca, 64-65 ve 67 adımları kullanılan blok çözüm hazırlayın. )
61. 1x PBS içinde oda sıcaklığında 5 dakika (Pause! +4 1XPBS slaytlar depolamak ° C gecede ertesi gün devam etmek istiyorsanız.) Slayt yıkayın
62. Örnek tarafı yukarı olan büyük bir plastik kap alt slaytlar yerleştirin.
63. Slaytlar yavaşça sallanarak oda sıcaklığında 45 dakika süreyle 100 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl% 1 Boehringer bloğu ile inkübe edin. Sadece engelleme çözümü ile slaytları kapsar. Slaytları yine plastik bir kap içinde veya yeni bir konteyner slaytlar engelleme çözüm dökün. Çözüm dökme işlemi sırasında genellikle plastik konteyner için uygun, ama emin olun onlar konteyner kapalı uymadıklarına dair slaytlar.
64. 100 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.3 Triton X-100,% 1,0 BSA ile Boehringer blok çözüm değiştirin. Inkübasyon adım 63 olarak gerçekleştirin.
65. Adım 64 BSA / Tris / NaCl / Triton çözüm anti-kazmak antikorlar (10 ml BSA 1:1250, yani 8 ul antikorlar) sulandırınız. Antikor çözüm plastik bir su birikintisi olun çanak tartın. Sandviç kapiller kuvvetleri çözüm çekmek için izin için birlikte slaytlar. Kimwipe / kağıt mendil üzerine boşaltın ve tekrar deneyin kabarcıkları önlemek için,.
66. Plastik kap içinde ıslak kağıt havlu üzerinde slaytlar Elevate ve slaytlar, 2 saat boyunca oda sıcaklığında oturmak için izin verir.
67. Kimwipe / kağıt mendil ve ayrı slaytlar boşaltın. Adım 63 olarak, plastik kabın alt üzerine yerleştirin. BSA / Tris / NaCl / Triton çözüm 4x yıkayın. 15 dakika her zaman, oda sıcaklığında yavaşça sallanarak.
68. 10 dakika 100 mM Tris, pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl _2. Adım 63 olarak, plastik kabın alt üzerine yerleştirin.
69. Tüm deterjan sağlamak için Tris pH 9.5/NaCl/MgCl ₂ çözüm Lamı yıkanır.
70. Sandviç olun ve 65 olarak Batı mavi bir çözelti hazırlamak. Bir kez tekrarlayın.
71. Oda sıcaklığında 1-5 gün boyunca, zifiri karanlıkta (kalay folyo ile sarın) ıslak kağıt havlu üzerinde plastik kap slaytlar. Kez, daha sonra her gün 6, 12 ve 24 saat sonra kontrol edin.
72. Tahliye slaytlar, reaksiyonu durdurmak için 1xTE durulayın. Slaytlar mikroskopta incelenir önce kapak bordroları koyun. Slaytlar 1x TE birkaç ay için kaydedilmiş, ancak kısa sürede fotoğraf çekmek olabilir.

TARİFLER / STOK ÇÖZÜMLER

Dikkat! RNaz-free MilliQ suyu mümkün olduğu kadar, örneğin DEPC tedavi MilliQ-su (% 0.1 DEPC geceleme. Otoklav (15 psi az 20 dakika bırakın, yani sıvı döngüsü 1.05 kg / cm ²⁾ veya kullanmak kullanın . tamponlar ve stok çözeltileri hazırlarken en otoklavlanmış MilliQ-su. tamponlar ve stok çözümler kendilerini DEPC tedavi yerine DEPC arıtılmış su RNaz ücretsiz tuzları vb çözmek için de mümkündür. DEPC tedavisi su yoksa , tamponlar ve stok çözümleri, en azından onları sterilize otoklav veya filtre.
Pause! Oda sıcaklığında saklayın tamponlar ve stok çözümler, başka bir ifade ise değil.
Dikkat! Tamponlar (Sambrook, J. ve DW Russell 2001 Moleküler Klonlama nasıl ipuçları yanı sıra birçok bulabilirsiniz. Moleküler klonlama Laboratuvar Kılavuzu 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratuvarı'nda basın, Cold Spring Harbor New York, ABD).

0.1M trietanolamin asetik anhidrit (pH 8, hacmi: 800 ml).

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
Trietanolamin	10.4 ml	0.1 M trietanolamin
MilliQ-Su	786,4 ml	son hacim 800 ml
HCl	3.2 ml	pH veren8
Asetik anhidrit	4.8 ml	% 0.6

• , 0.1 M trietanolamin tampon, pH 8.0, seyreltik 10.4 ml _H 2 O 786,4 ml trietanolamin pH 8.0 (pH indikatörü ile kontrol) getirmek için 3.2 ml HCl eklemek için .
• 10 ml plastik pipetler kırık veya benzer trietanolamin, alt kısmında bir heyecan bar ile bir konteyner ile slayt raf yükseltin.
• 4.8 ml asetik anhidrit, birkaç dakika kadar iyice karıştırılır slaytlar koymadan önce trietanolamin içine koyun.

Dikkat! 0.1M trietanolamin taze ve sadece inkübasyon eklemeden önce, asetik anhidrit olun.
Dikkat! Cam kap kullanın. Asetik anhidrit su kararsız olduğu için Trietanolamin tampon kullanılmalıdır.

1 x TBE agaroz jel (% 1) (hacmi: 100 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
Agaroz	1 g	% 1
1 x TBE	100 ml kadar

1 x TBE ile karıştırın agaroz. Isı / kaynatın agaroz eriyene kadar. Oyuncular bir jel. 1 x TBE tampon jel çalıştırın.

Dekstran sülfat

DEPC ile tedavi edilen MilliQ-su (yani% 50 (w / v)) 5 g Dekstran sülfat 10 ml seyreltilir ve 60 ° C içinde çözülür
Pause! -20 ° C'de muhafaza

0.5 M EDTA pH8.0 (Titriplex III, hacim 500 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
EDTA (372,24 g / mol)	93,06 g	0.5 M EDTA
MilliQ-Su	500 ml kadar
NaOH	~ 10 g pelet	pH 8.0 vererek
DEPC	0.5 ml	% 0.1 DEPC

EDTA su (pH 8.0 olur) içinde çözülür, son hacim 500 ml ayarlayın. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.

Fix% 4 (w / v) 1x PBS, pH 7.0 (650 ml) paraformaldehid çözüm / fiksatif (adım 1-3, 42)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
MilliQ-Su	585 ml
10x PBS	65 ml	1x PBS
10M NaOH	520 ul	vererek pH ~ 11
Paraformaldehit	26 g	% 4
Konsantre HCl	449 ul	vererek pH ~ 7

• 60-70 Mix su, PBS ve NaOH ve ısı ° C (sıcaklık ve yüksek pH paraformaldehid daha kolay çözülür hale getirecektir.
• (Davlumbaz) paraformaldehid ekleyin.
• Çözüm temizlenir buz koyun ve 449 ul konsantre HCl ekleyerek pH 7.0 'ye ayarlamak.

Dikkat! Taze olun.
Dikkat! Ladin protokol glutaraldehid,% 0.25, yani 650 ml veya 1000 ml toplam hacmi 10 ml% 25 glutaraldehid toplam hacmi 6.5 ml% 25 glutaraldehid son bir konsantrasyon eklendi (eşit su azaltmak için hatırlamak hacmi).
Dikkat! PH ayarlandıktan sonra fiksasyon 1-3 adımları kolaylaştırmak için yüzey gerilimi azaltmak için, Tween 20 ve / veya Triton X-100, bir kaç damla ekleyin. ADIM 42 OLARAK KULLANMAYIN!
Dikkat! Bitki dokularında daha küçük bir hacim (örneğin 100 - 200 ml) tespit fiksatif, genellikle ihtiyaç vardır.

10x in situ tuzları (hacmi 100 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
5 M NaCl	60 ml	3M NaCl
1 M Tris-Cl, pH 8.0	10 ml	0.100 M Tris
1 M Na Fosfat pH 6,8	10 ml	0.100 M Na Fosfat
0.5 M EDTA	10 ml	0,050 M EDTA
MilliQ-Su	100 ml kadar

Na fosfat tampon pH 6,8 (46,3 ml 1 M Na ₂ HPO ₄ + 53.7 ml 1 M NaH ₂ PO ₄₎ ile karıştırın. Mix NaCl, Tris, Na fosfat tamponu, EDTA ve su. Otoklav Duraklama! -20 ° C'de muhafaza

4 M LiCl ₂ (lityum klorür, hacmi: 100 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
LiCl 2 (42.39 g / mol)	16,956 g	4M LiCl 2
MilliQ-Su	100 ml kadar
DEPC	0.1 ml	% 0.1 DEPC

Su LiCl ₂ çözülür, son hacim 100 ml ayarlayın. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.
Pause! Mağaza +4 ° C

1 M MgCl ₂ · H ₂ O (magnezyum klorür, hacmi: 100 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol)	20,33 g	1 M MgCl 2 · H 2 O
MilliQ-Su	100 ml kadar
DEPC	0.1 ml	% 0.1 DEPC

Suda çözülür MgCl _2, 100 ml nihai hacmi ayarlayın. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.
Dikkat! MgCl ₂ çok higroskopik. Uzun bir süre için açıldı şişe saklamayın.

5 M NaCl (sodyum klorür, Cilt: 1 lt)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
NaCl (58,44 g / mol)	292,2 g	5 M NaCl
MilliQ-Su	kadar 1l
DEPC	1 ml	% 0.1 DEPC

NaCl su içinde çözülür, 1 lt nihai hacimli uyum. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.

1 M NaOAc pH 4.7 (sodyum asetat, hacim: 100 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
NaOAc (82,03 g / mol)	0,8203 g	1 M NaOAc
MilliQ-Su	100 ml kadar
Asetik asit		pH değeri 4,7 vererek
DEPC	0.1 ml	% 0.1 DEPC

NaOAc suda eritin. PH 4.7 'ye ayarlayın. Son bir hacim 100 ml ayarlayın. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.

0.2 M Na ₂ CO ₃ pH11.4 (sodyum karbonat, hacim: 10 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
Na 2 CO 3	0,21198 g	0.2 M Na 2 CO 3 pH = 11.4
MilliQ-Su	10 ml kadar

₂ CO ₃ su Na çözülür; son bir 10 ml hacmi ayarlayabilirsiniz. PH 11.4 olmalıdır.
Dikkat! Taze olun.

0.2 M NaHCO ₃ pH8.2 (sodyum bikarbonat, hacmi: 10 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
NaHCO 3	0,16802 g	0.2 M NaHCO 3: pH = 8.2
MilliQ-Su	10 ml kadar

Su NaHCO ₃ çözülür; son bir 10 ml hacmi ayarlayabilirsiniz. PH değeri 8.2 olmalıdır.
Dikkat! Taze olun.

1 M Na ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O (hacmi 500 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol)	88,995 g	1 M Na 2 HPO 4
MilliQ-Su	500 ml kadar
DEPC	0.5 ml	% 0.1 DEPC

Suda çözülür Na ₂ HPO _4, son hacim 500 ml ayarlayın. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.

1 M NaH ₂ PO ₄ · H ₂ O (hacmi 500 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol)	68,995 g	1 M NaH 2 PO 4
MilliQ-Su	500 ml kadar
DEPC	0.5 ml	% 0.1 DEPC

₂ NaH PO ₄ su içinde çözülür, son hacim 500 ml ayarlayın. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.

5x NTE (toplam hacmi: 1l)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
5 M NaCl	500 ml	2.5 M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8	25 ml	50 mM Tris-Cl pH 8
0.5 M EDTA	5 ml	5 mM EDTA
MilliQ-Su	470 ml	son hacmi 1l

Mix NaCl, Tris, EDTA ve su. DEPC tedavisi etmeyin. Otoklav.

10 x PBS (fosfat tamponlu salin) pH 7,0 (toplam hacmi: 1l)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
5 M NaCl	260 ml	1.3 M NaCl
1 M Na 2 HPO 4	70 ml	70 mM Na 2 HPO 4
1 M NaH 2 PO 4	30 ml	30 mm NaH 2 PO 4
MilliQ-Su	640 ml	son hacmi 1l
DEPC	1 ml	% 0.1 DEPC

Mix NaCl, Na ₂ HPO _4, NaH ₂ PO ₄ ve su. HCl ile pH 7.0 pH ayarlayın. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.

20x SSC pH 7,0 (toplam hacmi: 1l)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
NaCl (58,44 g / mol)	175,32 g	3 M NaCl
Na Sitrat (294,1 g / mol)	88,23 g	0.300 M Na Sitrat
MilliQ-Su	1 litre kadar
HCl		pH 7.5 vererek
DEPC	1 ml	% 0.1 DEPC

NaCl ve Na Sitrat ~ 800 ml su içinde çözülür. HCl ile pH 7.0 pH ayarlayın. 1 litre su ile ses seviyesini ayarlayın. % 0.1 DEPC ekle. Gece boyunca bekletin. Otoklav.

5 x TBE (hacmi: 1l)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
Tris (121,14 g / mol)	54 g	~ 0.45 M Tris
Borik asit (61,83 gr / mol)	27.5 g	~ 0.45 M borik asit
EDTA (372,24 g / mol)	3.7 g	~ 0.01 M EDTA
MilliQ-Su	kadar 1l

Mix Tris, borik asit, EDTA ve su. PH ~ 8.3 olmalıdır. Kullanmadan önce 1 x TBE sulandırınız.

10 x TE pH 8.0 (Tris EDTA, hacmi: 1l)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
1 M Tris-Cl, pH 8.0	100 ml.	0.100 M Tris-Cl
0.5 M EDTA pH8.0	100 ml.	0,050 M EDTA
MilliQ-Su	kadar 1l

Mix Tris, EDTA ve su. DEPC tedavisi etmeyin. Otoklav.
Dikkat! Tris DEPC ile tedavi edilmemelidir! RNaz-ücretsiz tozu kullanın ve DEPC-treated/RNase-free MilliQ su ile seyreltilir.

1 M Tris-HCl pH 7,5 - 9.5 (hacmi 500 ml)

Bileşen	birim / miktar	nihai konsantrasyonu
Tris (121,14 g / mol)	60,57 g	1 M Tris
MilliQ-Su	500 ml kadar
HCl		pH 7.5 vererek
HCl		pH 8.0 vererek
NaOH		pH 9.5 vererek

DEPC arıtılmış su Tris çözülür. İstenen pH ayarlayın. Son bir hacim 500 ml ayarlayın. Otoklav.
Dikkat! Tris DEPC ile tedavi edilmemelidir! RNaz-ücretsiz tozu kullanın ve DEPC-treated/RNase-free MilliQ su ile seyreltilir.
Dikkat! Moleküler Klonlama (bkz. yukarıda) HCl doğru pH elde etmek için gerekli ne kadar konsantre açıklayan bir tablo var.

GEREÇ VE YÖNTEM

In situ protokolde, filmin üstünde ve içinde sunulmaktadır. İşte bu özel örnekte kullanılan bitki materyali ve problar ek bilgi açıklanmıştır.

Bitki materyali ve deneysel tasarım

Picea abies Erkek koniler [L.] Karst. (Norveç ladin), Uppsala, İsveç, 2007 sonbaharında toplanmıştır. Sekiz kozalakları kesitli ve bölümleriher tedavi her koni kullanılır. Üç proteinaz K konsantrasyonunu test edildi, 1, 3 ve 5 mg / ml ve her konsantrasyon RNaz ile veya olmadan tedavi edildi. RNaz ile tedavi değil Slaytlar RNaz tedavisi sırasında PBS içinde kaldı. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. Brassica napus L., 22 ile bir kültür odasında kontrollü şartlar altında yetiştirilen ° C/18 ° C / gece gündüz sıcaklıkları ve 16 saat fotoperiyodun Çiçek tomurcukları, aşamaları 0-10 (aşamaları ⁵ Smyth göre) içeren Genç çiçek salkımına incelendi.

Crna probları

Toplam P. RNA izole edildi abies erkek koniler olarak daha önce 6 açıklanan ve A. thaliana ve B. üreticilerin tavsiyelerine uygun olarak, sırasıyla, TRIzol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, ABD) ve Qiagen RNeasy Bitki Mini Kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak napus. Üreticinin talimatları izleyerek Üstsimge III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, California, ABD) kullanılarak türüne göre 0.5-1 mg total RNA, cDNA sentezlendi. AtAP3 ve BnAP3 duygusu ve antisens parçaları ve P. abies anlamda parçaları izole ve DAL13 antisens parçaları izole ve 7 gibi primerler kullanılarak amplifiye edildi gen spesifik primerler (Tablo 1) kullanılarak amplifiye edildi. T7 çıkıntı A. parçaları eklendi. thaliana ve P. T7-dizisi (Tablo 1) taşıyan modifiye ters primerler kullanarak abies. A 500 ​​bp parçası BnAP3 spesifik primerler (Tablo 1) kullanılarak izole edilmiş ve bir T7 promotor ile pGEM-T vektör içine klonlandı. P. abies parçalarının her biri 20 ul 0.2 U Phusion içeren DNA Polimeraz (Finnzymes, Espoo, Finlandiya), 1x Phusion HF tampon, her dNTP, 200 mcM, Yüksek Fidility 0.3 mcM nihai hacmi tüm PCR reaksiyonları yapıldı astar ve 25-50 ng cDNA ve standart bir PCR programı tavlama sıcaklığı 60-55 ° C (touch-down -1 ° C / çevrim) 55 takip ° C Üreticinin önerilerini ve uzun problar göre yaklaşık 100-150 bp sindirilir; her üç tür için Sense and antisens Crna probları DIG RNA Etiketleme Kiti (Roche Uygulamalı Bilimler, Mannheim, Almanya SP6/T7) kullanılarak in vitro transkripsiyon ile sentezlenmiş ^3'e göre, _Na 2 _CO 3 tampon kullanarak parçaları .

Bulgular

İşte sonuç bölümünde yerinde deneylerde üç farklı örnekler tipik sonuçlar açıklanmaktadır.

285 milyon yıl önce ¹⁰ ayrı iki tohum bitki soyları rağmen, erkek ve dişi organ kimlik belirterek açıktohumluların ve Angiospermlerde üreme gelişimini düzenleyen genetik mekanizmanın evrimsel ^korunmuş 7-9 görünür . A. thaliana çiçek homeotik genler APETALA3 (AP3 ¹¹⁾ ve PISTILLATA (PI ¹²⁾ gerekli ve bir çiçek kapsamında erkek üreme gelişme belirtmek için yeterli ve bu fonksiyon ¹³ soyundan Angiosperm içinde korunacak. Çiçek eksikliği ve üreme organları ayrı ayrı erkek ve dişi kozalakları (Şekil 1A-C), genler düzenlenen açıktohumluların, homolog AP3 ve PI erkek koni, ^{microsporophylls} 7,14 polen taşıyan organlarda özellikle ifade edilmektedir . Bu nedenle, hem de Angiospermlerde ve açıktohumluların homolog genler benzer bir set polen taşıyan organlar tanımlar.

Sırasıyla AtAP3 ve BnAP3 yöneltilen Gen spesifik problar, parmak izindeki kabarıklık iki karşılık gelen bir bölgede genç çiçek tomurcukları evre 3 ve A. üç sinyalleri verdi thaliana ve B. napus. Daha sonra gelişmekte olan yaprakları ve organlarındaki (Şekil 2A ve B) sinyalleri ile sınırlı tomurcukları düzenledi. Bu sonuçlar önceki çalışmalarda ^11,15,16 anlaşma. P. AP3 homologu doğru yönlendirilmiş Probları abies, DAL13, P. microsporophylls sinyaller abies erkek konileri apikal meristem bitirilmesinden önce ve sonra (Şekil 2C ve D), önceki çalışmalarda ^7,14 bekleniyor. Sense probları arka plan (Şekil 3A-B ve veri gösterilmemiştir) üzerinde bir sinyal verdi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar göstermektedir A. ifade thaliana AP3 ve B. orthologs napus ve P. erkek üreme organları gelişmekte olan abies.

Şekil 1 A.thaliana ve B. kozalaklı P. erkek konileri üreten napus çiçek ve polen abies Resimleri, çiçek tomurcukları ve A.thaliana ve B.napu açık çiçek çiçek salkımına göstermektedir.sırasıyla A ve B. Not steril çiçek örtüsü Angiosperm çiçek dışında hem kadın hem erkek üreme organları barındırdığı organlarındaki ve carpels. C gösterildiği gibi bir gymnosperm P. dal yeşil vejetatif iğneler ve kırmızı erkek üreme konileri abies.

Şekil 2, A. İfade thaliana AP3 ve B. homolog genler napus ve P. abies. Mikroskobu A. boykesit göster thaliana ve B. A ve B, sırasıyla ve P. napus çiçek salkımına C ve D abies erkek konileri. Bölüm antisens problar ile ikinci ve üçüncü parmak izindeki kabarıklık çiçek organlarında A ve B BnAP3 göstermek sinyal AtAP3 yöneltilen melezleşmiştir. Sayılar Smyth ⁵ göre çiçek aşamaları gösterir. DAL13 gen yönelik Antisens prob P. polen taşıyan microsporophylls sinyal verdi abies erkek konileri, CD gösterildiği gibi. Microsporophylls, örnekler oklarla gösterilir. Hibridizasyon sinyali AD noktaya ok uçları, mor olarak görünür. C ve D fenolik bileşikler merkezi ilik bireysel hücrelere kahverengimsi belirsiz bir renk verir. s sepal; p, Petal; st, stamen; c, karpal; ms microsporophyll; pi, ilik; pp, ön polen hücreleri. Bar: 100 mikron.

Şekil 3. P. erkek konileri DAL13 ifade abies. Tüm mikrograflar (AH), apikal meristem sona ermesinden sonra erkek kozalaklar boykesit gösteriyor. Arrowheads DAL13 ifade edildiği hücre tipleri işaret. A ve B bölümleri arka plan boyama belirlemek için bir anlamda kontrol probu ile melezleşmiştir. H mikrograflar C DAL13 antisens probu ile melezleşmiştir. RNaz tedavi olan ve olmayan deneyler Bölüm D, F, H ve sırasıyla C, E, G gösterilmiştir. 100 mikron: 1 mg / ml proteinaz K ile deneyler mikroskobu, C ve D, 3 mg / ml E ve F, G ve H. Bar 5 mg / ml gösterilmiştir.

Tartışmalar

P. iki yönü abies protokolü A. göre optimize edilmiştir thaliana / B. napus protokolü, RNaz tedavi ve proteinaz K konsantrasyonu. RNaz arka plan sinyalleri ortadan kaldırır ve böylece sinyal ^{özgüllüğü} 17 artırır . Proteinaz K, tedavi prob girin ve ilgi RNA havuzu melezler böylece dokular permeabilize için gerekli. DAL13 antisens prob RNaz 30 dakika (Şekil 2B, F ve H) ile tedavi bölümlerine göre RNaz-tedavi (Şekil 3C, E, G) olmadan daha yüksek bir sinyal verdi. RNaz tedavi sinyali artırmak etmediğimizden protokolden çıkarıldı. 1, 3 ve 5 mikrogram / ml proteinaz K tedavisinde üç farklı konsantrasyonlarda test edildi. P. durumda 1 mg / ml proteinaz K (Şekil 3C-D) kullanarak düşük ya da hiç bir sinyal abies gözlendi . 5 mg / ml proteinaz K ile 3 mg / ml (Şekil 3E-F) ve 5 mg / ml, hem de güçlü bir sinyal elde edilmiştir (Şekil 3G-H) proteinaz K. sinyal gücü arasında fark bu yana bulundu 3 mg / ml ile karşılaştırıldığında, biz protokolde 3 mikrogram / ml kullanmayı seçti. Bu olasılığı olduğunu P. bir proteinaz K konsantrasyonu yüksek olan ihtiyacı A. kıyasla abies erkek konileri thaliana ve B. napus çiçek tomurcukları fenolik ve polisakkaritler yüksek seviyeleri ile daha kompakt bir doku nedeniyle.

Fiksasyonu sırasında ve A. arasında bazı farklılıklar gömme thaliana / B. napus protokolü ve P. abies protokolü açıktır. Ilgi doku RNA kalmalarını sağlamak için sabit ve kötü sabit malzeme mRNA oldukça bol olsa da düşük veya belirlenemeyen bir sinyal verebilir yılından bu yana önemli bir adım. Doku temizlenir ve doku hasarı önlemek için yavaş yavaş değişiklikler balmumu gömülü, kurutulmuş, ve bazı protokollerde% 0.85 NaCl içinde hücreleri ³ büzülmesi ve şişmeyi önlemek için daha fazla dehidrasyon etanol eklenir. Gömme sırasında dehidrasyon adım en az RNaz aktivite tutmak için buz üzerinde yapılabilir. P. abies protokolü% 4 paraformaldehid düzeltme çözüm, bazı muhtemelen hiçbir ^fark 3 iddia bile daha iyi bir RNA ^tutma 17 vermek gerekiyordu% 0.25 glutaraldehid içerir . (Non-spesifik prob bağlayıcı ve sonunda susuz azaltmak için tedavi permeabilize rehidrate yani mumu alınmış,,) malzemenin kesit sonra hibridizasyon önce Slaytlarınıza sabit ve önceden tedavi edilir.

Burada sunulan protokol tüm saptama prosedürü sıradan laboratuvarlarda yapılabilir, sinyal genellikle 1-3 gün içinde gelişir ve arka plan üzerinde sinyal arasındaki oran, sürekli olarak izlenebilmektedir. DIG-etiketli probları genellikle radyoaktif etiketli probları kıyasla daha belirgin bir sinyal vermek, daha istikrarlı ve ardışık deneylerde tekrar edilebilir. Öte yandan, radyoaktif probları ¹⁷ ile karşılaştırıldığında duyarlılığı azalır. Situ hibridizasyon, belirli bir mRNA'nın için özel etiketli prob kullanarak ifade algılar . Radyo-etiketleme, sağlam ve hassas bir etiketleme yöntemi ama radyoaktivite işlenmesini gerektirir ve sonuçları tespit edilebilir önce birkaç hafta sürer. Öte yandan Antijen-etiketli probları, daha az tehlikeli, daha kararlı ve sadece ¹⁷ bir kaç gün için algılama orta tartışma gerektirecek. Bu nedenle, antijen-etiketleme yöntemleri şu anda hakim. Protokol ne olursa olsun en kritik adım prob tasarımı. Bakım prob yüksek bir özgüllük ve yüksek kalite UTPs ile etiketlenmiş emin olmak için alınmalıdır. Bazen hibridizasyon sıcaklık ve / veya spesifik problar için tepki süresini ayarlanması gerekir.

DIG etiketli probları göre modifiye protokol A. değişen türlerin aynı anda mRNA lokalizasyonu kolaylaştırmak P. için thaliana abies ve küçük ayarlamalar ile diğer bitki türlerinin de kullanılabilir olmalıdır. Protokol erkek konileri yanında, vejetatif sürgünler farklı aşamalarında ve P. Zigotik ve somatik embriyolar hem de test edilmiştir iyi sonuçlar (. Karlgren ark yayınlanmamış) abies.

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride		Sigma-Aldrich	A6404-200ml	minimum 98%
Acrylamide, linear		Ambion	9520
Anti-DIG-antibodies		Roche Applied Science
Blocking reagent		Roche Applied Science	11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A7030-50g	minimum 98%
Deionized formamide		Sigma-Aldrich
Denhardts solution		Sigma-Aldrich	D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate		Sigma-Aldrich
Dextran sulfate		Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)		Roche Applied Science	11175025910
Glutaraldehyde (25%)		Histolab products AB
Glycogen		Ambion	9510G
Histoclear II		Histolab products AB		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax		Histolab products AB		Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde		Sigma-Aldrich	P6148-500g
Paraplast plus		Sigma-Aldrich	P3683-1kg	Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase		Finnzymes
Probe-on Plus slides		Fischer Scientific	22-230-900
Proteinase K		Sigma-Aldrich	P2308-5mg
RNase A		Sigma-Aldrich	R5503-100mg
Tissue-clear		Sakura Finetek Europé BV		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine		Sigma-Aldrich	T1377-100ml	minimum 98%
Triton X-100		use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA		Sigma-Aldrich	83853-100mg
Tween-20		use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue		Promega Corp.