Nicht radioaktiv In situ Hybridisierung Protocol Einsetzbar für Fichte und einer Reihe von Pflanzenarten

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein modifiziertes DIG In situ Hybridisierung Protokoll, das eine schnelle und anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter Fichte ist. Mit nur wenigen Anpassungen, einschließlich verändertem RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration kann das Protokoll in Studien von verschiedenen Geweben und Spezies verwendet werden.

Zusammenfassung

Die High-Throughput-Expressions-Analyse heute verfügbaren Technologien können Wissenschaftler einen Überlauf des Ausdrucks-Profilen, sondern ihre Auflösung in Bezug auf die gewebespezifische Expression ist aufgrund von Problemen in seziert einzelne Gewebe beschränkt. Expression Daten müssen bestätigt und ergänzt mit Expressionsmuster zB mit in-situ-Hybridisierung, eine Technik zur Lokalisierung zellspezifische mRNA-Expression. Die in-situ-Hybridisierung Methode ist mühsam, zeitaufwendig und erfordert oft umfangreiche Optimierung je nach Art und Gewebe. In situ Experimente sind relativ schwer zu holzigen Arten wie der Nadelbaum Fichte (Picea abies) durchzuführen. Hier präsentieren wir eine modifizierte DIG in-situ-Hybridisierung-Protokoll, das eine schnelle und anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter P. ist abies. Mit nur wenigen Anpassungen, einschließlich verändertem RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration, könnten wir das Protokoll gewebespezifische Expression von homologen Gene in männlichen Geschlechtsorgane eines Gymnospermen und zwei Angiospermen Arten zu studieren; P. abies, Arabidopsis thaliana und Brassica napus. Das Protokoll arbeitet gleichermaßen gut für die Arten und Gene untersucht. AtAP3 und BnAP3 wurden in der zweiten und dritten Wirtel Blütenorgane in A. beobachtet thaliana und B. napus und DAL13 in microsporophylls der männlichen Zapfen von P. abies. Für P. abies die Proteinase K-Konzentration verwendet, um das Gewebe permeablize, musste auf 3 erhöht werden g / ml statt 1 g / ml, möglicherweise aufgrund einer kompakteren Gewebe und höhere Phenole und Polysaccharide. Für alle Arten der RNase-Behandlung wurde aufgrund der reduzierten Signalstärke ohne eine entsprechende Erhöhung der Spezifität entfernt. Durch den Vergleich gewebespezifische Expressionsmuster von homologen Gene von beiden Blütenpflanzen und ein Nadelbaum wir zeigen, dass die DIG in situ-Protokoll hier vorgestellt, mit nur minimale Anpassungen, kann auf ein breites Spektrum von Pflanzenarten angewendet werden. Daher vermeidet das Protokoll sowohl umfassende artspezifischen Optimierung und die mühsame Verwendung von radioaktiv markierten Sonden zu Gunsten der DIG-markierten Sonden. Wir haben uns entschieden, die technisch anspruchsvolle Schritte des Protokolls in unserem Film zu veranschaulichen.

Anna Karlgren und Jenny Carlsson trugen gleichermaßen zu dieser Studie.

Entsprechende Autoren: Anna Karlgren bei Anna.Karlgren @ ebc.uu.se und Jens F. Sundström bei Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Protokoll

Dieses nicht-radioaktive mRNA in situ Hybridisierung Protokoll ist für Fichte Gewebe optimiert und im Detail beschrieben. Es basiert auf einer Arabidopsis / Raps in-situ-Hybridisierung Protokoll in unseren Gruppen, die sich wiederum auf Protokolle aus der Meyerowitz und Irish Labors basiert und optimiert durch Vivian Irish, Cindy Lincoln und Jeff Long ua ^1-4 optimierte Basis.

VERFAHREN

1. Fixierung und Einbettung

Um RNA Beibehaltung Gewebe müssen fixiert und eingebettet in Wachs vor einem in-situ-Experiment durchgeführt wird. Die Fixierung und Einbettung ist ein kritischer Schritt, da schlecht festen Materialien eine geringe oder nicht nachweisbare Signal, obwohl die mRNA sehr reichlich vorhanden ist geben könnte. Die Gewebe werden entwässert, gelöscht und eingebettet in Wachs in allmählichen Veränderungen des Gewebes zu vermeiden. Zur weiteren Vermeidung von Schrumpfung und Schwellung der Zellen 0,85% NaCl auf die erste Ethanol-Schritte bei der Dehydratisierung von Fichten Gewebe aufgenommen wird. Es ist möglich, lassen Sie das NaCl in dem Ethanol (z. B. ist es in der Arabidopsis / Raps-Protokoll links). Die Dehydratisierung Schritt beim Einbetten kann auf Eis durchgeführt werden, um RNase-Aktivität bei minimalen oder bei +4 ° C zu halten In diesem Protokoll werden die 4% Paraformaldehyd fix Lösung enthält 0,25% Glutaraldehyd, die angeblich eine bessere RNA Zurückbehaltungsrecht obwohl einige argumentieren, dass es wahrscheinlich keinen Unterschied macht (z. B. ist es in der Arabidopsis / Raps-Protokoll links) geben wird. Höchstwahrscheinlich jedem Standard-Fixierung und Einbettung Protokoll verwendet werden kann. Wie unter den Fichten Einbettung gesehen unterscheidet sich geringfügig von der Arabidopsis / Raps-Protokoll.

1,1 Tag 1 Collecting Pflanzenmaterial und Paraformaldehyd Fixierung

1. Sammeln Sie die Anlage Material von Interesse und sezieren sie, wenn nötig. Halten Sie das Gewebe auf Eis und legen Sie sie in eiskaltem fix Lösung (siehe Rezepte unten) direkt oder so bald wie möglich. NB! Keep on ice die ganze Zeit!
2. Bewerben Vakuum, um die Proben, bis der Paraformaldehyd beginnt zu brodeln. Halten Sie das Vakuum bis zu drei Stunden (zB 2 x 15 min für Arabidopsis und Raps Blütengeweben oder 1 Stunde für Fichte männlichen Zapfen) und das Vakuum langsam. Die Gewebe sollen nach dem Vakuum-Infiltration der Fixateur sinken, aber für bestimmte Gewebe enthält viel Luft ist es nicht möglich (z. B. Arabidopsis Blüten). Ein Stück Gaze kann verwendet werden, um das Gewebe Aufenthalt in der Fixierlösung werden.
3. Ersetzen Sie das Fixativ und Inkubieren bei +4 ° C über Nacht (~ 12-16 Stunden) leichtes Schütteln.

Option 1

NB! Fichte Einbettung Version unten (Schritte 4-8). Stellen Sie sicher, Szintillationsröhrchen oder Glasflaschen verwendet werden, zumindest in Schritt 5.

1,2 Tag 2 Dehydration NB! Fichte Einbettung Version.

4. 0,85% NaCl	30 min	auf Eis
   50% EtOH + 0,85% NaCl	90 min	auf Eis
   70% EtOH + 0,85% NaCl	90 min	auf Eis

   Pause! Es ist möglich, hier zu stoppen und zu speichern das Gewebe in 70% EtOH + 0,85% NaCl bei +4 ° C für mehrere Monate.

   85% EtOH + 0,85% NaCl	90 min	+4 ° C
   95% EtOH (+ Eosin)	90 min	+4 ° C

   NB! Eosin zugesetzt wird, um das Gewebe rosa wodurch sie leichter zu beim Einbetten und Schneiden erkennen Fleck, aber es kann ausgeschlossen werden.

   100% EtOH (+ Eosin)	90 min	+4 ° C
   100% EtOH (+ Eosin)	über Nacht	+4 ° C

1,3 Tag 3 Dehydration und Einbettung NB! Fichte Einbettung Version.

5. 100% EtOH (+ Eosin)	2 h	Raumtemperatur
   50% EtOH + 50% Histoclear II	1 h	Raumtemperatur
   100% Histoclear II	1 h	Raumtemperatur
   100% Histoclear II	1 h	Raumtemperatur
   50% Histoclear II + 50% Histowax	über Nacht	40-50 ° C

   NB! In den letzten Schritt der Konzentration Histowax nicht entscheidend ist, nur in etwas Wachs-Chips zu gießen.

1,4 Tag 4 Embedding NB! Fichte Einbettung Version.

6. 100% geschmolzen Histowax

   +60 ° C

   (Change morgens und abends)

1,5 Tag 5 Embedding NB! Fichte Einbettung Version.

7. 100% geschmolzen Histowax

   +60 ° C

   (Change morgens und abends)

1,6 Tag 6 Embedding NB! Fichte Einbettung Version.

8. 100% geschmolzen Histowax

   +60 ° C

   (Change morgens und abends)

   NB! Es ist ok, wenn das Wachs gelegentlich einmal täglich geändert wird, aber dann dauert es zwei Tage bis zu einem Tag der Änderungen abgeschlossen. Das Wachs Änderung kann auch für zwei weitere Tage andauern, ohne ein Problem. Dies ist für große Proben empfohlen, da es das Eindringen des Wachses in der Mitte dieser Gewebe hilft.

Option 2

NB! Arabidopsis / Raps Einbettung Version unten (Schritte 4-8).

1,2 Tag 2 Dehydration NB! Arabidopsis / Raps Einbettung Version.

4. NB! Alle Schritte bei +4 ° C und leichtem Schütteln, wenn nicht anders angegeben.

   1x PBS	30 min
   1x PBS	30 min
   30% EtOH	60 min
   40% EtOH	60 min
   50% EtOH	60 min
   60% EtOH	60 min
   70% EtOH	60 min

   Pause! Es ist möglich, hier zu stoppen und zu speichern das Gewebe in 70% EtOH bei +4 ° C für mehrere Monate.

   85% EtOH	60 min
   95% EtOH (+ Eosin)	über Nacht

   NB! Eosin zugesetzt wird, um das Gewebe rosa wodurch sie leichter zu beim Einbetten und Schneiden erkennen Fleck, aber es kann ausgeschlossen werden.

1,3 Tag 3 Dehydration und einbettenIng. NB! Arabidopsis / Raps Einbettung Version.

5. NB! Alle Schritte bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln, wenn nicht anders angegeben.

   100% EtOH (+ Eosin)	30 min
   100% EtOH (+ Eosin)	30 min
   100% EtOH (+ Eosin)	60 min
   100% EtOH (+ Eosin)	60 min

   NB! Transfer des Gewebes auf Szintillationsgefäße oder andere (Glas) abgefüllt.

   75% EtOH + 25% Histoclear II	30 min
   50% EtOH + 50% Histoclear II	30 min
   25% EtOH + 75% Histoclear II	30 min
   100% Histoclear II	60 min
   100% Histoclear II	60 min
   100% Histoclear II + ¼ Bände Histowax Chip	Übernachtung (ohne Schütteln)

   NB! In den letzten Schritt der Konzentration Histowax nicht entscheidend ist, nur in etwas Wachs-Chips zu gießen.

1,4 Tag 4 Embedding NB! Arabidopsis / Raps Einbettung Version.

6. Legen Sie die Flaschen mit Gewebe bei +42 ° C, bis das Wachs-Chips komplett zu schmelzen. Als nächstes fügen Sie ¼ Volumen von Wachs-Chips und lassen Sie sie vollständig zu schmelzen. Bewegen bis +60 ° C und lassen Sie das Fläschchen für mehrere Stunden. Schließlich ersetzen Wachs / Histoclear II mit frisch geschmolzenem Wachs und Inkubation über Nacht bei +60 ° C.

1,5 Tag 5 Embedding NB! Arabidopsis / Raps Einbettung Version.

7. 100% geschmolzen Histowax

   +60 ° C

   (Change morgens und abends)

1,6 Tag 6 Embedding NB! Arabidopsis / Raps Einbettung Version.

8. 100% geschmolzen Histowax

   +60 ° C

   (Change morgens und abends)

   NB! In der Arabidopsis / Raps-Protokoll (im Vergleich zu den Fichten-Protokoll) gibt es einen Tag 7 Embedding in der gleichen Weise wie in Tag 5-6, dh 100% geschmolzen Histowax bei +60 ° C und ändern Sie morgens und abends
   NB! Es ist ok, wenn das Wachs gelegentlich einmal täglich geändert wird, aber dann dauert es zwei Tage bis zu einem Tag der Änderungen abgeschlossen. Das Wachs Änderung kann auch für zwei weitere Tage andauern, ohne ein Problem. Dies ist für große Proben empfohlen, da es das Eindringen des Wachses in der Mitte dieser Gewebe hilft.

1,7 Tag 7 Embedding (Tag 8 in der Arabidopsis / Raps-Protokoll) (Film! Technische Details sind in dem Film gezeigt)

9. Vorheizen Petrischalen und / oder Formen bei +60 ° C. Schalten Sie auf einer heißen Platte (+60 ° C) und stellen Sie sicher geschmolzen Histowax zur Verfügung steht.
10. Gießen Sie das Gewebe und geschmolzen Histowax in eine Petrischale (oder eine Form) auf die heiße Platte gelegt. Fügen Sie weitere Histowax, so dass das Gewebe bedeckt sind. Hitze eine Pinzette und verteilen das Gewebe gleichmäßig in die Schüssel. Füllen Sie die Petrischale (oder Schimmel). Wenn das Wachs erhärtet, bevor das Gewebe in der richtigen Position sind, erwärmen Sie es erneut oder entfernen Sie die gehärteten Wachs mit dem erwärmten Pinzette.
11. Lassen Sie das Wachs-Block bei Raumtemperatur aushärten, bevor es bei +4 ° C. Es ist besser, mehrere Wachsblöcke statt der Einbettung der Gewebe zu fest, da das Wachs blockieren könnten brechen, wenn Stücke aus beim Schneiden geschnitten werden können.
    Pause! Lagern bei +4 ° C. Die Gewebe werden seit Jahren stabil.
    NB! Arbeit RNase frei von diesem Schritt und ab. Benutzen Sie Handschuhe, DEPC-Behandlung MilliQ-Wasser, Puffer, Glaswaren etc., Autoklaven Puffer und backen Glaswaren etc. bei Bedarf.

2. Sectioning (Film! Technische Details sind in dem Film gezeigt)

12. Schalten Sie zwei Kochplatten (+60 ° C und +42 ° C) und stellen Sie sicher geschmolzen Histowax zur Verfügung steht.
13. Hitze ein Skalpell und schnitt vorsichtig einen Wachsblock von Gewebe aus der Petrischale (es könnte knacken, wenn man zu heftig ist), oder entfernen Sie sie aus der Form. Wenn ein einzelner Wachsblock getrennt wurde, die Form des Stückes in die richtige Größe und Form der Schneiden im Mikrotom zu erleichtern.
14. Das Wachs Stück sollte eine zusätzliche Wachs "heel" unterhalb des Gewebes so dass es um den Block Halter befestigt werden kann. Heizen Sie den Block Halter und der Ferse auf der Heizplatte (+60 ° C) und verschmelzen sie zusammen. Es könnte notwendig sein, auf einen Tropfen Histowax II, um die Fusion Stall zu stellen. Lassen Sie es härten bei +4 ° C.
15. Schneiden Sie das Wachs-Block in 6-8 um dicke Schnitte in ein langes Band mit einem Mikrotom verbunden.
    NB! Dies wird erleichtert, wenn das Wachs-Block ist kalt, dh zur Speicherung des Wachsblock bei +4 ° C und bringen sie aus dem Kühlschrank, wenn ab dem Schneiden. Es kann auch nützlich sein, um das Messer kalt zu halten.
16. Studieren Sie die Bänder von Abschnitten in eine Lupe und markieren Sie diejenigen verwendet werden.
17. Put RNase-free MilliQ-Wasser auf den Objektträger (Probe-On Plus von Fisher Biotechnologie, die vorgereinigte und berechnet). Schneiden Sie das Farbband in kleinere Stücke und legte sie ("back" oder "glänzend" Seite nach unten) auf den Folien. Die Folien mit Bändern sollte auf +42 ° C Platte gelegt werden. Das Band sollte abflachen (dies ist wichtig!) In das Wasser. Lassen Sie die Teile sitzen für ein paar Minuten und dann mit einem Kimwipe / Seidenpapier auf dem Wasser abtropfen lassen.
18. Lassen Sie die Folien auf der Platte für 1-2 Stunden.
19. Inkubieren Sie die Objektträger bei +42 ° C über Nacht, so dass das Gewebe auf Objektträger haften.
    Pause! Es wird empfohlen, die Abschnitte so schnell wie möglich zu verwenden, aber sie können trocken gelagert werden in geschlossenen Kästen mit Trockenmittel bis zu mehreren Tagen bei +4 ° C.

3. THE MAKING OF PROBES

In-situ-Hybridisierung detektiert Ausdruck mit einer markierten Sonde spezifisch für eine bestimmte mRNA. Die Sonde, die am häufigsten ist ein Stück komplementäre RNA kann mit Digoxigenin, DIG markiert werden. DIG ist ein kleines Molekül, das Uridin befestigt werden kann und damit in der RNA-Sonde aufgenommen und dann unter Verwendung DIG-spezifischen Antikörpern.

Der Entwurf und die Herstellung der Sonde ist der wichtigste Schritt in einer RNA in situ Hybridisierung zu experimentieren. Es ist darauf zu machen, dass die Sonde hat eine hohe Spezifität und ist mit hochwertigen UTPs gekennzeichnet werden. Manchmal ist die Hybridisierung Temperatur und / oder Reaktion Länge haben, um für spezifische Sonden eingestellt werden. Wie immer sollte darauf geachtet werden, RNase Kontamination zu vermeiden.

Vor Etikettierung, isolieren Sie eine Vorlage nach Ihren Standard-Protokolle verwenden, zB cDNA-Klone, PCR-Fragmente und linearisieren die Vorlage. Sense-und Antisense-Fragmente isoliert und verstärkt aus der Vorlage mit Gen-spezifischen Primer. Für die PCR amplifizierten Fragmente verwenden keine Enzyme, die 3 'Überhänge produzieren. Um alle Fragmente eines T7 (oder SP6 oder T3) Überhang hinzu Verwendung von Primern Durchführung der T7-Sequenz oder unter Verwendung eines Vektors mit einem T7-Promotor.

Der Sinn (mRNA oder (-)-Strang-) Sonde haben die gleiche Sequenz wie die Ziel-mRNA und nicht an die Ziel-mRNA hybridisieren, während die Antisense-(anti-mRNA oder (+)-Strang-) Sonde die komplementäre Sequenz haben und damit hybridisieren Ziel geben das Signal von Interesse. Die Sense-Sonde ist als negative Kontrolle verwendet und es wird kein Signal erhalten, wenn das Experiment funktioniert einwandfrei. Eine positive Kontrolle wird auch benötigt, z. B. einer Sonde, die ein Haus-keeping-Gen entdeckt. Die Mehrheit der Folien sollten mit Antisense-Sonden hybridisiert werden, während nur ein paar Folien zu den verschiedenen Steuergeräten Sonden hybridisiert werden sollten.

3.1 FÜHLERTYP Kennzeichnung mit In-vitro-Transkription

Reagenzien aus dem DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7; 11175025910, Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland) oder ähnliches verwendet werden, wenn die Kennzeichnung der Sonden. Die 20 ul Reaktion hier beschriebenen ~ 10 ug von DIG-markierten RNA-Ausbeute sollte.

20. Machen Sie ein in vitro Transkription markierten Nukleotiden zu integrieren. Fügen Sie die folgenden Reagenzien in ein Röhrchen (keep on ice):

    Zutat	Volumen / Menge
    10 x NTP Kennzeichnung Mischung	2 ul
    10 x Transcription-Puffer	2 ul
    Protektor RNase-Inhibitor	1 ul (20U)
    RNA-Polymerase T7 (SP6 oder T3)	2 ul
    Template DNA (500-1000 ng)	x ul
    RNase-free MilliQ-Wasser-	y ul, um ein Endvolumen von 18 ul

21. Mischen Sie die NTP Kennzeichnung Mischung, Transkription Puffer, RNase-Inhibitor (NB!, wenn die Sonde kurz ist, zB <500 bp, können Sie den RNase-Inhibitor-Konzentration zu erhöhen 40U), Polymerase-DNA und Wasser und anschließend kurz zentrifugieren.
22. Inkubieren des Reaktionsgemisches bei +37 ° C für 2 Stunden (Bitte beachten, wenn die Sonde kurz ist, zB <500 bp, erhöhen Sie die Reaktionszeit auf 4-6 Stunden).
23. Add 2 ul DNase I und Inkubation bei +37 ° C für 15 min.
24. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 ul 0,2 M EDTA (pH 8,0). Prüfen Sie das Produkt auf Gel.
25. Niederschlag der Sonde durch Zugabe von 2,5 ul 4 M LiCl und 75 ul> 99,5% Ethanol. Gut mischen und inkubieren bei -20 ° C über Nacht (Bitte beachten Sie keine tRNA als Träger. Verwenden Sie stattdessen Glykogen oder Acrylamid nach Angaben des Herstellers).
26. Zentrifuge (13 000 rpm) für 30 Minuten bei +4 ° C und Entfernen des Überstandes. Waschen des Pellets (mindestens 10 min 13 000 rpm) zwei Mal in 70% Ethanol (~ 150-300 ul).
27. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet trocknen. Resuspendieren der Sonde in 30 ul RNase-freies Wasser für 1-2 Stunden auf dem Eis.
    Pause! Die Sonde kann bei -20 ° C für mehr als ein Jahr gelagert werden.
    NB! Save 0,5 ul Proben von Schritt 21 (vor der in vitro-Transkription), Schritt 23 (vor dem DNase-Behandlung), Schritt 24 (nach der DNase-Behandlung, aber vor der Fällung) und 1 ul Probe aus Schritt 27 (wenn die Sonde wurde resuspendiert). Führen Sie die Proben auf einem nondenaturating 1% TBE-Gel. Wenn die DNase-Reaktion gearbeitet hat richtig die Vorlage-Band wird verschwinden. Die in vitro-Transkription generieren soll eine dicke RNA Bande von ungefähr die richtige Größe. Wenn Sie mehrere Bands zu sehen, denaturieren die Proben bei +80 ° C für 5 Minuten durch Abschrecken auf Eis vor dem Laden an. Wenn die Erholung von Schritt 27 sieht schlecht aus könnte es so sein, weil die Sonde nicht suspendiert war gut. Inkubieren Sie die RNA bei +55 ° C 5-10 Minuten, um es in Lösung zu erhalten.

3,2 Hydrolyse von langen Sonden

NB! Wenn Ihr Sonde ist größer als 150 bp, sollte auf 50-150 bp reduziert werden, um ein hohes Signal, aufgrund der besseren Durchdringung zu geben. Die Sonde kann chemisch abgebaut in einer Carbonat-Puffer (pH 10.2). Wenn die Sonde in der richtigen Größe überspringen die Hydrolyse, aber denken Sie daran, ein Volumen Formamid, dh 30 ul, um die Sonde hinzu.

28. Bereiten 0,2 M Natriumbicarbonat (NaHCO ₃₎ und 0,2 M Natriumcarbonat (Na ₂ CO _3). Beide sollten frisch sein.
29. Testen Sie die zwei Puffer durch Mischen von 5 ml H ₂ O, 2 ml 0,2 M NaHCO ₃ und ₃ ml 0,2 M Na ₂ CO _3. Der pH-Wert sollte ~ 10.2.
30. Berechnen Sie die Inkubationszeit:

    Inkubationszeit (in Minuten) = (L 0-L f) / (K * L 0 * L f)

    L 0 = Start Länge der Sonde in kb

    L f = endgültige Länge der Sonde in kb = zB 0,100 kb

    K = Geschwindigkeitskonstante für die Hydrolyse = 0,11 kb-1min-1

31. Hydrolysieren die Hälfte Ihrer Sonde und spare den Rest für später auf. Verdünnen Sonde auf 50 ul mit RNase freiem Wasser und mit 20 ul 0,2 M NaHCO ₃ (add first) und 30 ul 0,2 M Na ₂ CO _3. Mix und Inkubation bei +60 ° C für die berechnete Inkubationszeit.
32. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 10 ul 1 M NaOAc pH 4,7.
33. Niederschlag der Sonde durch Zugabe von 10 ul 4 M LiCl ₂ und 300 ul Ethanol (NB! Verwenden Glykogen oder Acrylamid als Träger, falls erforderlich). Inkubation bei -20 ° C über Nacht.
34. Zentrifuge (13 000 rpm) für 30 Minuten bei +4 ° C und Entfernen des Überstandes. Waschen des Pellets zweimal in 70% Ethanol (~ 300 ul). Zentrifuge (13 000 rpm) mindestens 10 min in jedem Waschgang bei +4 ° C.
35. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet trocknen. Resuspendieren der Sonde in 30 ul RNase-free MilliQ-Wasser. Fügen Sie ein Volumen Formamid, dh 30 ul, um die Sonde.
    Pause! Die Sonde kann bei -20 ° C für mehr als ein Jahr gelagert werden.
    NB! Take 2 ul des hydrolysierten Sonde und 2 ul der hydrolysierten Probe (vor dem Formamid zugesetzt wird) und prüfen Sie auf einem nondenaturating 1% TBE-Gel. Es sollte ein Unterschied in der Größe zwischen den beiden Proben. Die Sonden müssen möglicherweise bei +80 ° C für 5 Minuten durch Abschrecken auf Eis vor dem Laden gefolgt denaturiert werden.

4. In situ Hybridisierung (Film! Technische Details sind in dem Film gezeigt)

Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen RNase frei sind! Es ist nicht notwendig, um DEPC-Behandlung alles, aber mindestens zu autoklaviert MilliQ-Wasser. Stellen Sie sicher, dass alle Gläser bei +200 ° C erhitzt werden über Nacht oder mindestens für 5 Stunden. Gönnen Kunststoffbehälter und Rührstäbchen mit 0,1 M NaOH unter Rühren über Nacht. Spülen Sie den Kunststoff-Behälter mehrmals mit autoklaviert MilliQ-Wasser (~ 500 ml / Container). Es ist entscheidend, um die Behälter sorgfältig spülen, um Spuren von NaOH, dass die Hybridisierung stören könnten zu vermeiden. DEPC-behandelt alle Stammlösungen, mit Ausnahme der Tris-Puffer. Überprüfen Sie alle Lösungen etc. vor dem Start des Experiments, um sicherzustellen, dass alles ist vorhanden. Bis Schritt 61 (mit Ausnahme Schritte 51-52) halten wir die Dias in ein Rack montiert, die einfach zwischen Behälter verschoben wird.

4.1 In situ Abschnitt Vorbehandlung

36. Entparaffinieren / dehydrieren Abschnitte:

    2x 10 min Histoclear II (Glasbehälter)

    2x 1-2 min 100% EtOH

    1-2 min 95% EtOH

    1-2 min 90% EtOH

    1-2 min 80% EtOH

    1-2 min 60% EtOH

    1-2 min 30% EtOH

    1-2 min H 2 O

37. Waschen Sie die Slides für 15-20 min in 2x SSC bei Raumtemperatur (NB! vorbereiten Paraformaldehyd in Schritt 42 während der Inkubationszeit verwendet).
38. Behandeln Sie die Gewebe für 30 min mit Proteinase K bei +37 ° C unter leichtem Schütteln (z. B. 1 pg / ml für Arabidopsis / Raps und 3 ug / ml für Fichte). Mix und heizen bis +37 ° C 100 mM Tris pH 8 und 50 mM EDTA. Add Proteinase K unmittelbar vor der Behandlung der Folien. NB! Die Proteinase K-Behandlung muss optimiert, je nach Gewebe, Pflanzenarten und alt sein. (Bitte beachten vorbereiten Triethanolamin in Schritt 45 während der Inkubationszeit verwendet).
39. Behandeln Sie die Folien für 2 min mit 2mg/ml Glycin in 1x PBS bei Raumtemperatur. (Bitte beachten Mix der Glycin mit PBS am Tag vor der Verwendung sicherstellen, dass das Glycin richtig gelöst).
40. Waschen Sie die Slides für 2 Minuten in 1x PBS bei Raumtemperatur.
41. Waschen Sie die Slides für 2 Minuten in 1x PBS bei Raumtemperatur.
42. Inkubieren Sie die Objektträger für 10 Minuten mit 4% (w / v) Paraformaldehyd (frisch zubereitet) in 1x PBS pH 7 bei Raumtemperatur. Verwenden Glasbehälter.
43. Waschen Sie die Slides für 5 Minuten in 1x PBS bei Raumtemperatur.
44. Waschen Sie die Slides für 5 Minuten in 1x PBS bei Raumtemperatur. (Dispense Acetanhydrid in die Lösung in Schritt 45).
45. Inkubieren Sie die Objektträger für 10 Minuten in 0,1 M Triethanolamin (frisch zubereitet, pH 8) und Acetanhydrid bei Raumtemperatur.
46. Waschen Sie die Slides für 5 Minuten in 1x PBS bei Raumtemperatur.
47. Waschen Sie die Slides für 5 Minuten in 1x PBS bei Raumtemperatur.
48. Entwässern:

    30 sec 30% EtOH

    30 sec 60% EtOH

    30 sec 80% EtOH

    30 sec 90% EtOH

    30 sec 95% EtOH

    2x 30 sec 100% EtOH

    Pause! Es ist möglich, hier zu stoppen und speichern Sie die Objektträger in einen Behälter mit einer kleinen Menge von EtOH in den Boden bei +4 ° C für mehrere Stunden.

4.2 In-situ-Hybridisierung (Film! Technische Details sind in dem Film gezeigt)

Entscheiden Sie, welche Folien, mit denen Sonden verwenden, vergessen Sie nicht, sowohl Sense-und Antisense-Sonden sowie eine positive Kontrolle verwendet werden. (Bitte beachten ProbeOn Plus-Objektträger aus Fisher Biotechnologie haben eine weiße Glasur, mit denen sie in Paare während der Hybridisierung / Erkennung Schritte des Protokolls eingeklemmt werden können.) Die gleiche Sonde mit der gleichen Konzentration auf eine bestimmte Folie Paar verwendet werden sollte. Ermitteln Sie, wie viel Hybridisierungslösung auf der Grundlage der Gesamtzahl der Dia-Paare zu machen. Heizen Sie den Dextransulfat in +60 ° C. Die Hybridisierungslösung sehr zähflüssig aus der Dextransulfat. Legen Sie die Hybridisierungslösung in +60 ° C und es wird einfacher zu handhaben. Der Luft trocknen die Folien auf sauberen Papiertüchern oder Kimwipe / Tissue-Papieren, bevor die Sonde angelegt wird. Die Folien müssen völlig trocken sein. Für jedes Paar von Folien hinzufügen der Sonde. Es ist wichtig, verschiedene Sonden-Konzentrationen (z. B. 0,5, 2 und 4 ul) Test, um die optimale Konzentration zu finden, bevor das eigentliche Experiment ist vorgeformt.

Hybridisierungslösung	5 gleiten Paare	10 gleiten Paare	15 gleiten Paare	20 Dia-Paare
10x in situ Salze	100 ul	200 ul	300 pl	400 ul
deionisiertem Formamid	400 ul	800 ul	1200 ul	1600 ul
50% Dextransulfat (+60 ° C)	200 ul	400 ul	600 ul	800 ul
50x Denhardt-Lösung	20 pl	40 ul	60 ul	80 ul
tRNA (100mg/ml)	10 pl	20 pl	30 mu l	40 ul
H 2 O (DEPC behandelt)	70 ul	140 ul	210 ul	280 ul
Gesamtvolumen	800 ul	1600 ul	2400 ul	3200 ul

49. Verdünnen Sie die Probe in RNase-freiem MilliQ-Wasser auf ein Endvolumen von 20 ul. Fügen Sie einen Datenträger (z. B. 20 ul) Formamid, um die Sonde geben einem Gesamtvolumen von 40 ul. Erhitzen Sie die Sonde auf 80 ° C für 2 Minuten. Auf Eis für 2 min. Spin nach unten. Halten Sie die Sonde auf dem Eis. Diese Sonde-Mischung reicht für ein Paar von Dias. Multiplizieren Sie nach der Gesamtzahl der Dia-Paare für die Sonde.
50. Add 160 ul Hybridisierungslösung für jedes Paar von Dias geben ein Endvolumen von 200 ul (dh 160 ul Hybridisierungslösung + 40 ul-Sonde) für jede Folie Paar. Mix, ohne dass Blasen.
51. Übernehmen Sie die Sonde auf eine Folie und langsam Sicherung der zwei Folien zusammen. (Bitte beachten sandwiching kann nur mit Probe-On Plus Dias oder gleichwertige Folien. Wenn Dias ohne Zuckerguss verwendet werden verwenden Deckgläser statt sandwiching durchgeführt werden.)
52. Elevate Dias über nasse Papiertücher in einem Kunststoff-Behälter (die Dichtungen fest) mit Kunststoff-Pipetten. Hybridisieren 50-55 ° C über Nacht (12-16 Stunden).

4.3 In situ-Hybridisierung post (Film! Technische Details sind in dem Film gezeigt)

53. Bereiten Sie die in situ Hybridisierung post durch Erwärmen ~ 2 L 0,2 x SSC (+55 ° C) und ~ 2 L 1x NTE (+37 ° C) über Nacht. Mehr SSC und NTE sind erforderlich, wenn die RNase-Behandlung (Schritte 57-59 unten) durchgeführt wird.
54. Dip jede Folie Paar in warmen 0.2x SSC (siehe oben) zu trennen und spülen Sie sie. Dann legen Sie sie in ein Rack in einem Containermit warmem 0.2x SSC.
55. Waschen Sie die Slides für 60 min in 0,2 x SSC unter leichtem Schütteln bei +55 ° C. (Bitte beachten Bereiten Sie die Boehringer-Block-Lösung in Schritt 63 während der Inkubationszeit verwendet.)
56. Wiederholen Sie die Wäsche in 0.2x SSC für 60 min. (Bitte beachten Wenn die RNase Schritt durchgeführt wird lassen die RNase Tauwetter während dieser Inkubationszeit, wenn nicht weiter zu Schritt 60).
57. Optional: Waschen Sie die Slides für 5 min in warmen 1x NTE (siehe oben) bei +37 ° C unter leichtem Schütteln.
58. Optional: Wiederholen Sie die Wäsche in warmem 1x NTE für 5 min bei +37 ° C mit sanften agtation.
59. Optional: Behandeln Sie die Folien mit RNase (20 ug / ml RNase A in 1x NTE) für 30 min bei +37 ° C unter leichtem Schütteln. Dann für 5 min in 1x NTE Waschen bei +37 ° C unter leichtem Schütteln. Wiederholen Sie die 1x NTE waschen.
60. Waschen Sie die Slides für 60 min in 0,2 x SSC bei +55 ° C unter leichtem Schütteln. (Bitte beachten Bereiten Sie den Block-Lösung in Stufen 64-65 und 67 Während der Inkubationszeit verwendet.)
61. Waschen Sie die Slides für 5 min in 1x PBS bei Raumtemperatur (Pause! Sie können Folien in 1XPBS bei +4 ° C über Nacht, wenn Sie am nächsten Tag fortsetzen wollen.)
62. Legen Sie die Folien auf dem Boden eines großen Kunststoff-Behälter mit der Probe nach oben.
63. Inkubieren Sie die Objektträger mit 1% Boehringer Block in 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl für 45 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Nur decken die Dias mit Blocking-Lösung. Abgießen der Blockierungslösung während die Dias immer noch in der Kunststoff-Behälter oder Objektträger in einen neuen Behälter. Wenn Abgießen der Lösung die Folien in der Regel auf die Kunststoff-Behälter halten, aber stellen Sie sicher, dass sie nicht herausfallen aus dem Behälter.
64. Ersetzen Sie die Boehringer-Block-Lösung mit 1,0% BSA in 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% Triton X-100. Führen Sie die Inkubation wie in Schritt 63.
65. Verdünnen Sie die Anti-dig-Antikörper (1:1250, dh 8 ul Antikörper in 10 ml BSA) in der BSA / Tris / NaCl / Triton Lösung aus Schritt 64. Machen Sie eine Pfütze von Antikörper-Lösung in einer Kunststoff wiegen Gericht. Sandwich Dias zusammen, damit Kapillarkräfte ziehen Sie die Lösung. Lassen Sie auf Kimwipe / Seidenpapier und wiederholen Sie, versuchen Sie, Blasen zu vermeiden.
66. Elevate Dias über nasse Papiertücher in Kunststoff-Behälter und lassen Sie die Folien bei Raumtemperatur für 2 Stunden zu sitzen.
67. Lassen Sie gleitet auf Kimwipe / Seidenpapier und zu trennen. Legen Sie auf der Unterseite des Kunststoff-Behälter, wie in Schritt 63. Wash 4x in der BSA / Tris / NaCl / Triton Lösung. 15 min jedes Mal, leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
68. 10 min 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl _2. Legen Sie auf der Unterseite des Kunststoff-Behälter, wie in Schritt 63.
69. Dip Folie in Tris pH 9.5/NaCl/MgCl _2-Lösung, um alle Reinigungsmittel sorgen wird abgewaschen.
70. Machen Sie Sandwiches und erarbeiten westlichen blaue Lösung, wie in 65 Jahren. Wiederholen Sie einmal.
71. Die Objektträger in Kunststoff-Behälter über nasse Papiertücher in völliger Dunkelheit (wrap in Alufolie) für 1-5 Tage bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie nach 6, 12 und 24 Stunden danach einmal täglich.
72. Lassen Sie Dias, in 1xTE spülen, um die Reaktion zu stoppen. Setzen Sie auf Deckgläschen vor dem Rutschen in Mikroskop untersucht. Die Folien können in 1x TE für mehrere Monate gespeichert werden, sondern fotografieren so schnell wie möglich.

REZEPTE / STOCK SOLUTIONS

NB! Verwenden RNase-free MilliQ-Wasser so weit wie möglich, z. B. DEPC-Behandlung MilliQ-Wasser (Add 0,1% DEPC. Leave Nacht. Autoclave (20 Minuten bei 15 psi, also 1,05 kg / cm ^2, auf liquide Zyklus) oder bei Verwendung mindestens autoklaviert MilliQ-Wasser. Bei der Vorbereitung Puffer und Stammlösungen ist es auch möglich, RNase-freie Salze etc. in DEPC-behandeltem Wasser anstelle von DEPC-Behandlung der Puffer und Stammlösungen sich aufzulösen. Wenn Sie nicht DEPC-Behandlung von Wasser , Puffer und Lager-Lösungen, zumindest Autoklaven oder Filter sterilisieren.
Pause! Shop-Puffer und Lager-Lösungen bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben.
NB! Hier finden Sie viele der Puffer sowie Tipps, wie man sie in Molecular Cloning machen (Sambrook, J., und DW Russell. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA).

Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolamin (pH 8, Volumen: 800 ml).

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
Triethanolamine	10,4 ml	0,1 M Triethanolamin
MilliQ-Wasser-	786,4 ml	Endvolumen 800 ml
HCl	3,2 ml	geben pH8,0
Essigsäureanhydrid	4,8 ml	0,6%

• Zu 0,1 M Triethanolamin-Puffer, pH 8,0, verdünnt 10,4 ml Triethanolamin in 786,4 ml H ₂ O zu machen, und fügen Sie 3,2 ml HCl auf den pH-Wert auf 8,0 (Kontrolle mit pH-Indikator) zu bringen.
• Elevate Dia-Rack mit gebrochenen 10 ml Kunststoff-Pipetten oder ähnliches in einem Behälter von Triethanolamin mit einem Rührstab in den Boden.
• Dispense 4,8 ml Acetanhydrid in das Triethanolamin ein paar Minuten, bevor Dias, so dass er gut durchmischt ist.

NB! Nehmen Sie die 0,1 M Triethanolamin frisch und fügen Acetanhydrid kurz vor der Inkubation.
NB! Verwenden Glasbehälter. Triethanolamin-Puffer zu verwenden, weil Acetanhydrid in Wasser instabil.

Agarose (1%) Gel in 1 x TBE (Volumen: 100 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
Agarose	1 g	1%
1 x TBE	bis zu 100 ml

Mix Agarose mit 1 x TBE. Heat / kochen, bis die Agarose geschmolzen ist. Cast ein Gel. Führen Sie das Gel in einer 1 x TBE-Puffer.

Dextransulfat

Verdünnen Sie 5 g Dextransulfat bis 10 ml mit DEPC-behandeltem MilliQ-Wasser (dh 50% (w / v)) und lösen sich in 60 ° C.
Pause! Lagerung bei -20 ° C.

0,5 M EDTA pH 8,0 (Titriplex III, Volumen 500 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
EDTA (372,24 g / mol)	93,06 g	0,5 M EDTA
MilliQ-Wasser-	bis zu 500 ml
NaOH	~ 10 g Pellets	geben pH 8,0
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Lösen Sie EDTA in Wasser (passiert bei pH 8,0), um ein Endvolumen von 500 ml eingestellt werden. Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.

Fix-Lösung / Fixativ (Schritte 1-3, 42) - 4% (w / v) Paraformaldehyd in 1x PBS, pH 7,0 (650 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
MilliQ-Wasser-	585 ml
10x PBS	65 ml	1x PBS
10M NaOH	520 ul	geben pH ~ 11
Paraformaldehyd	26 g	4%
Konzentrierte HCl	449 ul	geben pH ~ 7

• Mix Wasser, PBS und NaOH und Wärme zu 60-70 ° C (Temperatur und hohem pH-Wert macht es einfacher, die Paraformaldehyd aufzulösen.
• Add (in Abzug) Paraformaldehyd.
• Wenn die Lösung geklärt legen Sie es auf Eis und pH-Wert auf 7,0 durch Zugabe von 449 ul konzentrierter HCl.

NB! Machen Sie frisch.
NB! In der Fichte-Protokoll Glutaraldehyd zu einer Endkonzentration von 0,25%, dh 6,5 ml 25% Glutaraldehyd auf das Gesamtvolumen von 650 ml oder 10 ml 25% Glutaraldehyd auf das Gesamtvolumen von 1000 ml (denken Sie daran, das Wasser mit einer gleichen reduzieren Volumen).
NB! Fügen Sie ein paar Tropfen Tween 20 und / oder Triton X-100, nach dem pH-Wert eingestellt ist, die Oberflächenspannung zu verringern, um die Fixierung in den Schritten 1-3 erleichtern. DO NOT USE IN STEP 42!
NB! Bei der Festsetzung Pflanzengewebe ein kleineres Volumen (z. B. 100 bis 200 ml) von Fixativ ist in der Regel erforderlich.

10x in situ Salze (Volumen 100 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
5 M NaCl	60 ml	3M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8,0	10 ml	0,100 M Tris
1 M Na-Phosphat pH 6,8	10 ml	0,100 M Na-Phosphat
0,5 M EDTA	10 ml	0,050 m EDTA
MilliQ-Wasser-	bis zu 100 ml

Mischen Sie einen Na-Phosphat-Puffer mit pH 6,8 (46,3 ml 1 M Na ₂ HPO ₄ + 53,7 ml 1 M NaH ₂ PO _4). Mix NaCl, Tris, Na-Phosphat-Puffer, EDTA und Wasser. Autoclave. Pause! Lagerung bei -20 ° C.

4 M LiCl ₂ (Lithiumchlorid, Volumen: 100 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
LiCl 2 (42,39 g / mol)	16,956 g	4M LiCl 2
MilliQ-Wasser-	bis zu 100 ml
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Lösen Sie LiCl ₂ in Wasser, um ein Endvolumen von 100 ml eingestellt werden. Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.
Pause! Lagerung bei +4 ° C.

1 M MgCl ₂ · H ₂ O (Magnesiumchlorid, Volumen: 100 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol)	20,33 g	1 M MgCl 2 · H 2 O
MilliQ-Wasser-	bis zu 100 ml
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Lösen Sie MgCl ₂ in Wasser, um ein Endvolumen von 100 ml eingestellt werden. Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.
NB! MgCl ₂ ist sehr hygroskopisch. Nicht angebrochene Flaschen für längere Zeit.

5 M NaCl (Natriumchlorid, Volumen: 1 l)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
NaCl (58,44 g / mol)	292,2 g	5 M NaCl
MilliQ-Wasser-	bis zu 1l
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Lösen Sie NaCl in Wasser, um ein Endvolumen von 1 l passen Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.

1 M NaOAc pH 4,7 (Natriumacetat, Volumen: 100 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
NaOAc (82,03 g / mol)	0,8203 g	1 M NaOAc
MilliQ-Wasser-	bis zu 100 ml
Essigsäure		geben pH 4,7
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Lösen Sie NaOAc in Wasser. Den pH-Wert auf 4,7. Passen Sie auf ein Endvolumen von 100 ml. Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.

0,2 M Na ₂ CO ₃ pH11.4 (Natriumcarbonat, Volumen: 10 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
Na 2 CO 3	0,21198 g	0,2 M Na 2 CO 3 pH = 11,4
MilliQ-Wasser-	bis zu 10 ml

Lösen Na ₂ CO ₃ in Wasser; anpassen, um ein Endvolumen von 10 ml. Der pH-Wert sollte 11,4 sein.
NB! Machen Sie frisch.

0,2 M NaHCO ₃ pH8.2 (Natriumbicarbonat, Volumen: 10 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
NaHCO 3	0,16802 g	0,2 M NaHCO 3: pH = 8,2
MilliQ-Wasser-	bis zu 10 ml

Lösen Sie NaHCO ₃ in Wasser; anpassen, um ein Endvolumen von 10 ml. Der pH-Wert sollte 8,2 sein.
NB! Machen Sie frisch.

1 M Na ₂ HPO ₄ · 2 H ₂ O (500 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol)	88,995 g	1 M Na 2 HPO 4
MilliQ-Wasser-	bis zu 500 ml
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Lösen Na ₂ HPO ₄ in Wasser, um ein Endvolumen von 500 ml eingestellt werden. Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.

1 M NaH ₂ PO ₄ · H ₂ O (500 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol)	68,995 g	1 M NaH 2 PO 4
MilliQ-Wasser-	bis zu 500 ml
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Lösen Sie NaH ₂ PO ₄ in Wasser, um ein Endvolumen von 500 ml eingestellt werden. Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.

5x NTE (Gesamtvolumen: 1l)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
5 M NaCl	500 ml	2,5 M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8	25 ml	50 mM Tris-Cl pH 8
0,5 M EDTA	5 ml	5 mM EDTA
MilliQ-Wasser-	470 ml	Endvolumen 1l

Mix NaCl, Tris, EDTA und Wasser. Nicht DEPC-Behandlung. Autoclave.

10 x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) pH 7,0 (Gesamtvolumen: 1l)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
5 M NaCl	260 ml	1,3 M NaCl
1 M Na 2 HPO 4	70 ml	70 mM Na 2 HPO 4
1 M NaH 2 PO 4	30 ml	30 mM NaH 2 PO 4
MilliQ-Wasser-	640 ml	Endvolumen 1l
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Mix NaCl, Na ₂ HPO _4, NaH ₂ PO ₄ und Wasser. Den pH-Wert auf pH 7,0 mit HCl. Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.

20x SSC pH 7,0 (Gesamtvolumen: 1l)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
NaCl (58,44 g / mol)	175,32 g	3 M NaCl
Na-Citrat (294,1 g / mol)	88,23 g	0,300 m Na-Citrat
MilliQ-Wasser-	bis zu 1 l
HCl		geben pH 7,5
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Lösen Sie NaCl und Na-Citrat in ~ 800 ml Wasser. Den pH-Wert auf pH 7,0 mit HCl. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 l mit Wasser. Add 0,1% DEPC. Lassen Sie über Nacht. Autoclave.

5 x TBE (Volumen: 1l)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
Tris (121,14 g / mol)	54 g	~ 0,45 M Tris
Borsäure (61,83 g / mol)	27,5 g	~ 0,45 M Borsäure
EDTA (372,24 g / mol)	3,7 g	~ 0,01 M EDTA
MilliQ-Wasser-	bis zu 1l

Mix Tris, Borsäure, EDTA und Wasser. Der pH-Wert sollte ~ 8,3 sein. Verdünnen auf 1 x TBE vor dem Gebrauch.

10 x TE pH 8,0 (Tris EDTA, Volumen: 1l)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
1 M Tris-Cl, pH 8,0	100 ml	0,100 M Tris-Cl
0,5 M EDTA pH 8,0	100 ml	0,050 m EDTA
MilliQ-Wasser-	bis zu 1l

Mix Tris, EDTA und Wasser. Nicht DEPC-Behandlung. Autoclave.
NB! Tris sollte nicht DEPC-behandelt! Verwenden RNase-freies Pulver und verdünnt mit DEPC-treated/RNase-free MilliQ-Wasser.

1 M Tris-HCl pH 7,5 bis 9,5 (Volumen 500 ml)

Zutat	Volumen / Menge	Endkonzentration
Tris (121,14 g / mol)	60,57 g	1 M Tris
MilliQ-Wasser-	bis zu 500 ml
HCl		geben pH 7,5
HCl		geben pH 8,0
NaOH		geben pH 9,5

Lösen Tris in DEPC-behandeltem Wasser. Passen Sie auf den gewünschten pH-Wert. Passen Sie auf ein Endvolumen von 500 ml. Autoclave.
NB! Tris sollte nicht DEPC-behandelt! Verwenden RNase-freies Pulver und verdünnt mit DEPC-treated/RNase-free MilliQ-Wasser.
NB! In Molecular Cloning (siehe oben) gibt es eine Tabelle, wieviel Konzentrat HCl benötigt wird, um den richtigen pH-Wert zu erreichen.

MATERIAL UND METHODEN

Die in situ-Protokoll wird über und in dem Film vorgestellt. Hier weitere Informationen des pflanzlichen Materials und Sonden in diesem konkreten Beispiel verwendet werden, beschrieben.

Pflanzenmaterial und experimentelles Design

Männliche Zapfen von Picea abies [L.] Karst. (Fichte) wurden in Uppsala, Schweden, im Herbst 2007 erhoben. Acht Kegel wurden aufgeschnitten und Abschnitte ausjedem Kegel waren in jeder Behandlung eingesetzt. Drei Proteinase K-Konzentrationen wurden getestet, 1, 3 und 5 ug / ul und jede Konzentration wurden mit oder ohne RNase behandelt. Folien nicht mit RNase behandelt wurden, in PBS während RNase-Behandlung verlassen. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. und Brassica napus L., wurden unter kontrollierten Bedingungen in einer Kultur Kammer mit 22 ° C/18 ° C Tag / Nacht-Temperaturen und einer Photoperiode von 16 h Junge Blütenstände mit Blütenknospen, Stufen 0-10 (Stadien nach Smyth ⁵⁾ wurden untersucht.

cRNA-Sonden

Gesamt-RNA aus P. isoliert abies männlichen Zapfen wie zuvor 6 beschrieben und von A. thaliana und B. napus mit TRIzol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, USA) und der Qiagen RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland), jeweils in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Herstellers. Die cDNA wurde von 0,5 bis 1 pg Gesamt-RNA, je nach Art, mit Superscript III Reverse Transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) nach den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. AtAP3 und BnAP3 Sense-und Antisense-Fragmente und P. abies Sinn-Fragmente wurden isoliert und verstärkt mit genspezifischen Primer (Tabelle 1). DAL13 antisense-Fragmente wurden isoliert und mit den Primern wie in 7. Ein T7 Überhang wurde Fragmente aus A. hinzugefügt thaliana und P. abies mit modifizierten Rückwärtsprimern Durchführung der T7-Sequenz (Tabelle 1). Ein 500 bp Fragment wurde isoliert mit BnAP3 spezifische Primer (Tabelle 1) und kloniert in einen pGEM-T Vektor mit einem T7-Promotor. Für die P. abies Fragmente alle PCR-Reaktionen in einem Endvolumen von 20 ul mit 0,2 U Phusion High-Fidility DNA Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finnland), 1x Phusion HF-Puffer, 200 uM von jedem dNTP, 0,3 uM von jedem durchgeführt wurden Grundierung und 25-50 ng cDNA und ein Standard-PCR-Programm wurde mit Glühtemperatur 60-55 ° C (touch-down -1 ° C / Zyklus), gefolgt von 55 ° C eingesetzt Nach den Empfehlungen des Herstellers und langen Sonden wurden auf etwa 100-150 bp verdaut; Sense und Antisense-cRNA-Sonden für alle drei Arten wurden mit in vitro-Transkription mit dem DIG RNA Labeling Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland SP6/T7) synthetisiert Fragmente mit einer Na ₂ CO _3-Puffer nach Anspruch ^3.

ERGEBNISSE

Hier in der Ergebnisliste Abschnitt beschreiben wir drei verschiedene Beispiele für typische Ergebnisse aus In-situ-Experimente.

Der genetische Mechanismus, der reproduktiven Entwicklung regelt in Gymnospermen und Angiospermen durch Angabe männliche und weibliche Organ Identität scheint evolutionär konservierte ^7-9 werden trotz, dass die beiden Samen-Linien 285.000.000 Jahre alt ¹⁰ getrennt. In A. thaliana die floralen homeotischen Gene APETALA3 (AP3 ¹¹⁾ und PISTILLATA (PI ¹²⁾ sind erforderlich und ausreichend, um männliche Fortpflanzungssystem Entwicklung im Rahmen einer Blume geben, und diese Funktion scheint innerhalb der Angiospermen Linie ¹³ erhalten werden. In Gymnospermen, die Blumen fehlen und haben ihre Geschlechtsorgane in getrennte männliche und weibliche Zapfen (Abb. 1A-C), Gene angeordnet homolog zu AP3 und PI sind speziell in der Pollen tragenden Organe des männlichen Kegel, die microsporophylls ^7,14 ausgedrückt. Folglich definiert eine ähnliche Reihe von homologen Gene in beiden Angiospermen und Gymnospermen die Pollen tragenden Organe.

Gene spezifischen Sonden gegen AtAP3 und BnAP3 bzw. gerichtet, gab Signale von Stufe 3 in jungen Blütenknospen in einem entsprechenden Bereich Wirtel zwei und drei in A. thaliana und B. napus. In späteren inszeniert Knospen die Signale für die Entwicklung Blütenblätter und Staubgefäße (Abb. 2a und b) eingeschränkt wurden. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit früheren Studien ^11,15,16. Probes zur AP3 Homolog in P. gerichtet abies, DAL13 produzierte Signale im microsporophylls von P. abies männlichen Zapfen vor und nach Sprossmeristem Kündigung (Abb. 2C und D), wie aus früheren Studien ^7,14 erwartet. Sense-Sonden gab kein Signal über dem Hintergrund (Abb. 3A-B und Daten nicht gezeigt). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, Ausdruck von A. thaliana AP3 und ihre Orthologe in B. napus und P. abies bei der Entwicklung von männlichen Geschlechtsorgane.

Abbildung 1. A.thaliana und B. napus Blüten und Pollen produzieren männlichen Zapfen der Nadelbäume P. abies Bilder zeigen Blütenstände mit Blütenknospen und offene Blüten A.thaliana und B.napus in A und B jeweils. Beachten Sie, dass Angiospermen Blumen neben der sterilen Blütenhülle sowohl männliche als auch weibliche Geschlechtsorgane Häfen sowie die Staubblätter und Fruchtblätter. Dargestellt in C ist eine der Gymnospermen P. Zweig abies mit grünen und roten Nadeln vegetative Fortpflanzung männlichen Zapfen.

Abbildung 2. Expression von A. thaliana AP3 und homologe Gene in B. napus und P. abies. Mikroskopische Aufnahmen zeigen Längsschnitte von A. thaliana und B. napus Blütenstände in A bzw. B und P. abies männlichen Zapfen in C und D. Abschnitte mit Antisense-Sonden gegen AtAP3 in A und B zeigen in BnAP3 Signal in der zweiten und dritten Wirtel Blütenorganen gerichtet hybridisiert. Zahlen zeigt florale Stufen nach Smyth ^5. Antisense-Sonde in Richtung DAL13 Gens gerichtet gaben Signal in den Pollen tragenden microsporophylls von P. abies männlichen Zapfen, wie in CD dargestellt. Beispiele für microsporophylls sind durch Pfeile angedeutet. Pfeilspitzen in AD Punkt Hybridisierungssignal erscheint als violett. In C und D Phenolverbindungen geben bräunlich unspezifische Farbe einzelner Zellen in den zentralen Kern. s, Kelchblatt; p, Blütenblatt, st, Staubblatt, c, Fruchtblatt; ms, Mikrosporophyll; pi, Mark; pp; pre-Pollen-Zellen. Bar: 100 um.

Abbildung 3. DAL13 Ausdruck in männlichen Zapfen von P. abies. Alle Aufnahmen (AH), zeigen Längsschnitte männlichen Zapfen nach Sprossmeristem Kündigung. Pfeilspitzen weisen auf Zelltypen, in denen DAL13 ausgedrückt wird. Abschnitte in A und B sind mit einem Sinn-Sonde, um die Hintergrundfärbung zu bestimmen hybridisiert. Schliffbilder C bis H sind mit einem DAL13 Antisense-Sonde hybridisiert. Abschnitte aus Experimenten mit und ohne RNase-Behandlung sind in D, F, H und C, E, G bzw. dargestellt. 100 pm: Mikroskopische Aufnahmen von Experimenten mit 1 pg / ml Proteinase K in C und D, 3 pg / ml in E und F, und 5 g / ml in G und H. Bar gezeigt.

Diskussion

Zwei Aspekte des P. abies-Protokoll wurden im Vergleich zu den A. optimiert thaliana / B. napus-Protokoll, RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration. Die RNase entfernt Hintergrund Signale und erhöht damit das Signal Spezifität ^17. Die Proteinase K-Behandlung ist notwendig, um das Gewebe permeabilisieren so kann die Sonde geben und hybridisieren, die RNA-Pool von Interesse. Die DAL13 Antisense-Sonde hat einen höheren Signal ohne RNase-Behandlung (Abb. 3C, E, G) im Vergleich zu Abschnitten mit RNase für 30 min (Abbildung 2D, F und H) behandelt. Da die RNase-Behandlung nicht verbessert hat das Signal war es aus dem Protokoll entfernt. 1, 3 und 5 ug / ml; Die Proteinase K-Behandlung wurden bei drei verschiedenen Konzentrationen getestet. Im Fall von P. abies eine geringe oder gar kein Signal beobachtet wurde mit 1 pg / ml Proteinase K (Abb. 3C-D). Ein starkes Signal sowohl mit 3 ug / ml (Abb. 3E-F) und 5 g / ml erhalten wurde (Abb. 3G-H) Proteinase K. Da keine offensichtlichen Unterschiede in der Signalstärke gefunden wurde, wenn mit 5 ug / ml Proteinase K im Vergleich zu 3 g / ml, entschieden wir uns für 3 ug / ml in unserem Protokoll verwenden. Es ist wahrscheinlich, dass die Notwendigkeit einer höheren Proteinase K-Konzentration in der P. abies männlichen Zapfen, die A. im Vergleich thaliana und B. napus Blütenknospen ist darauf zurückzuführen, kompakter Gewebe mit höherer Phenole und Polysaccharide.

Während der Fixierung und Einbettung einige Unterschiede zwischen den A. thaliana / B. napus-Protokoll und das P. abies-Protokoll sind evident. Das Gewebe von Interesse ist fest auf RNA Halt bietet und das ist ein kritischer Schritt, da schlecht festen Materialien eine geringe oder nicht nachweisbare Signal, obwohl die mRNA sehr reichlich vorhanden ist geben könnte. Das Gewebe wird entwässert, gelöscht und eingebettet in Wachs in allmählichen Veränderungen zu Gewebeschäden zu vermeiden, und in einigen Protokollen 0,85% NaCl wird das Ethanol in der Dehydratisierung hinzugefügt, um weitere zu vermeiden Schrumpfung und Schwellung der Zellen ^3. Die Dehydratisierung Schritt beim Einbetten kann auf Eis durchgeführt werden, um RNase-Aktivität bei gering zu halten. In der P. abies Protokoll der 4% Paraformaldehyd fix Lösung enthält 0,25% Glutaraldehyd, die angeblich ein besseres RNA Zurückbehaltungsrecht ^{17 Auch} wenn einige, dass es wahrscheinlich keinen Unterschied ³ argumentieren ist. Nach dem Anschneiden des Materials wird auf Objektträgern fixiert und vorbehandelt (zB entwachst, rehydriert, permeabilisiert, behandelt, um unspezifische Bindung der Sonde und schließlich dehydriert zu reduzieren), bevor die Hybridisierung.

In das Protokoll hier präsentierten die gesamte Verfahren des Nachweises in normalen Labors durchgeführt werden kann, entwickelt sich das Signal in der Regel innerhalb von 1-3 Tagen und das Verhältnis zwischen Signal über Hintergrund können kontinuierlich überwacht werden. Die DIG-markierten Sonden in der Regel geben ein deutlicheres Signal als zu radioaktiv markierten Sonden sind im Vergleich viel stabiler und kann in nachfolgenden Experimenten verwendet werden. Auf der anderen Seite ist die Empfindlichkeit gegenüber radioaktiven Sonden ¹⁷ reduziert. In-situ-Hybridisierung detektiert Ausdruck mit einer markierten Sonde spezifisch für eine bestimmte mRNA. Radio-Kennzeichnung ist eine robuste und empfindliche Kennzeichnung Methode, aber es erfordert Umgang mit Radioaktivität und es dauert mehrere Wochen, bevor die Ergebnisse nachgewiesen werden können. Antigen-markierten Sonden auf der anderen Seite, sind stabiler, weniger gefährliche und erfordern Exposition gegenüber den Nachweis Medium für ein paar Tage nur ^17. So sind Antigen-Kennzeichnung Methoden derzeit dominieren. Der wichtigste Schritt unabhängig vom Protokoll wird die Sonde Design. Es ist darauf zu machen, dass die Sonde hat eine hohe Spezifität und ist mit hochwertigen UTPs gekennzeichnet werden. Manchmal ist die Hybridisierung Temperatur und / oder Reaktion Länge haben, um für spezifische Sonden eingestellt werden.

Unsere modifizierte Protokoll auf DIG-markierten Sonden basieren, Lokalisierung von mRNA-Expression gleichzeitig erleichtern Arten von A. thaliana zu P. abies sollte und mit geringfügigen Anpassungen nutzbar sein in anderen Pflanzenarten. Das Protokoll hat neben männlichen Zapfen, auch auf unterschiedlichen Stufen der vegetativen Triebe und in beiden zygotischen und somatische Embryonen aus P. getestet abies mit guten Ergebnissen (unveröffentlichte Ergebnisse;. Karlgren et al).

Materialien

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride		Sigma-Aldrich	A6404-200ml	minimum 98%
Acrylamide, linear		Ambion	9520
Anti-DIG-antibodies		Roche Applied Science
Blocking reagent		Roche Applied Science	11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A7030-50g	minimum 98%
Deionized formamide		Sigma-Aldrich
Denhardts solution		Sigma-Aldrich	D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate		Sigma-Aldrich
Dextran sulfate		Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)		Roche Applied Science	11175025910
Glutaraldehyde (25%)		Histolab products AB
Glycogen		Ambion	9510G
Histoclear II		Histolab products AB		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax		Histolab products AB		Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde		Sigma-Aldrich	P6148-500g
Paraplast plus		Sigma-Aldrich	P3683-1kg	Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase		Finnzymes
Probe-on Plus slides		Fischer Scientific	22-230-900
Proteinase K		Sigma-Aldrich	P2308-5mg
RNase A		Sigma-Aldrich	R5503-100mg
Tissue-clear		Sakura Finetek Europé BV		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine		Sigma-Aldrich	T1377-100ml	minimum 98%
Triton X-100		use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA		Sigma-Aldrich	83853-100mg
Tween-20		use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue		Promega Corp.