Non radioattivo In situ Protocollo di ibridazione applicabile per la Norvegia Abete e una serie di specie di piante

Riepilogo

Descriviamo un DIG modificato In situ Protocollo di ibridazione, che è veloce e applicabile su una vasta gamma di specie vegetali tra cui la Norvegia abete rosso. Con solo alcuni aggiustamenti, tra cui alterato RNasi trattamento e la concentrazione proteinasi K, il protocollo può essere utilizzato negli studi di diversi tessuti e specie.

Abstract

Le tecnologie high-throughput analisi di espressione oggi disponibili agli scienziati un overflow dei profili di espressione, ma la loro risoluzione in termini di espressione tessuto specifica è limitato a causa di problemi nella dissezione dei tessuti individuali. Dati di espressione deve essere confermata e integrata con i modelli di espressione utilizzando ad esempio di ibridazione in situ, una tecnica utilizzata per localizzare cellula specifica espressione di mRNA. Il metodo di ibridazione in situ è faticoso, richiede tempo e spesso richiede l'ottimizzazione estese a seconda della specie e dei tessuti. Negli esperimenti in situ sono relativamente più difficili da eseguire in specie legnose come la Norvegia conifere abete rosso (Picea abies). Qui vi presentiamo una DIG modificato nel protocollo ibridazione in situ, che è veloce e applicabile su una vasta gamma di specie vegetali tra cui P. abies. Con solo alcuni aggiustamenti, tra cui alterato RNasi trattamento e la concentrazione proteinasi K, si potrebbe utilizzare il protocollo per lo studio dell'espressione tessuto specifica di geni omologhi in organi riproduttivi maschili di una gimnosperme e due specie di angiosperme; P. abies, Arabidopsis thaliana e Brassica napus. Il protocollo ha lavorato altrettanto bene per la specie e geni studiati. AtAP3 e BnAP3 sono state osservate negli organi spirale secondo e terzo floreali in A. thaliana e B. napus e DAL13 in microsporophylls di coni maschio da P. abies. Per P. abies la concentrazione proteinasi K, usato per permeablize i tessuti, doveva essere aumentata a 3 g / ml invece di 1 g / ml, forse a causa di tessuti più compatti e più elevati livelli di composti fenolici e polisaccaridi. Per tutte le specie il trattamento RNAsi è stato rimosso a causa della ridotta potenza del segnale senza un corrispondente aumento della specificità. Confrontando pattern di espressione di specifici tessuti omologhi geni di entrambi piante da fiore e un albero di conifere dimostriamo che il DIG in situ protocollo presentato qui, con solo piccoli aggiustamenti, può essere applicato a una vasta gamma di specie vegetali. Quindi, il protocollo evita sia l'ottimizzazione vasta specie specifico e l'uso di sonde laborioso radioattivo a favore di sonde DIG etichettati. Abbiamo scelto di illustrare i passaggi tecnicamente impegnativo del protocollo nel nostro film.

Anna Karlgren e Jenny Carlsson contribuito in maniera uguale a questo studio.

Autori corrispondenti: Anna Karlgren a Anna.Karlgren @ ebc.uu.se e Jens Sundström F. a Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Protocollo

Questo non radioattivo mRNA nel protocollo ibridazione in situ è ottimizzato per la Norvegia tessuti abete rosso e descritti in dettaglio. Si basa su un Arabidopsis / colza nel protocollo di ibridazione in situ ottimizzato nei nostri gruppi, che a sua volta è basato su protocolli dal Meyerowitz e laboratori irlandese e ottimizzato da Vivian irlandese, Cindy Lincoln e Jeff Long, tra gli altri ^1-4.

PROCEDURA

1. Fissazione e di inclusione

Per fornire tessuti ritenzione RNA bisogno di essere fissato e incorporato in cera prima di un esperimento in situ viene eseguita. La fissazione e di inclusione è un passo fondamentale in quanto materiali poco fisso potrebbe dare un segnale basso o non rilevabili, anche se l'mRNA è molto abbondante. I tessuti sono disidratati, cancellate e incorporati in cera a cambiamenti graduali per evitare danni ai tessuti. Per evitare ulteriori ritiro e rigonfiamento delle cellule si aggiunge 0,85% NaCl ai passaggi in etanolo, innanzitutto la disidratazione dei tessuti abete rosso della Norvegia. E 'possibile lasciare il NaCl nel etanolo (ad esempio, è lasciato in Arabidopsis / colza protocollo). Il passo disidratazione durante embedding può essere eseguita su ghiaccio per mantenere l'attività RNAsi al minimo o a +4 ° C. In questo protocollo la soluzione al 4% paraformaldeide fix contiene 0,25% glutaraldeide, che dovrebbe dare una migliore ritenzione di RNA che, anche se alcuni sostengono che probabilmente non fa differenza (ad esempio, è lasciato in Arabidopsis / colza protocollo). Molto probabilmente ogni fissaggio standard e protocolli embedding può essere utilizzato. Come si è visto sotto l'embedding abete nordico differisce leggermente da Arabidopsis / colza protocollo.

1,1 Giorno 1 Raccolta di materiale vegetale e la fissazione paraformaldeide

1. Raccogliere il materiale vegetale di interesse e di sezionarlo, se necessario. Mantenere i tessuti in ghiaccio e metterli in ghiacciata soluzione fix (vedi le ricette di seguito) direttamente o nel più breve tempo possibile. NB! Tenere su ghiaccio per tutto il tempo!
2. Applicare il vuoto per i campioni fino a quando la paraformaldeide inizia a bollire. Tenere il vuoto per un massimo di tre ore (ad esempio 2 x 15 min per Arabidopsis e tessuti floreali di colza o un'ora per la Norvegia coni abete maschio) e rilasciare il vuoto lentamente. I tessuti sono tenuti ad affondare dopo l'infiltrazione vuoto del fissativo, ma per alcuni tessuti contenenti un sacco di aria non è possibile (fiori Arabidopsis ad esempio). Un pezzo di garza può essere usata per rendere i tessuti soggiorno in fissativo.
3. Sostituire il fissativo e incubare a +4 ° C per una notte (~ 12-16 ore) scuotendo delicatamente.

Opzione 1

NB! Abete nordico versione incasso sotto (passi 4-8). Assicurarsi che i tubi scintillazione o fiale di vetro sono utilizzati, almeno al punto 5.

1,2 Giorno 2 disidratazione NB! Abete nordico embedding versione.

4. 0,85% di NaCl	30 min	con ghiaccio
   50% EtOH + 0,85% di NaCl	90 min	con ghiaccio
   70% EtOH + 0,85% di NaCl	90 min	con ghiaccio

   Pausa! E 'possibile fermarsi qui e conservare i tessuti nel 70% EtOH + 0,85% di NaCl a +4 ° C per diversi mesi.

   85% EtOH + 0,85% di NaCl	90 min	+4 ° C
   95% EtOH (+ eosina)	90 min	+4 ° C

   NB! Eosina è aggiunto alla rosa macchia i tessuti rendendoli più facili da individuare durante l'inclusione e il sezionamento ma può essere escluso.

   100% EtOH (+ eosina)	90 min	+4 ° C
   100% EtOH (+ eosina)	durante la notte	+4 ° C

1,3 Giorno 3 Disidratazione e inclusione NB! Abete nordico embedding versione.

1. 100% EtOH (+ eosina)	2 ore	temperatura ambiente
   50% EtOH + 50% Histoclear II	1 h	temperatura ambiente
   100% Histoclear II	1 h	temperatura ambiente
   100% Histoclear II	1 h	temperatura ambiente
   50% Histoclear II + 50% Histowax	durante la notte	40-50 ° C

   NB! Nell'ultimo passaggio la concentrazione di Histowax non è cruciale, basterà versare in alcuni chip cera.

1,4 Giorno 4 Incorporare NB! Abete nordico embedding versione.

6. 100% fuso Histowax

   +60 ° C

   (Modifica mattina e sera)

1,5 Giorno 5 Incorporare NB! Abete nordico embedding versione.

7. 100% fuso Histowax

   +60 ° C

   (Modifica mattina e sera)

1,6 Giorno 6 Incorporare NB! Abete nordico embedding versione.

8. 100% fuso Histowax

   +60 ° C

   (Modifica mattina e sera)

   NB! E 'ok se la cera a volte viene cambiata una volta al giorno, ma poi ci vogliono due giorni per completare una giornata di cambiamenti. Il cambiamento cera può anche continuare per due giorni in più senza problemi. Questo è raccomandato per campioni di grandi dimensioni in quanto aiuta l'infiltrazione della cera al centro di questi tessuti.

Opzione 2

NB! Arabidopsis / colza versione embedding di sotto (passi 4-8).

1,2 Giorno 2 disidratazione NB! Arabidopsis / embedding versione di colza.

4. NB! Tutti i passaggi a +4 ° C e scuotendo delicatamente, se non altro si afferma.

   1x PBS	30 min
   1x PBS	30 min
   30% EtOH	60 min
   40% EtOH	60 min
   50% EtOH	60 min
   60% EtOH	60 min
   70% EtOH	60 min

   Pausa! E 'possibile fermarsi qui e conservare i tessuti nel 70% EtOH a +4 ° C per diversi mesi.

   85% EtOH	60 min
   95% EtOH (+ eosina)	durante la notte

   NB! Eosina è aggiunto alla rosa macchia i tessuti rendendoli più facili da individuare durante l'inclusione e il sezionamento ma può essere escluso.

1,3 Giorno 3 disidratazione e embeddING NB! Arabidopsis / embedding versione di colza.

5. NB! Tutte le fasi a temperatura ambiente e scuotendo delicatamente, se non altro si afferma.

   100% EtOH (+ eosina)	30 min
   100% EtOH (+ eosina)	30 min
   100% EtOH (+ eosina)	60 min
   100% EtOH (+ eosina)	60 min

   NB! Trasferire il tessuto a scintillazione fiale o altro (vetro) flaconcini.

   EtOH 75% + 25% Histoclear II	30 min
   50% EtOH + 50% Histoclear II	30 min
   25% EtOH + 75% Histoclear II	30 min
   100% Histoclear II	60 min
   100% Histoclear II	60 min
   100% Histoclear II + ¼ volumi di chip Histowax	durante la notte (nessun scuotimento)

   NB! Nell'ultimo passaggio la concentrazione di Histowax non è cruciale, basterà versare in alcuni chip cera.

1,4 Giorno 4 Incorporare NB! Arabidopsis / embedding versione di colza.

6. Posizionare le fiale con tessuti a +42 ° C fino a quando il chip di cera sciogliersi completamente. Successivamente aggiungere il volume ¼ di chip cera e lasciarli sciogliere completamente. Spostare a +60 ° C e lasciare le provette per diverse ore. Infine, sostituire cera / Histoclear II con la cera fusa di fresco durante la notte e incubare a +60 ° C.

1,5 Giorno 5 Incorporare NB! Arabidopsis / embedding versione di colza.

7. 100% fuso Histowax

   +60 ° C

   (Modifica mattina e sera)

1,6 Giorno 6 Incorporare NB! Arabidopsis / embedding versione di colza.

8. 100% fuso Histowax

   +60 ° C

   (Modifica mattina e sera)

   NB! In Arabidopsis / colza protocollo (rispetto al protocollo di abete rosso Norvegia) c'è un 7 Incorporare giorno allo stesso modo come ai tempi di 5-6, ovvero Histowax 100% fuso a +60 ° C e il cambiamento mattina e sera
   NB! E 'ok se la cera a volte viene cambiata una volta al giorno, ma poi ci vogliono due giorni per completare una giornata di cambiamenti. Il cambiamento cera può anche continuare per due giorni in più senza problemi. Questo è raccomandato per campioni di grandi dimensioni in quanto aiuta l'infiltrazione della cera al centro di questi tessuti.

1,7 Giorno 7 Embedding (Giorno 8 in Arabidopsis / colza protocollo) (Film! dettagli tecnici sono riportati nel film)

9. Preriscaldare capsule di Petri e / o stampi a +60 ° C. Accendere un piatto caldo (+60 ° C) e fare in modo Histowax fuso è disponibile.
10. Versare i tessuti e Histowax fuso in una scatola Petri (o uno stampo) posti sulla piastra riscaldante. Aggiungere più Histowax in modo che i tessuti sono coperti. Calore un paio di pinzette e distribuire i tessuti in modo uniforme nel piatto. Riempire la capsula di Petri (o muffa). Se la cera si indurisce prima i tessuti sono nella posizione giusta, riscaldare di nuovo o rimuovere la cera indurita con la coppia riscaldata di pinzette.
11. Lasciate che il blocco di cera indurire a temperatura ambiente prima di metterlo a +4 ° C. E 'meglio fare blocchi di cera diverse anziché incorporare i tessuti troppo stretto in quanto il blocco di cera potrebbe rompere quando i pezzi sono tagliati fuori durante il sezionamento.
    Pausa! Conservare a +4 ° C. I tessuti sono stabili per anni.
    NB! RNasi lavoro libero da questo punto in poi. Usare i guanti, DEPC-trattare MilliQ-acqua, tamponi, cristalleria ecc, buffer autoclave e cuocere vetro ecc al momento opportuno.

2. Sezionamento (Film! dettagli tecnici sono riportati nel film)

12. Girare su due piatti caldi (+60 ° C e +42 ° C) e assicurarsi Histowax fuso è disponibile.
13. Scaldare una bisturi e tagliare con precisione un blocco di cera di tessuto dalla capsula di Petri (potrebbe rompersi se uno è troppo violento), o rimuoverlo dallo stampo. Quando un blocco di cera singolo è stato separato, la forma del pezzo in la giusta dimensione e la forma per facilitare le operazioni di affettamento del microtomo.
14. Il pezzo di cera dovrebbe avere un extra cera "tacco" sotto il tessuto in modo che possa essere collegato al blocco titolare. Riscaldare il titolare blocco e il tallone sulla piastra riscaldante (+60 ° C) e fonderli insieme. Potrebbe essere necessario mettere una goccia di Histowax II di rendere la fusione stabile. Lasciar indurire a +4 ° C.
15. Tagliare il blocco di cera nelle sezioni 6-8 micron di spessore collegati in un lungo nastro utilizzando un microtomo.
    NB! Questo sarà più facile se il blocco di cera a freddo, conservare cioè il blocco di cera a +4 ° C e portarlo dal frigorifero quando si avvia il taglio. Può anche essere utile per mantenere il freddo coltello.
16. Studio i nastri delle sezioni in una lente di ingrandimento e contrassegnare quelli da utilizzare.
17. Mettere RNasi-free MilliQ-acqua nelle diapositive (Probe-On Plus da Fisher biotecnologie, che sono pre-puliti e carica). Tagliato il nastro in piccoli pezzi e metterli ("back" o lato "lucido" verso il basso) nelle diapositive. Le slide con nastri dovrebbero essere immessi sul piatto 42 A ° C. Il nastro dovrebbe appiattirsi (questo è importante!) In acqua. Lasciate le sezioni sedersi per qualche minuto e poi usare una Kimwipe / tessuto carta per drenare l'acqua.
18. Lasciare le diapositive sul piatto per 1-2 ore.
19. Incubare i vetrini a +42 ° C per una notte in modo che i tessuti aderire alle diapositive.
    Pausa! Si consiglia di utilizzare le sezioni il prima possibile, ma possono essere conservati a secco in scatole chiuse con essiccante fino a parecchi giorni a +4 ° C.

3. LA PREPARAZIONE DELLE SONDE

Ibridazione in situ rileva espressione utilizzando una sonda specifica etichetta per un determinato mRNA. La sonda, che è più spesso un pezzo di RNA complementari, possono essere contrassegnate con digossigenina, DIG. DIG è una piccola molecola, che può essere collegato a uridina e quindi incorporato nella sonda RNA e poi rilevati utilizzando DIG-anticorpi specifici.

La progettazione e realizzazione della sonda è la fase più critica in un RNA in esperimento di ibridazione in situ. Si deve prestare attenzione per assicurarsi che la sonda ha una alta specificità ed è etichettata con UTPs di alta qualità. A volte l'ibridazione di temperatura e / o la lunghezza di reazione devono essere adattati per sonde specifiche. Come sempre, occorre prestare attenzione per evitare la contaminazione RNAsi.

Prima di etichettatura, isolare un modello secondo i protocolli standard, ad esempio l'uso dei cloni cDNA, PCR-frammenti, e linearizzare il modello. Frammenti di senso e antisenso sono isolati e amplificati dal modello usando primer gene specifico. Per i frammenti di PCR amplificato non utilizzare gli enzimi che producono 3 'strapiombi. Per tutti i frammenti uno (o SP6 o T3) T7 sbalzo viene aggiunto utilizzando primers portando il T7-sequenza o utilizzando un vettore con un T7-promotore.

Il senso (mRNA o (- filamento)) della sonda hanno la stessa sequenza come l'mRNA bersaglio e non di ibridare l'mRNA bersaglio, mentre il antisenso (anti-mRNA o (+) filamento) sonda la sequenza complementare e quindi di ibridare l'obiettivo di dare il segnale di interesse. La sonda senso viene utilizzato come controllo negativo e nessun segnale si ottengono se l'esperimento ha funzionato correttamente. Un controllo positivo è necessaria anche, ad esempio, una sonda che rileva una casa-keeping gene. La maggior parte dei vetrini devono essere ibridato con sonde antisenso, mentre solo alcune diapositive devono essere ibridato alle sonde di controllo diverso.

3,1 etichettatura sonda utilizzando Nella trascrizione in vitro

Reagenti dalla DIG RNA Kit per l'etichettatura (SP6/T7; 11175025910, Roche Applied Science, Mannheim, Germania) o simili vengono utilizzati per l'etichettatura delle sonde. La reazione di 20 microlitri qui descritto dovrebbe produrre circa 10 mg di DIG marcato RNA.

20. Fai una trascrizione in vitro per incorporare nucleotidi etichettati. Aggiungere i seguenti reagenti in una provetta (tenere su ghiaccio):

    Ingrediente	volume / quantità
    10 x NTP etichettatura miscela	2 microlitri
    10 x Trascrizione tampone	2 microlitri
    Protector RNasi inibitore	1 ml (20U)
    T7 RNA polimerasi (SP6 o T3)	2 microlitri
    Modello di DNA (500-1000 ng)	x microlitri
    RNasi-free MilliQ-acqua	y microlitri, ad un volume finale di 18 microlitri

21. Mescolate il composto etichettatura NTP, buffer di trascrizione, RNasi inibitore (NB! se la sonda è breve, per esempio <500bp, si può aumentare la concentrazione di inibitore della RNasi 40U), la polimerasi, DNA stampo e acqua e poi una breve centrifuga.
22. Incubare la miscela di reazione a +37 ° C per 2 ore (NB! se la sonda è breve, per esempio <500bp, aumentare il tempo di reazione a 4-6 ore).
23. Aggiungere 2 microlitri DNasi I e incubare a +37 ° C per 15 minuti.
24. Bloccare la reazione aggiungendo 2 microlitri 0,2 M EDTA (pH 8,0). Controllare il prodotto su gel.
25. Precipitare la sonda con l'aggiunta di 2,5 ml di 4 M LiCl e 75 ml di etanolo> 99,5%. Mescolare bene e incubare a -20 ° C per una notte (NB! Non utilizzare tRNA come vettore. Invece utilizzare il glicogeno o acrilamide secondo i produttori).
26. Centrifuga (13 000 rpm) per 30 minuti a +4 ° C e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet (almeno 10 min 13 000 rpm) due volte in etanolo al 70% (~ 150-300 microlitri).
27. Rimuovere il supernatante e lasciare asciugare il pellet. Risospendere la sonda in 30 microlitri RNase-free acqua per 1-2 ore sul ghiaccio.
    Pausa! La sonda può essere conservato a -20 ° C per più di un anno.
    NB! Salva 0,5 microlitri campioni dal punto 21 (prima della trascrizione in vitro), passo 23 (prima del trattamento DNasi), passo 24 (dopo il trattamento DNasi, ma prima la precipitazione) e 1 campione microlitri dal punto 27 (quando la sonda è stata risospeso). Eseguire gli esempi su un gel nondenaturating 1% TBE. Se la reazione DNasi ha funzionato in modo corretto il modello-band scompare. La trascrizione in vitro dovrebbe generare una band di spessore RNA di circa il formato corretto. Se vedete fasce multiple, denaturate i campioni a +80 ° C per 5 minuti seguita da raffreddamento in ghiaccio prima di caricarla. Se il recupero dal punto 27 sembra male potrebbe essere così perché la sonda non è stato risospeso bene. Incubare l'RNA a +55 ° C 50-10 minuti per arrivare in soluzione.

3,2 Idrolisi di sonde lungo

NB! Se la sonda è più grande di 150 bp dovrebbe essere ridotta a 50-150 bp per dare un segnale alto, a causa di una migliore penetrazione. La sonda può essere degradata chimicamente in un buffer di carbonato (pH 10.2). Se la sonda è di dimensioni corrette saltare la fase di idrolisi, ma ricordatevi di aggiungere un formammide volume, cioè 30 microlitri, alla sonda.

28. Preparare 0,2 M di sodio bicarbonato (NaHCO ₃₎ e 0,2 M di carbonato di sodio (Na ₂ CO _3). Entrambi devono essere freschi.
29. Prova i due tamponi mescolando 5 ml H ₂ O, 2 ml 0,2 M NaHCO ₃ e ₃ ml di 0,2 M Na ₂ CO _3. Il pH dovrebbe essere ~ 10.2.
30. Calcolare il tempo di incubazione:

    Tempo di incubazione (in minuti) = (L 0-L f) / (K * 0 * L L f)

    L 0 = lunghezza di partenza della sonda in kb

    L f = lunghezza finale della sonda in kb = esempio 0,100 kb

    K = tasso costante di idrolisi = 0.11 kb-1min-1

31. Idrolizzare metà della tua sonda, risparmio il resto per dopo. Diluire sonda a 50 microlitri con acqua RNasi libero e aggiungere 20 l 0,2 M NaHCO ₃ (aggiungere prima) e 30 microlitri 0,2 M Na ₂ CO _3. Miscelare e incubare a +60 ° C per il tempo di incubazione calcolato.
32. Bloccare la reazione aggiungendo 10 ml di 1 M NaOAc pH 4.7.
33. Precipitare la sonda con l'aggiunta di 10 L 4 M LiCl ₂ e 300 ul ethanol (glicogeno Usa NB! o acrilamide come supporto, se necessario). Incubare a -20 ° C durante la notte.
34. Centrifuga (13 000 rpm) per 30 minuti a +4 ° C e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet due volte in etanolo al 70% (~ 300 ul). Centrifuga (13 000 giri al minuto) di almeno 10 minuti in ogni lavaggio a +4 ° C.
35. Rimuovere il supernatante e lasciare asciugare il pellet. Risospendere la sonda in 30 microlitri RNase-free MilliQ-acqua. Aggiungere una formammide volume, cioè 30 microlitri, alla sonda.
    Pausa! La sonda può essere conservato a -20 ° C per più di un anno.
    NB! Take 2 microlitri della sonda non idrolizzato e 2 ml di sonda idrolizzato (prima della formammide viene aggiunto) e controllare su un gel nondenaturating 1% TBE. Ci dovrebbe essere una differenza di dimensioni tra i due campioni. Le sonde potrebbero dover essere denaturato a +80 ° C per 5 minuti seguita da raffreddamento in ghiaccio prima di caricarla.

4. Ibridazione in situ (Film! dettagli tecnici sono riportati nel film)

Assicurarsi che tutte le soluzioni siano RNasi gratis! Non è necessario DEPC-curare tutto, ma usare almeno autoclave MilliQ-acqua. Assicurarsi che tutti i vetri sono riscaldati a +200 ° C per una notte o almeno per 5 ore. Trattare i contenitori di plastica e mescolare bar con 0,1 M di NaOH con agitazione durante la notte. Sciacquare i contenitori di plastica più volte con autoclave MilliQ-acqua (~ 500 ml / contenitore). E 'fondamentale lavare i contenitori con attenzione per evitare le tracce di NaOH che potrebbero disturbare l'ibridazione. DEPC-trattare tutte le soluzioni di riserva, ad eccezione del Tris-buffer. Controllare tutti ecc soluzioni prima di iniziare l'esperimento per assicurare che tutto sia disponibile. Fino a passo 61 (ad eccezione di punti 51-52) teniamo le diapositive in un rack, che può essere facilmente spostato tra i contenitori.

4.1 Nel pretrattamento sezione situ

36. Sparaffinare / disidratano sezioni:

    2x 10 min Histoclear II (utilizzare contenitori di vetro)

    2x 1-2 minuti al 100% EtOH

    1-2 minuti al 95% EtOH

    1-2 minuti EtOH 90%

    1-2 minuti EtOH 80%

    1-2 minuti EtOH 60%

    1-2 minuti EtOH 30%

    1-2 min H 2 O

37. Lavare i vetrini per 15-20 minuti in 2x SSC a temperatura ambiente (NB! Preparare la paraformaldeide utilizzato nel passaggio 42 durante il tempo di incubazione).
38. Trattare i tessuti per 30 minuti con proteinasi K a +37 ° C con agitazione (ad esempio 1 mg / ml per Arabidopsis / colza e 3 mg / ml per la Norvegia abete rosso). Mescolare e preriscaldare a +37 ° C 100 mM Tris pH 8 e 50 mM EDTA. Aggiungi proteinasi K immediatamente prima di trattare le diapositive. NB! Il trattamento proteinasi K deve essere ottimizzato a seconda dei tessuti, specie vegetali ed età. (NB! Preparare la trietanolammina utilizzato nel passaggio 45 durante il tempo di incubazione).
39. Trattare le diapositive per 2 minuti con 2mg/ml glicina in 1x PBS a temperatura ambiente. (NB! Mescolare la glicina con PBS il giorno prima di utilizzarlo per garantire che la glicina è adeguatamente sciolto).
40. Lavare i vetrini per 2 minuti in 1x PBS a temperatura ambiente.
41. Lavare i vetrini per 2 minuti in 1x PBS a temperatura ambiente.
42. Incubare i vetrini per 10 minuti con il 4% (w / v) paraformaldeide (fatta fresca) in 1x PBS pH 7 a temperatura ambiente. Usare il contenitore di vetro.
43. Lavare i vetrini per 5 minuti in 1x PBS a temperatura ambiente.
44. Lavare i vetrini per 5 minuti in 1x PBS a temperatura ambiente. (Dispensare anidride acetica nella soluzione al punto 45).
45. Incubare i vetrini per 10 minuti a 0,1 M trietanolammina (fatta fresca, pH 8) e anidride acetica a temperatura ambiente.
46. Lavare i vetrini per 5 minuti in 1x PBS a temperatura ambiente.
47. Lavare i vetrini per 5 minuti in 1x PBS a temperatura ambiente.
48. Disidratano:

    30 sec 30% EtOH

    30 sec 60% EtOH

    30 sec 80% EtOH

    30 sec 90% EtOH

    30 sec 95% EtOH

    2x 30 sec 100% EtOH

    Pausa! E 'possibile fermarsi qui e memorizzare le diapositive in un contenitore con una piccola quantità di EtOH in fondo a +4 ° C per diverse ore.

4.2 In ibridazione in situ (Film! dettagli tecnici sono riportati nel film)

Decidere che scorre da utilizzare con le quali sonde, non dimenticate di utilizzare sia il senso e le sonde antisenso, nonché un controllo positivo. (NB! ProbeOn Inoltre diapositive da Biotecnologie Fisher hanno una glassa bianca che permette loro di essere racchiuso in coppie durante l'ibridazione / rilevamento fasi del protocollo.) La sonda stessa cosa con la stessa concentrazione deve essere utilizzato su un paio diapositiva specifica. Determinare la quantità di soluzione di ibridazione per fare in base al numero totale di coppie di diapositive. Preriscaldare il solfato di destrano a +60 ° C. La soluzione di ibridazione è molto viscoso dal solfato di destrano. Mettere la soluzione di ibridazione a +60 ° C e sarà più facile da gestire. Far asciugare i vetrini su carta assorbente pulito o Kimwipe / tessuto documenti prima che la sonda è applicata. Le diapositive devono essere completamente asciutto. Per ogni coppia di diapositive aggiungere la sonda. E 'importante verificare le concentrazioni di sonda diversi (ad esempio 0,5, 2 e 4 mL) per trovare la concentrazione ottimale prima che l'esperimento reale è preformato.

Ibridazione soluzione	5 coppie di scorrimento	10 coppie di scorrimento	15 coppie di scorrimento	20 coppie di scorrimento
10x in sali situ	100 ul	200 l	300 ul	400 microlitri
formammide deionizzata	400 microlitri	800 microlitri	1200 microlitri	1600 microlitri
50% destrano solfato (+60 ° C)	200 l	400 microlitri	600 microlitri	800 microlitri
Soluzione di 50x Denhardt	20 l	40 microlitri	60 microlitri	80 microlitri
tRNA (100mg/ml)	10 microlitri	20 l	30 microlitri	40 microlitri
H 2 O (DEPC trattati)	70 microlitri	140 microlitri	210 microlitri	280 microlitri
Volume totale	800 microlitri	1600 microlitri	2400 microlitri	3200 microlitri

49. Diluire la sonda in RNase-free MilliQ-acqua ad un volume finale di 20 l. Aggiungi un volume (cioè 20 l) formammide alla sonda dando un volume totale di 40 microlitri. Calore la sonda a 80 ° C per 2 minuti. Mettere in ghiaccio per 2 minuti. Spin down. Tenere la sonda sul ghiaccio. Questa sonda miscela è abbastanza per un paio di diapositive. Moltiplicare secondo il numero totale di coppie di scorrimento per la sonda specifica.
50. Aggiungere 160 ml di soluzione di ibridazione per ogni coppia di diapositive dando un volume finale di 200 l (cioè 160 ul di soluzione di ibridazione sonda + 40 mL) per ogni coppia di diapositive. Mescolare senza generare bolle.
51. Applicare la sonda a una diapositiva e lentamente fondere le due diapositive insieme. (Sandwich NB! può essere fatto solo con sonda-On diapositive Plus o diapositive equivalente. Se i vetrini senza glassa sono utilizzati uso coprioggetto invece di sandwich.)
52. Elevare diapositive sopra tovaglioli di carta bagnati in un contenitore di plastica (che sigilla ermeticamente) usando pipette di plastica. Ibridare 50-55 ° C durante la notte (12-16 ore).

4.3 In ibridazione in situ messaggio (Film! dettagli tecnici sono riportati nel film)

53. Preparare il messaggio ibridazione in situ dal riscaldamento ~ 2 L 0.2x SSC (+55 ° C) e ~ 2 L 1x NTE (+37 ° C) durante la notte. Più SSC e NTE sono necessari se il trattamento RNasi (57-59 passi sotto) viene eseguita.
54. Immergere ogni coppia scivolare in caldo 0.2x SSC (vedi sopra) per separare e sciacquarli. Poi metterli in un rack in un contenitorecon caldi 0.2x SSC.
55. Lavare i vetrini per 60 minuti a 0.2x SSC con leggera agitazione a +55 ° C. (NB! Preparare la soluzione blocco Boehringer utilizzato nel passaggio 63 durante il tempo di incubazione.)
56. Ripetere il lavaggio a 0.2x SSC per 60 min. (NB! Se il passo RNasi viene eseguita lasciare che il disgelo RNasi durante questa incubazione, se non continuare con il passaggio 60.)
57. Opzionale: Lavare i vetrini per 5 min a caldo 1x NTE (vedi sopra) a +37 ° C con agitazione.
58. Opzionale: ripetere il lavaggio a caldo NTE 1x per 5 min a +37 ° C con agtation gentile.
59. Opzionale: Trattare le diapositive con RNasi (20 mg / ml RNasi A in 1x NTE) per 30 minuti a +37 ° C con agitazione. Quindi lavare per 5 min in NTE 1x a +37 ° C con agitazione. Ripetere il lavaggio 1x NTE.
60. Lavare i vetrini per 60 minuti a 0.2x SSC a +55 ° C con agitazione. (NB! Preparare la soluzione di blocchi utilizzati in fasi 64-65 e 67 durante il tempo di incubazione.)
61. Lavare i vetrini per 5 min in 1x PBS a temperatura ambiente (Pause! È possibile archiviare le diapositive in 1XPBS a +4 ° C per una notte, se si desidera continuare il giorno successivo.)
62. Porre i vetrini sul fondo di un grande contenitore di plastica con il lato alto del campione.
63. Incubare i vetrini con 1 blocco% Boehringer in 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl per 45 minuti a temperatura ambiente e scuotendo con cautela. Basta coprire i vetrini con la soluzione di saturazione. Eliminare la soluzione di saturazione, mentre le diapositive sono ancora nel contenitore di plastica o posto le diapositive in un nuovo contenitore. Quando si versa fuori la soluzione le diapositive di solito aderire al contenitore di plastica, ma fare in modo che essi non cadere fuori dal contenitore.
64. Sostituire la soluzione di blocco Boehringer con 1,0% BSA in 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% Triton X-100. Eseguire l'incubazione come al punto 63.
65. Diluire gli anti-dig anticorpi (1:1250, vale a dire 8 anticorpi microlitri in 10 ml BSA) nel BSA / Tris / NaCl / Triton soluzione da 64 passo. Fai una pozza di soluzione di anticorpi in un piatto di plastica pesa. Sandwich diapositive insieme per permettere alle forze capillari per tirare su la soluzione. Scolare su Kimwipe / tessuto carta e ripetere, cercare di evitare bolle.
66. Elevare diapositive sopra gli asciugamani di carta bagnati in un contenitore di plastica e lasciare le diapositive di sedersi a temperatura ambiente per 2 ore.
67. Scolo scorre su Kimwipe / carta velina e separati. Mettere sul fondo del contenitore di plastica come al punto 63. Lavare 4x nel BSA / Tris / NaCl / Triton soluzione. 15 minuti ogni volta, in leggera agitazione a temperatura ambiente.
68. 10 min 100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl _2. Mettere sul fondo del contenitore di plastica come al punto 63.
69. Dip diapositiva Tris pH 9.5/NaCl/MgCl ₂ soluzione per garantire che tutti di detersivo è lavato via.
70. Fare panini e redige occidentale soluzione di blu, come in 65. Ripetere una volta.
71. Collocare i vetrini in un contenitore di plastica sopra gli asciugamani di carta bagnati nel buio più totale (avvolgerlo in carta stagnola) per 1-5 giorni a temperatura ambiente. Controllo dopo ore 6, 12 e 24 poi una volta al giorno.
72. Scivoli di scarico, sciacquare in 1xTE per fermare la reazione. Indossare scivola coperchio prima le diapositive vengono esaminati in microscopio. Le slide possono essere salvati in 1x TE per diversi mesi, ma scattare foto il più presto possibile.

RICETTE / SOLUZIONI STOCK

NB! Usa RNasi-free MilliQ-acqua il più possibile, ad esempio DEPC-trattare MilliQ-acqua (0,1% Aggiungi DEPC. Lascia Autoclave durante la notte. (20 minuti a 15 psi, ovvero 1,05 kg / cm ^2, il ciclo di liquido) o utilizzate in occasione almeno autoclave MilliQ-acqua. Nella preparazione tamponi e soluzioni madri è possibile anche per sciogliere RNasi-free sali ecc DEPC trattati con acqua, invece di DEPC-trattamento dei tamponi e soluzioni stock se stessi. Se non si DEPC-trattamento dell'acqua , tamponi e stock-soluzioni, almeno sterilizzare in autoclave o filtrarli.
Pausa! Buffer stock-Store e soluzioni a temperatura ambiente, se non altro si afferma.
NB! Potete trovare molti dei buffer e suggerimenti su come fare in Clonazione Molecolare (Sambrook, J., e DW Russell. 2001. Clonazione molecolare Un manuale di laboratorio. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA).

Anidride acetica a 0.1M trietanolammina (pH 8, volume: 800 ml).

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
Trietanolammina	10,4 ml	0,1 M trietanolammina
MilliQ-acqua	786,4 ml	volume finale 800 ml
HCl	3,2 ml	dando pH8.0
Anidride acetica	4,8 ml	0,6%

• Per rendere trietanolammina 0,1 M, pH 8.0, diluire 10,4 ml di trietanolammina a 786,4 ml di H ₂ O e aggiungere 3,2 ml di HCl per portare il pH a 8,0 (controllare con indicatore di pH).
• Elevate rack di diapositive con rotto pipette di plastica da 10 ml o simili in un contenitore di trietanolammina con un ancoretta in fondo.
• Dispensare 4,8 ml di anidride acetica in trietanolammina pochi minuti prima di mettere le diapositive in modo che sia ben mescolato.

NB! Rendere il 0.1M trietanolammina fresco e aggiungere l'anidride acetica poco prima di incubazione.
NB! Usare il contenitore di vetro. Trietanolammina tampone deve essere utilizzato a causa anidride acetica è instabile in acqua.

Agarosio (1%) in gel 1 x TBE (volume: 100 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
Agarosio	1 g	1%
1 x TBE	fino a 100 ml

Mescolare agarosio con 1 x TBE. Calore / bollire fino a quando il agarosio è sciolto. Cast un gel. Esegui il gel in un buffer di 1 x TBE.

Destrano solfato

Diluire 5 g di solfato di destrano a 10 ml con DEPC trattati MilliQ-acqua (cioè il 50% (w / v)) e si dissolvono in 60 ° C.
Pausa! Conservare a -20 ° C.

0,5 M EDTA pH8.0 (titriplex III, volume 500 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
EDTA (372,24 g / mol)	93,06 g	0,5 M EDTA
MilliQ-acqua	fino a 500 ml
NaOH	~ 10 g pellet	dando pH 8,0
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Sciogliere l'EDTA in acqua (succede a pH 8,0), e portato a un volume finale di 500 ml. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.

Soluzione di fix / fissativo (passi 1-3, 42) - 4% (w / v) paraformaldeide in 1x PBS, pH 7.0 (650 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
MilliQ-acqua	585 ml
10x PBS	65 ml	1x PBS
NaOH 10M	520 microlitri	pH dando ~ 11
Paraformaldeide	26 g	4%
HCl concentrato	449 microlitri	pH dando ~ 7

• D'impasto, PBS e NaOH e calore a 60-70 ° C (la temperatura e il pH elevato renderà più facile per dissolvere il paraformaldeide.
• Aggiungi (in cappa) paraformaldeide.
• Quando la soluzione ha eliminato metterlo in ghiaccio e aggiustare il pH a 7,0 con l'aggiunta di 449 microlitri HCl concentrato.

NB! Fai fresca.
NB! Nel glutaraldeide protocollo abete è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 0,25%, cioè 6,5 ml di glutaraldeide al 25% del volume totale di 650 ml o 10 ml di glutaraldeide al 25% del volume totale di 1000 ml (ricordarsi di ridurre l'acqua con un pari volume).
NB! Aggiungere poche gocce di Tween 20 e / o Triton X-100, dopo il pH è regolato, per ridurre la tensione superficiale per facilitare la fissazione nei passaggi 1-3. NON USARE IN STEP 42!
NB! Nel fissare tessuti vegetali un volume più piccolo (ad esempio 100 - 200 ml) di fissativo è generalmente necessario.

10x in sali situ (volume 100 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
5 M NaCl	60 ml	3M di NaCl
1 M Tris-Cl pH 8.0	10 ml	0,100 M Tris
1 M Na fosfato pH 6.8	10 ml	0,100 M Na fosfato
0,5 M EDTA	10 ml	0,050 M EDTA
MilliQ-acqua	fino a 100 ml

Mescolare un buffer fosfato Na con pH 6,8 (46,3 ml di 1 M Na ₂ HPO ₄ + 53,7 ml di 1 M NaH ₂ PO _4). Mix NaCl, Tris, Na tampone fosfato, EDTA e acqua. Autoclave. Pausa! Conservare a -20 ° C.

4 M LiCl ₂ (cloruro di litio, volume: 100 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
LiCl 2 (42,39 g / mol)	16,956 g	4M LiCl 2
MilliQ-acqua	fino a 100 ml
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Sciogliere LiCl ₂ in acqua, e portato a un volume finale di 100 ml. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.
Pausa! Conservare a +4 ° C.

1 M MgCl _{2 ·} H ₂ O (cloruro di magnesio, volume: 100 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol)	20,33 g	1 M MgCl 2 · H 2 O
MilliQ-acqua	fino a 100 ml
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Sciogliere MgCl ₂ in acqua, e portato a un volume finale di 100 ml. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.
NB! MgCl ₂ è molto igroscopico. Non conservare le bottiglie aperte per lunghi periodi di tempo.

5 M NaCl (cloruro di sodio, volume: 1 l)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
NaCl (58,44 g / mol)	292,2 g	5 M NaCl
MilliQ-acqua	fino a 1l
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Sciogliere NaCl in acqua, e portato a un volume finale di 1 l. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.

1 M NaOAc pH 4.7 (acetato di sodio, volume: 100 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
NaOAc (82,03 g / mol)	0,8203 g	1 M NaOAc
MilliQ-acqua	fino a 100 ml
L'acido acetico		dando pH 4,7
DEPC	0,1 ml	0,1% DEPC

Sciogliere NaOAc in acqua. Regolare il pH a 4,7. Adattarsi ad un volume finale di 100 ml. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.

0,2 M Na ₂ CO ₃ pH11.4 (carbonato di sodio, volume: 10 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
Na 2 CO 3	0,21198 g	0,2 M Na 2 CO 3 pH = 11,4
MilliQ-acqua	fino a 10 ml

Sciogliere Na ₂ CO ₃ in acqua; adattarsi ad un volume finale di 10 ml. Il pH dovrebbe essere 11.4.
NB! Fai fresca.

0,2 M pH8.2 NaHCO ₃ (bicarbonato di sodio, volume: 10 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
NaHCO 3	0,16802 g	0,2 M di NaHCO 3: pH = 8,2
MilliQ-acqua	fino a 10 ml

Sciogliere NaHCO ₃ in acqua; adattarsi ad un volume finale di 10 ml. Il pH dovrebbe essere 8.2.
NB! Fai fresca.

1 M Na ₂ HPO _{4 ·} 2 H ₂ O (volume 500 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol)	88,995 g	1 M Na 2 HPO 4
MilliQ-acqua	fino a 500 ml
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Sciogliere Na ₂ HPO ₄ in acqua, e portato a un volume finale di 500 ml. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.

1 M NaH ₂ PO _{4 ·} H ₂ O (volume 500 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol)	68,995 g	1 M NaH 2 PO 4
MilliQ-acqua	fino a 500 ml
DEPC	0,5 ml	0,1% DEPC

Sciogliere NaH ₂ PO ₄ in acqua, e portato a un volume finale di 500 ml. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.

NTE 5x (volume totale: 1l)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
5 M NaCl	500 ml	2,5 M di NaCl
1 M Tris-Cl pH 8	25 ml	50 mM Tris-Cl pH 8
0,5 M EDTA	5 ml	5 mM EDTA
MilliQ-acqua	470 ml	il volume finale di 1l

Mix NaCl, Tris, EDTA e acqua. Non DEPC-treat. Autoclave.

10 x PBS (PBS) pH 7,0 (volume totale: 1l)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
5 M NaCl	260 ml	1,3 M di NaCl
1 M Na 2 HPO 4	70 ml	70 mm Na 2 HPO 4
1 M NaH 2 PO 4	30 ml	30 mM NaH 2 PO 4
MilliQ-acqua	640 ml	il volume finale di 1l
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Mix di NaCl, Na ₂ HPO _4, NaH ₂ PO ₄ e acqua. Regolare il pH a pH 7,0 con HCl. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.

SSC 20x pH 7.0 (volume totale: 1l)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
NaCl (58,44 g / mol)	175,32 g	3 M NaCl
Na citrato (294,1 g / mol)	88,23 g	0,300 M Na citrato
MilliQ-acqua	fino a 1 l
HCl		dando pH 7,5
DEPC	1 ml	0,1% DEPC

Sciogliere NaCl e Na citrato in ~ 800 ml di acqua. Regolare il pH a pH 7,0 con HCl. Regolare il volume a 1 l con acqua. Aggiungere 0,1% DEPC. Lasciare tutta la notte. Autoclave.

5 x TBE (volume: 1l)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
Tris (121,14 g / mol)	54 g	~ 0,45 M Tris
Acido borico (61,83 g / mol)	27,5 g	~ 0,45 M acido borico
EDTA (372,24 g / mol)	3,7 g	~ 0,01 M EDTA
MilliQ-acqua	fino a 1l

Mix Tris, acido borico, EDTA e acqua. Il pH dovrebbe essere ~ 8.3. Diluire a 1 x TBE prima dell'uso.

10 x TE pH 8.0 (Tris EDTA, volume: 1l)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
1 M Tris-Cl, pH 8,0	100 ml	0,100 M Tris-Cl
0,5 M EDTA pH8.0	100 ml	0,050 M EDTA
MilliQ-acqua	fino a 1l

Mix Tris, EDTA e acqua. Non DEPC-treat. Autoclave.
NB! Tris non dovrebbe essere trattata con DEPC! Usa RNasi-free in polvere e diluire con DEPC-treated/RNase-free MilliQ-acqua.

1 M Tris-HCl pH 7,5-9,5 (volume 500 ml)

Ingrediente	volume / quantità	concentrazione finale
Tris (121,14 g / mol)	60,57 g	1 M Tris
MilliQ-acqua	fino a 500 ml
HCl		dando pH 7,5
HCl		dando pH 8,0
NaOH		dando pH 9,5

Sciogliere Tris in DEPC trattati con acqua. Regolare il pH desiderato. Adattarsi a un volume finale di 500 ml. Autoclave.
NB! Tris non dovrebbe essere trattata con DEPC! Usa RNasi-free in polvere e diluire con DEPC-treated/RNase-free MilliQ-acqua.
NB! Nella clonazione molecolare (vedi sopra) c'è una tabella che descrive la quantità di concentrato di HCl è necessario per raggiungere il pH corretto.

MATERIALI E METODI

Il protocollo in situ è presentato in precedenza e nel film. Ulteriori informazioni qui del materiale vegetale e le sonde utilizzate in questo esempio specifico sono descritti.

Materiale vegetale e il disegno sperimentale

Coni maschio da Picea abies [L.] Carso. (Norvegia abete rosso) sono stati raccolti a Uppsala, in Svezia, autunno 2007. Otto coni sono stati sezionati e sezioni daogni cono sono stati utilizzati in ogni trattamento. Tre le concentrazioni di proteinasi K sono stati testati, 1, 3 e 5 mg / mL e ogni concentrazione sono stati trattati con o senza RNasi. Diapositive non trattate con RNasi sono stati lasciati in PBS durante il trattamento con RNAsi. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. e Brassica napus L., sono state coltivate in condizioni controllate in una camera di cultura con 22 ° C/18 ° C giorno / notte le temperature e un fotoperiodo di 16 h. Infiorescenze giovani contenente gemme floreali, stadi 00-10 (stadi secondo Smyth ⁵⁾ sono stati studiati.

cRNA sonde

RNA totale è stato isolato da P. abies coni maschili come descritto in precedenza 6 e da A. thaliana e B. napus utilizzando TRIzol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, USA) e la Qiagen RNeasy impianto Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania), rispettivamente, in accordo con le raccomandazioni produttori '. Il cDNA è stato sintetizzato da RNA totale 0,5-1 mg, a seconda della specie, utilizzando Apice III della trascrittasi inversa (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) seguendo le istruzioni del produttore. AtAP3 e BnAP3 senso e antisenso frammenti e P. frammenti di senso abies sono stati isolati e amplificati con primer gene specifico (Tabella 1). DAL13 frammenti antisenso sono stati isolati e amplificato utilizzando primer come in 7. Uno sbalzo T7 è stato aggiunto a frammenti da A. thaliana e P. abies utilizzando modificato primer reverse portando il T7-sequenza (Tabella 1). Un frammento di 500 bp è stato isolato utilizzando BnAP3 primer specifici (Tabella 1) e clonato in un vettore pGEM-T con un T7-promotore. Per i frammenti di P. abies tutte le reazioni di PCR sono state eseguite in un volume finale di 20 l contenente 0,2 U Phusion alta Fidility DNA polimerasi (Finnzymes, Espoo, Finlandia), 1x Phusion HF tampone, 200 mM di ciascun dNTP, 0,3 mM di ogni primer e 25-50 cDNA ng e un programma standard di PCR è stato utilizzato con ricottura temperatura 60-55 ° C (touch-down -1 ° C / ciclo), seguiti da 55 ° C. Senso e antisenso sonde cRNA per tutte e tre le specie sono stati sintetizzati con trascrizione in vitro con il DIG RNA Kit per l'etichettatura (SP6/T7; Roche Applied Science, Mannheim, Germania) secondo le raccomandazioni del fabbricante e le sonde lungo sono stati digeriti a circa 100-150 pb frammenti con un Na ₂ CO ₃ tampone in base a ^3.

RISULTATI

Qui nel risultato sezione descrivono tre diversi esempi di risultati tipici di esperimenti in situ.

Il meccanismo genetico che regola lo sviluppo riproduttivo in gimnosperme e le angiosperme, specificando l'identità dell'organo maschile e femminile sembra essere evolutivo conservato ^7-9, nonostante che le due linee delle sementi di piante separate 285 milioni anni fa ^10. In A. thaliana i geni omeotici floreali APETALA3 (AP3 ¹¹⁾ e pistillata (PI ¹²⁾ sono necessari e sufficienti per lo sviluppo riproduttivo maschile specificare nel contesto di un fiore, e questa funzione sembra essere conservata all'interno del lignaggio angiosperme ^13. In gimnosperme, che mancano fiori e hanno i loro organi riproduttivi disposti in coni separati maschi e femmine (Fig. 1A-C), i geni omologhi a AP3 e PI sono specificamente espresse negli organi cuscinetto polline del cono maschio, il microsporophylls ^7,14. Quindi, un simile insieme di geni omologhi in entrambe le angiosperme e gimnosperme definisce il polline-cuscinetto organi.

Sonde gene specifico contro AtAP3 e BnAP3, rispettivamente, hanno dato segnali di fase 3 in giovani germogli floreali in una regione corrispondente a spirale due e tre in A. thaliana e B. napus. In seguito messo in scena gemme erano limitati i segnali di petali di sviluppo e gli stami (Fig. 2A e B). Questi risultati sono in accordo con precedenti studi ^11,15,16. Sonde dirette verso l'omologo AP3 in P. abies, DAL13, prodotto segnali nella microsporophylls di P. abies coni maschili sia prima che dopo la cessazione meristema apicale (Fig. 2C e D), come previsto da studi precedenti ^7,14. Sonde senso ha dato nessun segnale di sopra di fondo (fig. 3A-B e dati non riportati). Presi insieme, questi risultati dimostrano l'espressione di A. thaliana AP3 e dei suoi ortologhi in B. napus e P. abies nello sviluppo di organi riproduttivi maschili.

Figura 1. A.thaliana e B. fiori napus e la produzione di polline coni maschio della P. di conifere Immagini abies spettacolo infiorescenze con boccioli floreali e fiori aperti di A.thaliana e B.napus in A e B rispettivamente. Si noti che i fiori angiosperme oltre al perianzio sterile porti organi riproduttivi maschili e femminili, stami e carpelli. Mostrato in C è un ramoscello di gimnosperme P. abies con aghi di colore verde e rosso vegetativo coni riproduttivo maschile.

Figura 2. Espressione di A. AP3 thaliana e geni omologhi in B. napus e P. abies. Micrografie mostrano sezioni longitudinali di A. thaliana e B. infiorescenze napus in A e B, rispettivamente, e P. abies coni maschile in C e D. Sezioni ibridato con sonde antisenso diretti contro AtAP3 in A e in B BnAP3 segnale spettacolo di organi spirale secondo e terzo floreali. I numeri indicano fasi floreali secondo Smyth ^5. Antisenso sonda diretta verso il gene DAL13 ha dato segnale nel microsporophylls cuscinetto polline di P. abies coni maschio, come mostrato in CD. Esempi di microsporophylls sono indicati da frecce. Punte di freccia di cui al punto AD segnale di ibridazione, che appare come viola. In C e D composti fenolici dare colore marroncino non specifico per le singole cellule nel midollo centrale. s, sepalo, p, petalo, st, stame, c, carpello; ms, microsporophyll; pi, midollo, pp; pre-polline cellule. Bar: 100 micron.

Figura 3. DAL13 espressione in coni maschili da P. abies. Tutti Micrografie (AH), stanno mostrando sezioni longitudinali di coni maschio dopo la cessazione meristema apicale. Punte di freccia indicano tipi di cellule in cui si esprime DAL13. Sezioni A e B sono ibridati con una sonda di controllo senso di determinare la colorazione di fondo. Micrografie C e H sono ibridati con una sonda antisenso DAL13. Sezioni di esperimenti con e senza RNasi trattamento sono mostrati in D, F, H e C, E, G, rispettivamente. Micrografie dagli esperimenti con 1 mg / ml di proteinasi K sono riportati in C e D, 3 mg / ml in E e F, e 5 mg / ml in G e H. Bar: 100 micron.

Discussione

Due aspetti del P. abies protocollo sono stati ottimizzati rispetto alla A. thaliana / B. napus protocollo, RNasi trattamento e proteinasi K concentrazione. La RNAsi rimuove i segnali di fondo e quindi aumenta la specificità del segnale ^17. Il trattamento proteinasi K è necessaria per permeabilize tessuti modo che la sonda può entrare e ibridare alla piscina RNA di interesse. Il DAL13 antisenso sonda ha dato un segnale superiore senza RNasi-trattamento (Fig. 3C, E, G), rispetto a sezioni trattate con RNasi per 30 min (Figura 2D, F e H). Dato che la RNAsi-trattamento non ha incrementato il segnale è stato rimosso dal protocollo. Il trattamento proteinasi K sono stati testati a tre diverse concentrazioni, 1, 3 e 5 mg / ml. Nel caso di P. abies un segnale basso o nullo è stato osservato con 1 mg / ml di proteinasi K (Fig. 3C-D). Un segnale forte è stato ottenuto sia con 3 g / ml (Fig. 3E-F) e 5 mg / ml (Fig. 3G-H) proteinasi K. Poiché nessuna differenza apparente nella potenza del segnale è stato trovato quando con 5 mg / ml di proteinasi K rispetto a 3 mg / ml, abbiamo scelto di utilizzare 3 mg / ml nel nostro protocollo. E 'probabile che la necessità di una concentrazione più alta proteinasi K in P. abies coni maschio rispetto alla A. thaliana e B. napus gemme floreali è dovuto al tessuto più compatto, con livelli più elevati di composti fenolici e polisaccaridi.

Durante la fissazione e di inclusione delle differenze tra la A. thaliana / B. napus protocollo e la P. abies protocollo sono evidenti. Il tessuto di interesse è fissato per fornire ritenzione RNA e questo è un passo fondamentale in quanto materiali poco fisso potrebbe dare un segnale basso o non rilevabili, anche se l'mRNA è molto abbondante. Il tessuto è disidratato, cancellato e incorporati in cera a cambiamenti graduali per evitare danni ai tessuti, e in alcuni protocolli di NaCl 0,85% viene aggiunto l'etanolo nella disidratazione per evitare ulteriori ritiro e rigonfiamento delle cellule ^3. Il passo disidratazione durante embedding possono essere eseguite su ghiaccio per mantenere l'attività RNAsi al minimo. Nel P. abies protocollo la soluzione al 4% paraformaldeide fix contiene 0,25% glutaraldeide, che dovrebbe dare una migliore ritenzione RNA ^17, anche se alcuni sostengono che probabilmente non fa differenza ^3. Dopo sezionare il materiale è fissato su diapositive e pretrattati (cioè deparaffinati, reidratato, permeabilizzate, trattato per ridurre legame non specifico della sonda e, infine, disidratati) prima della ibridazione.

Nel protocollo presentato qui la procedura di rilevamento intero può essere eseguita nei laboratori ordinari, il segnale di solito si sviluppa entro 1-3 giorni e il rapporto tra il segnale su sfondo può essere continuamente monitorato. Il DIG-sonde marcate di solito danno un segnale più distinti rispetto ai radioattivo sonde marcate, sono più stabili e possono essere riutilizzati in esperimenti consecutivi. D'altra parte, la sensibilità è ridotta rispetto alle sonde radioattive ^17. Ibridazione in situ rileva espressione utilizzando una sonda marcata specifica per un determinato mRNA. Radio-etichettatura è un metodo di etichettatura affidabile e sensibile, ma richiede una gestione della radioattività e ci vogliono diverse settimane prima che i risultati possono essere rilevati. Antigene-sonde marcate invece, sono più stabili, meno pericolosi e richiedono l'esposizione al mezzo di rilevazione per pochi giorni solo ^17. Così, antigene-etichettatura metodi sono attualmente dominante. La fase più critica a prescindere dal protocollo è il design della sonda. Si deve prestare attenzione per assicurarsi che la sonda ha una alta specificità ed è etichettata con UTPs di alta qualità. A volte l'ibridazione di temperatura e / o la lunghezza di reazione devono essere adattati per sonde specifiche.

Il nostro protocollo modificato sulla base di DIG-sonde marcate faciliterà la localizzazione di espressione di mRNA contemporaneamente in specie che vanno da A. thaliana a P. abies, e con piccole modifiche dovrebbero essere utilizzabili in altre specie di piante. Il protocollo ha, accanto coni maschili, anche stato testato su diverse fasi di germogli vegetativi e in entrambi i zigotico embrioni somatici e da P. abies con buoni risultati (risultati non pubblicati;. Karlgren et al).

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride	Sigma-Aldrich	A6404-200ml	minimum 98%
Acrylamide, linear	Ambion	9520
Anti-DIG-antibodies	Roche Group
Blocking reagent	Roche Group	11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50g	minimum 98%
Deionized formamide	Sigma-Aldrich
Denhardts solution	Sigma-Aldrich	D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich
Dextran sulfate	Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)	Roche Group	11175025910
Glutaraldehyde (25%)	Histolab
Glycogen	Ambion	9510G
Histoclear II	Histolab		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax	Histolab		Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500g
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	P3683-1kg	Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase	Finnzymes
Probe-on Plus slides	Fisher Scientific	22-230-900
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308-5mg
RNase A	Sigma-Aldrich	R5503-100mg
Tissue-clear	Sakura Finetek		You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	T1377-100ml	minimum 98%
Triton X-100	use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA	Sigma-Aldrich	83853-100mg
Tween-20	use your standard product in the lab		Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue	Promega Corp.