שילוב העצבים ההיקפית השתלת ומטריקס אפנון לתקן את חוט השדרה עכברוש נפגעים

Summary

פגיעה טראומתית בחוט השדרה משבש את התקשורת עם המוח. כדי לשחזר קישוריות איבד אנו מנצלים שתל העצב ההיקפיים לספק תשתית של סיבים התחדשות בשילוב עם גורמים neurotrophic מטריקס ו-ויסות אנזימים להסיר מולקולות המעכבות כדי לקדם את צמיחת למרחקים ארוכים.

Abstract

פגיעה טראומטית לחוט השדרה (SCI) גורם למוות של נוירונים, הפרעה מוטורית סיבי עצב תחושתי (האקסון) המסלולים והפרעה תקשורת עם המוח. אחת המטרות של המחקר שלנו היא לקדם התחדשות האקסון לשחזר קישוריות ברחבי האתר הנגע. לשם כך פיתחנו העצבים ההיקפית (PN) השתלת טכניקה שבה מגזרים של עצב השת ממוקמות בין במישרין בין הקצוות פגומים של חוט השדרה או משמשים כדי ליצור גשר על פני הנגע. ישנם מספר יתרונות גישה זו בהשוואה השתלת רקמות עצביות אחרות; אקסונים התחדשות יכולה להיות מופנית לעבר אזור יעד ספציפי, מספר מקור התחדשות אקסונים נקבעת בקלות על ידי מעקב אחר טכניקות, השתל יכול לשמש בניסויים אלקטרו למדוד החלמה תפקודית הקשורים אקסונים ב השתל, וניתן להשתמש עצב עצמיים כדי לצמצם את האפשרות של דחיית השתל. במעבדה שלנו אנחנו ביצעו הן עצמיים (התורם והמקבל הם חיים זהה) Heterologous (התורם והמקבל הם בעלי חיים שונים) שתלי עם תוצאות דומות. גישה זו שימש בהצלחה במצבים פגיעה הן כרוניות וחמורות. אקסונים מחדש זה להגיע לסוף דיסטלי של השתל PN לעיתים קרובות אינם מצליחים להרחיב בחזרה לתוך חוט השדרה, כך אנו משתמשים microinjections של chondroitinase להשפיל מולקולות מעכבות הקשורות רקמת הצלקת סביב שטח של SCI. במקביל מצאנו כי מתן אקסוגני צמיחה ומולקולות trophic מעודדת לצמיחה מחודשת axonal מרחק רב יותר אל חוט השדרה. מספר חודשים לאחר ההשתלה לנו לבצע מגוון של בדיקות אנטומיות, התנהגותיות אלקטרו להעריך את ההתאוששות של הפונקציה בחיות חוט השדרה שלנו נפגע. גישה זו ניסיוני שימש בהצלחה בכמה מודלים פגיעה בעמוד השדרה חוט, ברמות שונות של פגיעה במינים שונים (עכבר, עכבר וחתול). חשוב לציין, הגישה העצבים ההיקפית השתלת יעיל בקידום התחדשות על ידי נוירונים חריפה נפצע כרוני.

Protocol

1) הכנה לקראת ניתוח מיקרוסקופי

1. תחנת כירורגית צריך להיות נקי מחוטא עם פתרון לדלל אקונומיקה לפני שתצאו מכשירים וחומרים אביזר. מכשירים יהיה autoclaved 1 יום לפני הניתוח ומאוחסן במיכל סטרילי. הפעל מעקר ביד חם (כלי מדעי פיין) משמש כדי להסיר פתוגנים מזהמים מיקרוביאליים ממכשירים בין ההליכים על בעלי חיים שונים.
2. חברו את המכשול תרמית להשתמש כדי לשמור על חום הגוף במהלך ההליך הכירורגי. הגדר את ספוגיות כותנה פדי גזה משמש לשליטה הדימום. הכן קטן (<2mm ³⁾ פיסות קצף ג'ל לשמש hemostasis מיקרו לטבול בתמיסה סטרילית מלוחים.
3. עכברוש מקום בתא אינדוקציה להרדים עם Isoflurane (5% מתאייד חמצן, קצב הזרימה 2.0 L / min). הסר חיה מן החדר אל השולחן הכנה לגלח שטח נרחב של פרווה מתחום הניתוח המיועד. נגבו עם תחילת 70% אלכוהול isopropyl במרכז השדה ומקרינה החוצה, ואחריה שפשוף עם פתרון Polyhydroxidine (Xenodine) באותו אופן. חזור על רצף של שוטף 3 פעמים.
4. חיה מניחים על המכשול תרמית, לכסות את האף והפה עם קונוס משאיפת, להפחית Isoflurane 3% וקצב הזרימה 0.2 L / min. ספק המינון המתאים של אנטיביוטיקה (אמפיצילין) בזריקה תת עורית ועל כאבים (עצירות 0.05 מ"ג / ק"ג) בהזרקה לשריר.
5. המנתח יהיה לשפשף את ידיהם עם פתרון Xenodine ולשטוף עם מים. שמלת כירורגי סטרילי יהיה מצויד על המנתח; ידיים יהיה יבש עם מגבת סטרילית מכוסה כפפות סטריליות. בעקבות הליך זה עבור כל הליך כירורגי המתוארים בטקסט זה.
6. המכסה המכסה את כלי סטרילי יוסרו על ידי עוזר ומכשירים יהיו מונחים על כיסוי סטרילי על ידי המנתח.

2) חיתוך רוחב של PN לקדם ניוון

1. עם החיה שוכב על צידו לעשות חתך קו ישר בין ראש עצם הירך לכיוון הברך, שמירה במקביל 3mm כ מן הירך. לחתוך את השרירים שרירי שטחית femoris לאורך קו זהה חתך את העור, כדי לחשוף את השרירים הבסיסית vastus lateralis.
2. בעזרת מספריים לעשות חתך קטן באזור lateralis vastus ליד הברך ולהרחיב את זה כלפי ראש עצם הירך. שוב במספריים בעדינות להפריד בין lateralis vastus עד הענפים סיאמיים עצב השוקה ו peroneal של עצב השת הם דמיינו (המקביל עצם הירך).
3. עקבות אלו סניפים לקראת ראש עצם הירך עד הגזע המרכזי של עצב השת מזוהה. בדיוק מתחת הסתעפות של עצב השת להשתמש במלקחיים בסדר בזהירות נפרד רקמת החיבור (epineurium) סביב ענף עצב השוקה (זהו סניף גדול יותר).
4. מבודד לאחר תלוש ליגטורה 6-0 משי סביב העצב הטיביאלי והדק. השתמש במספריים מיקרו transect העצב מקורי כדי התלייה. לעבור את קו תפר את השריר vastus lateralis והעניבה בקשר. זה יספק קו עבור מיקום קל של סוף חתך של העצב הטיביאלי כאשר העצב הוא להיות שנקטפו 7-10 ימים לאחר מכן.
5. ניוון של עצב השוקה לפני השתלת מספקת סביבה מתאימה יותר לגידול axonal מאשר הכנה עצב טריים.
6. סגור את השריר lateralis vastus עם 6-0 תפרים משי. סגור את השריר femoris שרירי עם 6-0 תפרים משי. סגור את העור עם קליפים מישל הפצע. כבה את זרימת Isoflurane, להסיר את האף משאיפת חרוט ובעלי חיים במקום להחזיק כלוב על המכשול תרמית ולחזור הביתה כלוב פעם הוא ערני ופעיל.

3) הסרת קטע PN

1. להרדים בעלי חיים, להתגלח ולנקות את שדה הניתוח מיועד כמתואר לעיל (1.3). מניחים את חיה על המכשול תרמית.
2. הסרת קליפים הפצע והעור נפרד החתך הקודם. גזור באמצעות תפר של השריר השטחי לחשוף vastus lateralis ולחתוך תפר בשריר זה.
3. עקוב אחר קו תפר לחתוך סוף עצב השוקה ולהסיר תפר מן העצב. שימוש במלקחיים בסדר לנתח epineurium מ אורך 15 מ"מ של העצב הטיביאלי לחתוך דרך לסיים את זה דיסטלי. הסר את קטע העצב לטבול פתרון הנקס סטרילי מלח מאוזן.
4. אם זהו הניסוי שתל Heterologous להרדימו באמצעות זריקה intraperitoneal של Euthasol. אם זהו ניסוי שתל עצמיים, השריר ברגל העור סגור כמתואר 2.6) ואת החיה מוכן פגיעה בחוט השדרה הצווארי, כמתואר להלן.

4) פגיעה צוואר הרחם hemisection והשתלות

יום 1

1. להרדים בעלי חיים, להתגלח ולנקות את כוונותבתחום כירורגית ded כמתואר לעיל (1.3). מניחים את חיה על המכשול תרמית. ניהול אנטיביוטיקה משככי כאבים כמו לעיל (1.4).
2. אתר את חריץ העורפית ואת תהליך בולט T2 השדרה הגבי ולעשות חתך לכל אורכו בין ציוני חיצוני. חותכים דרך קו האמצע של שריר הטרפז שטחית להפריד את השרירים הבסיסית rhomboideus צוואר הרחם. שמור על השרירים בנפרד על ידי החדרת מפזר.
3. השרירים supraspinal עמוק צריך לחתוך מתהליכי השדרה הגבי C4, C5 ו C6. Rongeurs שימוש לבצע laminectomy חלקית של C5 לחשוף את הצד הימני כולו את החלק המדיאלי של הצד השמאלי של עמוד השדרה. השתמש וריד בולט הגבי כציון דרך עבור קו האמצע חוט השדרה.
4. השתמש להב מיקרו אזמל או מחט מד 30 ל מאטר לנקב הדורה ולהרחיב את החתך מעל חוט השדרה C5. ביצוע חתך קטן subarachnoid הבסיס לבין מאטר פיא.
5. עם כוס משך מיקרו צינורית להתחיל לשאוב את הצד הגבי, זכותו של חוט השדרה, באמצעות לחץ עדין ומיקרו מלקחיים להפריד בין רקמות להקל על הוצאתה. המשך דרך מנות ביניים הגחון של חוט השדרה כדי ליצור חלל ארוך 2 מ"מ כי השלמת מן הגב אל הגחון מ קו האמצע של קרומי המוח לרוחב.
6. המקום מלוחים ספוג קצף ג'ל לחלל כדי להשיג hemostasis.
7. הסר את קטע של עצבים היקפיים מפתרון הנקס. לקלף בעדינות epineurium מן 3mm הפרוקסימלי של המגזר עצב appose זה סוף אל הקיר מקורי של חלל הנגע hemisection. Secure הקטע עם תפר 10-0 דרך epineurium כדי מאטר דורה, ואז תפר הדורה נסגר מעל סוף מושתל של השתל.
8. סנדוויץ השתל בין 2 חתיכות של הממברנה silastic (Biobrane) להגנה ובידוד קל בנקודת זמן מאוחר יותר. מקום לצד של C6, C7 ותהליכים בחוליות T1. אל appose סוף עצב דיסטלי אל חוט השדרה או רקמת שריר.
9. שרירי סגור בשכבות עם תפר 4-0 ו חתך עור הדוקים עם קליפים הפצע.
10. מקום החזקת בעלי חיים בכלוב על מחסום תרמי לחזור לכלוב הביתה לאחר שהוא ערני ופעיל.

יום 21

11. להרדים בעלי חיים, להתגלח ולנקות את שדה הניתוח מיועד כמתואר לעיל (1.3). מניחים את חיה על המכשול תרמית ולנהל אנטיביוטיקה משככי כאבים כמו לעיל (1.4). גזור באמצעות תפרים שטחית לחשוף קרום silastic סביב שתל העצב. חינם בזהירות את אורך עצב הממברנה silastic באמצעות מלקחיים בסדר ומספריים האביב לשקף מהשדה כירורגית.
12. בצע laminectomy חלקי בצד ימין של תהליך C7 השדרה. פירס קרומי המוח לעיל (4.4) ועל ידי השאיפה להכין 1 ³ מ"מ חלל הגב ברבע פגיעה בחוט השדרה C7. השתמש מלוחים ספוג קצף ג'ל להשיג hemostasis ולאחר מכן להחליף עם קצף ג'ל ספוגה chondroitinase ABC. פנקו את האתר הנגע למשך 15 דקות, מתן קצף טרי chondroitinase ספוג ג'ל כל 5 דקות.
13. מכסים את אורך חיצוני של שתל העצב עם קרום Silastic. סגור השרירים השטחיים עם התפרים 4-0 ואת החתך בעור עם קליפים הפצע. מקום החזקת בעלי חיים בכלוב על מחסום תרמי לחזור לכלוב הביתה לאחר שהוא ערני ופעיל.

יום 23

14. להרדים בעלי חיים, להתגלח ולנקות את שדה הניתוח מיועד כמתואר לעיל (1.3). מניחים את חיה על המכשול תרמית ולנהל אנטיביוטיקה משככי כאבים כמו לעיל (1.4). גזור באמצעות תפרים שטחית לחשוף קרום silastic סביב שתל העצב. לא להפריע את השתל אלא לחשוף את האתר שתל C7 ולהשתמש המילטון מזרק עם צינורית זכוכית על משך microinject 1μl של chondroitinase ABC לתוך הצד הימני של חוט השדרה של כ 1 מ"מ דיסטלי כדי תמורה של השתל אל חוט השדרה.
15. לקלף בעדינות epineurium מן 2mm דיסטלי של המגזר עצב appose זה סוף לחלל הנגע C7. Secure הקטע עם תפר 10-0 דרך epineurium כדי מאטר הדורה.
16. סגור השרירים השטחיים עם התפרים 4-0 ואת החתך בעור עם קליפים הפצע. מקום החזקת בעלי חיים בכלוב על מחסום תרמי לחזור לכלוב הביתה לאחר שהוא ערני ופעיל.

5) הקלטה אלקטרו פוטנציאל פעולה חוט השדרה שוחד דיסטלי

1. כדי לקבוע אם הפעילות החשמלית מועבר דרך אקסונים שיש מחדש לתוך PNG עלינו תחילה לחשוף ולבודד את השתל. טיפול מיוחד יש לנקוט בהליך זה כדי למנוע פגיעה פיזית שתל וכאן השימוש קרום Silastic אחרי המיקום של השתל היא חשובה. להרדים בעלי חיים, להתגלח ולנקות את שדה הניתוח מיועד כמתואר לעיל (1.3). המקום הדואר חיה על המכשול תרמית.
2. לאחר פתיחת העור והפרדת השרירים השטחיים, רצועות קרום Silastic מזוהים גזור בקפידה ללא השתל.
3. Rongeurs שימוש להסיר את תהליך השדרה הגבי מקורי מיד הזנב של PNG-הפרד חוט השדרה אתרים. הקפד לא להפריע יותר מדי במהלך שתל בגישה זו. ביצוע חתך מאטר הדורה בשתי הרמות.
4. מקורי כ 1cm לאתר C5 שתל חוט השדרה הפרד להוסיף חוט יחיד (פלטינה אירידיום לערבב) אלקטרודה מגרה לתוך חוט השדרה ipsilateral על הנגע, עד לעומק של כ 1 מ"מ. הרם בזהירות את החלק מרכז של השתל על אלקטרודה דו קוטבית מכור. מתן פולסים מגרה אחת של 10μA עם משך 100μsec ולקבוע אם יש פוטנציאל פעולה נסיעה דרך אקסונים שיש מחדש לתוך השתל.
5. החלף את החיבורים ואת המיקום של החוטים כך אלקטרודה מכור הופך את אלקטרודה מגרה חוט בודד מוכנס לתוך חוט השדרה דיסטלי כדי תמורה של PNG בעמוד השדרה ומנסים להקליט פוטנציאל פעולה בחוט השדרה.
6. בסוף הניסוי לספק הרכבת של 1mA גירויים למשך 100μsec ב 50Hz, עבור סכום כולל של 1 שעות. להרדים בעלי חיים 1 שעות מאוחר יותר, עם perfuse paraformaldehyde 4% ו רקמת חוט השדרה תהליך לאיתור immunocytochemical של כספים בנוירונים הופעלו כתוצאה אקסונים מחדש ב-PNG.

6) תיוג מדרדר של נוירונים להתחדש אקסונים לתוך PNG וסימון האנטרוגרד של אקסונים כי להתחדש בחזרה לתוך חוט השדרה

1. עבור בעלי החיים לא נבדק על ידי אמצעים אלקטרו אפשר לזהות את המקור של אקסונים הגדלים לתוך השתל ואת מהלך הסיום שלהם בחוט השדרה. להרדים בעלי חיים, להתגלח ולנקות את שדה הניתוח מיועד כמתואר לעיל (1.3). מניחים את חיה על המכשול תרמית ולחשוף את PNG כמתואר 6.1 לעיל.
2. השתמש במספריים מיקרו לחתוך שתל בנקודת אמצע שלו רצועת גב epineurium מקצות חתך של השתל. חשבו לחתוך את הקצוות אחד מהשני ומניחים כל אחד על דף נפרד parafilm.
3. מניחים pledget של קצף ג'ל ספוג כחול אמנם על קצה פרוקסימלי לחתוך לנוירונים תווית שתרמו האקסון אל PNG. מניחים pledget של קצף ג'ל ספוגה biotinylated dextran אמין (BDA) על הקצה הדיסטלי כדי לחתוך אקסונים תווית להאריך מאחור השתל לתוך חוט השדרה.
4. להרדים בעלי חיים 3-4d מאוחר יותר, עם perfuse paraformaldehyde 4% והמוח תהליך חוט השדרה רקמות חלקים עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור True Blue נוירונים שכותרתו או histochemistry BDA עבור אקסונים הנקרא.

7) פגיעה חיתוך רוחב בית החזה מלא השתלה

זו מציעה גישה חלופית של מודל פציעה בצוואר הרחם hemisection לעיל. כאן חמור יותר, פגיעה דו צדדי הוא הפיק קטעים של עצבים היקפיים ממוקמים לחלל את הנגע כדי תוחלת וגזעי מקורי ואת הזנב של חוט השדרה נפגע.

יום 1

1. להרדים בעלי חיים, להתגלח ולנקות את שדה הניתוח מיועד כמתואר לעיל (1.3). מניחים את חיה על המכשול תרמית. ניהול אנטיביוטיקה משככי כאבים כמו לעיל (1.4).
2. זיהוי T12 רמת השדרה בנקודה של הכניסה של הצלעות האחרונות. הפוך את החתך בעור מנקודה זו מקורי על תהליכים בחוליות T11, T10 ו T9. חותכים דרך fascia השטחית דרך השרירים supraspinal המצורפת אלה שלושה תהליכים.
3. בצע laminectomy מלאה של תהליך בחוליות T10 (T12 שמעל חוט השדרה קטע). השתמש להב מיקרו אזמל או מחט מד 30 ל מאטר הדורה לחדור ולהרחיב את החתך מעל חוט השדרה T12. ביצוע חתך קטן subarachnoid הבסיס לבין מאטר פיא.
4. עם כוס משך מיקרו צינורית להתחיל לשאוב את חוט השדרה T12 בילטרלי, באמצעות לחץ עדין ומיקרו מלקחיים להפריד בין רקמות להקל על הוצאתה. המשך דרך מנות ביניים הגחון של חוט השדרה כדי ליצור חלל ארוכה 3 מ"מ זה הגבי מלאה ו הגחון בין קרומי המוח לרוחב.
5. השתמש מלוחים ספוג קצף ג'ל להשיג hemostasis ולאחר מכן להחליף עם קצף ג'ל ספוגה chondroitinase ABC. פנקו את האתר הנגע למשך 15 דקות, מתן קצף טרי chondroitinase ספוג ג'ל כל 5 דקות.
6. הסר את קטע של עצבים היקפיים מפתרון של האנק. בעדינות לשקף את epineurium מן 4mm הפרוקסימלי של המגזר עצב חתך אורך כדי להתאים בנוחות בין גדמי מקורי ואת הזנב של צד אחד של חוט השדרה. מקום קטע שנייה לצד מגזר מורכבים הראשון, apposed לצד השני של חוט השדרה. תפר הדורה הסגור על מושתלים שתלי ומכסים הדורה עם קטןפיסת קרום silastic.
7. שרירי סגור בשכבות עם תפר 4-0 ו חתך עור הדוקים עם קליפים הפצע.
8. מקום החזקת בעלי חיים בכלוב על מחסום תרמי לחזור לכלוב הביתה לאחר שהוא ערני ופעיל.

יום 3

9. להרדים בעלי חיים, להתגלח ולנקות את שדה הניתוח מיועד כמתואר לעיל (1.3). מניחים את חיה על המכשול תרמית ולנהל אנטיביוטיקה משככי כאבים כמו לעיל (1.4). גזור באמצעות תפרים שטחית לחשוף silastic קרום המכסה את האתר השתל. לא להפריע את השתל אלא לחשוף את חוט השדרה הזנב כדי השתל ושימוש מזרק המילטון עם צינורית זכוכית על משך microinject 1μl של chondroitinase ABC לתוך צד של חוט השדרה של כ 1 מ"מ דיסטלי כדי תמורה של השתל אל חוט השדרה.
10. סגור השרירים השטחיים עם התפרים 4-0 ואת החתך בעור עם קליפים הפצע. מקום החזקת בעלי חיים בכלוב על מחסום תרמי לחזור לכלוב הביתה לאחר שהוא ערני ופעיל. ביצוע ההקלטה אלקטרו גירוי ו וסימון נותב כמתואר 5) ו - 6) לעיל.

8) נציג תוצאות

כאשר הליך זה הוא מותאם קטע העצבים ההיקפית יהיה לשלב באופן הדוק עם חוט השדרה המארח. עולים ויורדים השדרה אקסונים ייכנסו שתל, לגדול במקביל קו ישר יחסית אורך השתל ולהרחיב עד הסוף דיסטלי של השתל בשיעור של כ 1 מ"מ ליום. עם הגעתם סוף דיסטלי, אקסונים יחדרו חוט השדרה הסמוכה chondroitinase אם נעשה שימוש כדי להסיר proteoglycans מעכבות מתוך רקמת הצלקת סביב. קישוריות פונקציונלית ייקבע על ידי זיהוי אלקטרו ו immunocytochemical של תגובה על ידי נוירונים בחוט השדרה לגירוי של אקסונים בתוך השתל. מתאם אנטומי להחלמה תפקודית יוערכו על ידי התחקות את מספר אורך אקסונים כי יש להאריך מעבר שתל העצב אל חוט השדרה.

Discussion

1. עבור שחזור של הניסוי חשוב כי רמת פגיעה בחוט השדרה להיות עקבי מן החי אל החי. לכן זה קריטי כי תהליך השדרה המתאים laminectomy להיות מזוהה. כי אנחנו משתמשים hemisection או חיתוך רוחב הנגע מודל למחקר זה אין עמימות בערך בגודל של הנגע או קטעי השדרה ספציפי נפצעו או חסך.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 silk suture	ArosSurgical	T5A10N10
6-0 silk suture	McKesson	2693
Ampicillin	McKesson	483549
Antibody to cFos	Sigma-Aldrich	F7799
Biotinylated dextran Amine	Invitrogen	D7135
Buprenorphin (.3mg/ml)	McKesson	12496075701
Chondroitinase ABC	Associates of Cape Cod	100332-1A
Euthasol	Webster Veterinary	07-805-9296
Hanks Balanced Salt Solution	Cellgro	21-021-CV
Isoflurane	Henry Schein	209-1966
Michel Wound Clips	Fine Science Tools	12040-02
Neurotrace Kit	Invitrogen	N7167
True Blue	Sigma-Aldrich	T5891
Xenodine	Webster Veterinary	92201
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools
Forced Exercise Wheel	Lafayette Instruments
TreadScan System	Clever System
Infinite Horizon Impact Device	Precision Systems and Instrumentation
Magnetic Stimulation Device	Magstim