La combinazione di innesto del nervo periferico e Matrix modulazione di riparare il cavo feriti Rat spinale

Riepilogo

Lesione traumatica al midollo spinale interrompe la comunicazione con il cervello. Per ripristinare la connettività perso utilizziamo un innesto del nervo periferico di fornire un substrato per la rigenerazione delle fibre in combinazione con fattori neurotrofici e matrice di modulazione degli enzimi per rimuovere molecole inibitrici per promuovere la crescita a lunga distanza.

Abstract

Lesione traumatica al midollo spinale (SCI) provoca la morte dei neuroni, rottura del motore e delle fibre nervose (assoni) percorsi e interruzione della comunicazione con il cervello. Uno degli obiettivi della nostra ricerca è quello di promuovere la rigenerazione degli assoni per ripristinare la connettività in tutto il sito della lesione. Per fare questo abbiamo sviluppato un nervo periferico (PN) l'innesto tecnica in cui i segmenti del nervo sciatico sono o inseriti direttamente tra le estremità danneggiata del midollo spinale o sono utilizzati per formare un ponte che attraversa la lesione. Ci sono molti vantaggi di questo approccio rispetto al trapianto di altri tessuti neurali, gli assoni rigeneranti può essere diretto verso una zona target specifico, il numero e la fonte di rigenerazione degli assoni è facilmente determinato da tecniche di tracciamento, l'innesto può essere utilizzato per esperimenti di elettrofisiologia per misurare recupero funzionale associata assoni nel trapianto, ed è possibile utilizzare un nervo autologo per ridurre la possibilità di rigetto del trapianto. Nel nostro laboratorio abbiamo effettuato sia autologhi (donatore e ricevente sono lo stesso animale) e eterologa (donatore e ricevente sono animali diversi) innesti con risultati comparabili. Questo approccio è stato utilizzato con successo nelle situazioni di lesioni acute e croniche. Assoni rigenerati che raggiungono l'estremità distale dell'innesto PN spesso non riescono a prolungare nuovamente dentro il midollo spinale, quindi usiamo microiniezioni di condroitinasi di degradare molecole inibitori associati al tessuto cicatriziale che circonda l'area del SIC. Allo stesso tempo, abbiamo trovato che fornire la crescita esogena e molecole trofico incoraggia lunga distanza ricrescita degli assoni nel midollo spinale. Diversi mesi dopo il trapianto si eseguono una serie di esami anatomici, elettrofisiologici e comportamentali per valutare il recupero della funzione nel nostro midollo spinale degli animali feriti. Questo approccio sperimentale è stato utilizzato con successo in diversi modelli del midollo spinale lesioni, a diversi livelli di lesione e in diverse specie (topo, ratto e gatto). È importante sottolineare che l'approccio dei nervi periferici innesto è efficace nel promuovere la rigenerazione dei neuroni acuta e cronica feriti.

Protocollo

1) Preparazione per la chirurgia microscopica

1. La stazione chirurgico ha bisogno di essere puliti e disinfettati con una soluzione di candeggina diluita prima che definisce strumenti e materiali accessori. Strumenti saranno in autoclave 1 giorno prima dell'intervento e conservati in un contenitore sterile. Accendere il Sterilizzatore Hot Bead (Strumenti Scienza Belle) utilizzati per eliminare gli agenti patogeni e contaminanti microbici dagli strumenti tra procedure su animali diversi.
2. Collegare la barriera termica utilizzata per mantenere la temperatura corporea durante la procedura chirurgica. Sono di tamponi di cotone e garze utilizzate per controllare l'emorragia. Preparare piccole dimensioni (<2mm ³⁾ pezzi di schiuma gel da utilizzare per la micro-emostasi e immergerlo in una soluzione salina sterile.
3. Ratto posto in una camera di induzione e anestetizzare con isoflurano (5% vaporizzato in ossigeno, portata 2.0 L / min). Rimuovere animale da camera alla tabella di preparazione e la barba una vasta area di pellicce di campo destinato chirurgico. Pulire con il 70% dall'inizio di alcol isopropilico al centro del campo e irradia verso l'esterno, seguito da lavaggio con la soluzione Polyhydroxidine (Xenodine) nello stesso modo. Ripetete questa sequenza di lava 3 volte.
4. Animale posto sulla barriera termica, coprire naso e bocca con cono inalazione, ridurre isoflurano al 3% e portata a 0,2 L / min. Fornire dose appropriata di antibiotico (ampicillina) per sotto-cutanei iniezione e analgesico (buprenorfina 0,05 mg / kg) per iniezione intramuscolare.
5. Il chirurgo si macchia le mani con una soluzione Xenodine e sciacquare con acqua. Un camice sterile chirurgica sarà montato sul chirurgo; mani saranno asciugati con un telo sterile e coperte con guanti sterili. Questa procedura è seguita per ogni procedura chirurgica descritta in questo testo.
6. Il coperchio che copre gli strumenti sterili verrà rimosso da un assistente e gli strumenti saranno disposti su una copertura sterile da parte del chirurgo.

2) un'asportazione del PN di promuovere la degenerazione

1. Con l'animale sdraiato su un lato fare una incisione linea retta dalla testa del femore verso il ginocchio, mantenendo in parallelo e circa 3 mm dal femore. Tagliare i muscoli superficiali del bicipite femorale lungo la stessa linea della incisione cutanea, per esporre il sottostante muscolo vasto laterale.
2. Utilizzando le forbici fare un piccolo taglio nel vasto laterale vicino al ginocchio ed estendere questo in su verso la testa del femore. Anche in questo caso con le forbici delicatamente separare il vasto laterale fino a quando i rami congiunti nervo tibiale e peroneale del nervo sciatico sono visualizzati (che corre parallela al femore).
3. Traccia questi rami verso la testa del femore fino al tronco principale del nervo sciatico è identificato. Appena sotto la biforcazione del nervo sciatico utilizzare una pinza sottile per separare accuratamente tessuto connettivo (epinevrio) che circondano il ramo del nervo tibiale (questo è il ramo più grande).
4. Una volta isolato scivolare un 6-0 legatura di seta intorno al nervo tibiale e stringere. Usare le forbici micro transetto il nervo rostrale alla legatura. Passare la linea di sutura attraverso il muscolo vasto laterale e legare in un nodo. Ciò fornirà una linea per una facile localizzazione del taglio del nervo tibiale quando il nervo è quello di essere raccolto 7-10 giorni dopo.
5. La degenerazione del nervo tibiale prima di innesto fornisce un ambiente più adatto per la crescita assonale di quanto non faccia una preparazione fresca nervo.
6. Chiudere il muscolo vasto laterale con 6-0 punti di sutura di seta. Chiudere il muscolo bicipite femorale con 6-0 punti di sutura di seta. Chiudere la pelle con clip ferita Michel. Spegnere il flusso di isoflurano, togliere il cono inalazione e animali luogo nel tenere in gabbia barriera termica e tornare alla gabbia a casa una volta che è vigile e attivo.

3) Eliminazione del segmento PN

1. Anestetizzare animali, barba e pulire il campo chirurgico inteso come descritto sopra (1,3). Posto l'animale sul barriera termica.
2. Rimuovere i clip ferita e separato incisione cutanea precedente. Tagliare sutura dei muscoli superficiali per esporre vasto laterale e tagliare sutura in questo muscolo.
3. Tracciare la linea di sutura per tagliare fine del nervo tibiale e rimuovere da sutura del nervo. Utilizzare una pinza sottile di sezionare epinevrio da una lunghezza 15 mm del nervo tibiale e tagliare questa parte distale. Rimuovere il segmento di nervo e immergerli in una soluzione salina sterile Hanks bilanciato.
4. Se questo è un esperimento di trapianto eterologo eutanasia dell'animale mediante iniezione intraperitoneale di Euthasol. Se questo è un esperimento di trapianto autologo, il muscolo della gamba e la pelle è chiuso, come descritto in 2.6) e l'animale preparato per lesioni del midollo spinale cervicale, come descritto di seguito.

4) lesioni cervicali emisezione e trapianto

Giorno 1

1. Anestetizzare animali, barba e pulire l'intensitàDED campo chirurgico come descritto in precedenza (1,3). Posto l'animale sul barriera termica. Somministrare antibiotici e analgesici come sopra (1,4).
2. Individuare la tacca occipitale e il prominente T2 processo dorsale vertebrale e fare un'incisione per tutta la lunghezza tra questi punti di riferimento esterni. Tagliare la linea mediana del muscolo trapezio e superficiale separare i muscoli sottostanti rhomboideus cervicale. Mantenere i muscoli a parte con l'inserimento di un diffusore.
3. I muscoli profondi sopraspinale dovrebbero essere tagliati dai processi dorsale vertebrale C4, C5 e C6. Rongeurs utilizzando eseguire una laminectomia parziale di C5 per esporre tutto il lato destro e la parte mediale del lato sinistro del midollo spinale. Utilizzare la vena dorsale prominente come un punto di riferimento per la linea mediana del midollo spinale.
4. Utilizzare un micro-bisturi lama o un 30 gauge a perforare la dura madre ed estendere l'incisione sopra il midollo spinale C5. Fai una piccola incisione nella subaracnoidea sottostante e pia madre.
5. Con un bicchiere tirato micro-cannula cominciano a aspirare il dorsale, lato destro del midollo spinale, con una leggera pressione e micro-pinze per separare i tessuti e facilitare la sua rimozione. Proseguire attraverso porzioni intermedie e ventrale del midollo spinale per creare una cavità 2 mm che è completo da dorsale a ventrale e dalla linea mediana per le meningi laterale.
6. Luogo salina imbevuti di schiuma gel nella cavità per raggiungere l'emostasi.
7. Rimuovere il segmento di nervo periferico dalla soluzione Hanks. Delicatamente la buccia epinevrio dal 3 millimetri prossimale del segmento di nervo e appose tal fine alla parete rostrale della cavità lesione emisezione. Fissare il segmento con 10-0 sutura attraverso il epinevrio alla dura madre, poi sutura la dura chiuso sopra l'estremità impiantato del trapianto.
8. L'innesto a sandwich tra 2 pezzi di membrana silastic (Biobrane) per la protezione e l'isolamento facile in un punto secondo momento. Posto a fianco della C6, C7 e T1 processi vertebrali. Non appose la parte distale dei nervi del midollo spinale o al tessuto muscolare.
9. Muscoli vicino a strati con sutura 4-0 e incisione cutanea chiudere con clip ferita.
10. Animale posto nel tenere in gabbia barriera termica e tornare alla gabbia a casa una volta che è vigile e attivo.

Giorno 21

11. Anestetizzare animali, barba e pulire il campo chirurgico inteso come descritto sopra (1,3). Mettere l'animale sulla barriera termica e amministrare antibiotici e analgesici come sopra (1,4). Tagliare suture superficiali per esporre silastic membrana che circonda l'innesto del nervo. Con attenzione libera la lunghezza del nervo dalla membrana silastic utilizzando una pinza sottile e forbici a molla e riflettono dal campo operatorio.
12. Eseguire una laminectomia parziale sul lato destro del processo C7 vertebrale. Perforare le meningi come sopra (4.4) e mediante aspirazione preparare un millimetro 1 ³ cavità dorsale quadrante lesione del midollo spinale C7. Utilizzare soluzione salina imbevuti di schiuma gel per ottenere l'emostasi e quindi sostituire con schiuma gel intriso condroitinasi ABC. Trattare il sito della lesione per 15 minuti, fornendo fresca condroitinasi intriso di schiuma gel ogni 5 minuti.
13. Coprire la lunghezza esterna del nervo innesto con membrana Silastic. Chiudere muscoli superficiali con suture 4-0 e l'incisione della pelle con clip ferita. Animale posto nel tenere in gabbia barriera termica e tornare alla gabbia a casa una volta che è vigile e attivo.

Giorno 23

14. Anestetizzare animali, barba e pulire il campo chirurgico inteso come descritto sopra (1,3). Mettere l'animale sulla barriera termica e amministrare antibiotici e analgesici come sopra (1,4). Tagliare suture superficiali per esporre silastic membrana che circonda l'innesto del nervo. Non disturbare l'innesto, ma piuttosto esporre il sito dell'innesto C7 e utilizzare una siringa Hamilton con cannula di vetro tirato a microinject 1ml di condroitinasi ABC sul lato destro del midollo spinale di circa 1 mm distalmente alla apposizione di innesto di midollo spinale.
15. Delicatamente la buccia epinevrio dal 2 millimetri distale del segmento di nervo e appose tal fine alla cavità lesione C7. Fissare il segmento con 10-0 sutura attraverso il epinevrio alla dura madre.
16. Chiudere muscoli superficiali con suture 4-0 e l'incisione della pelle con clip ferita. Animale posto nel tenere in gabbia barriera termica e tornare alla gabbia a casa una volta che è vigile e attivo.

5) registrazione elettrofisiologica del potenziale d'azione nel trapianto e distale del midollo spinale

1. Per determinare se l'attività elettrica è trasmessa attraverso gli assoni che hanno rigenerato nel PNG dobbiamo prima esporre e isolare l'innesto. Particolare cura deve essere presa durante questa procedura per evitare di danneggiare fisicamente l'innesto ed è qui che l'uso della membrana Silastic dopo il posizionamento del trapianto è importante. Anestetizzare animali, barba e pulire il campo chirurgico inteso come descritto sopra (1,3). ° postoanimali e sulla barriera termica.
2. Dopo aver aperto la pelle e che separa i muscoli superficiali, strisce di membrana Silastic siano identificati e sezionato con cura senza l'innesto.
3. Rongeurs utilizzando rimuovere il processo dorsale vertebrale immediatamente rostrale e caudale ai siti midollo spinale PNG-apposizione. Fare attenzione a non disturbare l'innesto troppo durante questo approccio. Fai una fessura della dura madre a entrambi i livelli.
4. Rostrale circa 1cm a dell'innesto-C5 sito midollo spinale apposizione inserire un solo cavo (platino-iridio mix) elettrodo stimolante nel midollo spinale omolaterale alla lesione, ad una profondità di circa 1mm. Sollevare con cautela la parte centrale del trapianto su un elettrodo bipolare agganciato. Fornire impulsi singoli stimolante 10μA con durata 100μsec e determinare se ci sono potenziali d'azione che viaggiano attraverso gli assoni che hanno rigenerato nel trapianto.
5. Invertire le connessioni e la posizione dei fili in modo che l'elettrodo collegato diventa l'elettrodo stimolante e il filo singolo viene inserito nel midollo spinale distale al apposizione di PNG al midollo spinale e il tentativo di registrare i potenziali d'azione nel midollo spinale.
6. Alla fine dell'esperimento fornire un treno di 1mA stimoli per la durata 100μsec a 50Hz, per un totale di 1 ora. Eutanasia degli animali 1 ora dopo, profumato con il 4% paraformaldeide e tessuto del midollo spinale processo per la rilevazione di immunocitochimica cFos nei neuroni che sono stati attivati ​​da assoni rigenerati in PNG.

6) l'etichettatura retrogrado dei neuroni che rigenerare gli assoni in PNG ed etichettatura anterograda degli assoni che rigenerano indietro nel midollo spinale

1. Per gli animali non testati da misure elettrofisiologiche è possibile identificare la fonte di assoni che crescono nel trapianto e il corso della loro terminazione nel midollo spinale. Anestetizzare animali, barba e pulire il campo chirurgico inteso come descritto sopra (1,3). Mettere l'animale sulla barriera termica e di esporre il PNG, come descritto in 6.1.
2. Usare le forbici per tagliare micro attraverso l'innesto nel suo punto centrale e nastri indietro il epinevrio dalle estremità tagliate del trapianto. Riflettono le estremità tagliate distanza gli uni dagli altri e laici ognuno su un foglio di parafilm.
3. Posizionare un tampone di schiuma gel imbevuto di True Blue alla fine taglio prossimale ai neuroni etichetta che ha contribuito un assone al PNG. Posizionare un tampone di schiuma gel imbevuto di biotinilato destrano ammina (BDA) alla fine taglio distale degli assoni etichetta che si estendono dalla parte posteriore del trapianto nel midollo spinale.
4. Eutanasia degli animali 3-4d dopo, profumato con il 4% paraformaldeide e il cervello di processo e del midollo spinale sezioni di tessuto per microscopia a fluorescenza per True neuroni Blu etichettati o per istochimica BDA per assoni etichettati.

7) trauma toracico resezione completa e il trapianto

Ciò offre un approccio alternativo al modello cervicale lesioni emisezione sopra. Ecco una più grave, lesioni bilaterali è prodotto e segmenti di nervo periferico sono posti nella cavità lesione di estendersi e ceppi rostrale e caudale del midollo spinale danneggiato.

Giorno 1

1. Anestetizzare animali, barba e pulire il campo chirurgico inteso come descritto sopra (1,3). Posto l'animale sul barriera termica. Somministrare antibiotici e analgesici come sopra (1,4).
2. Identificare T12 livello vertebrale nel punto di inserzione di costola. L'incisione cutanea da questo punto rostrale sui processi vertebrale T11, T10 e T9. Tagliare fascia superficiale attraverso muscoli sopraspinale attaccati a questi tre processi.
3. Eseguire laminectomia completa di T10 processo vertebrale (T12 sovrastante segmento del midollo spinale). Utilizzare un micro-bisturi lama o un 30 gauge a perforare la dura mater ed estendere l'incisione sopra il midollo spinale T12. Fai una piccola incisione nella subaracnoidea sottostante e pia madre.
4. Con un bicchiere tirato micro-cannula cominciano a aspirare il midollo spinale T12 bilateralmente, con una leggera pressione e micro-pinze per separare i tessuti e facilitare la sua rimozione. Proseguire attraverso porzioni intermedie e ventrale del midollo spinale per creare una cavità 3 mm di lunghezza che è dorsale e ventrale completo tra le meningi laterale.
5. Utilizzare soluzione salina imbevuti di schiuma gel per ottenere l'emostasi e quindi sostituire con schiuma gel intriso condroitinasi ABC. Trattare il sito della lesione per 15 minuti, fornendo fresca condroitinasi intriso di schiuma gel ogni 5 minuti.
6. Rimuovere il segmento di nervo periferico dalla soluzione del Hank s. Delicatamente riflettono la epinevrio dal 4 millimetri prossimale del segmento di nervo e tagliare una lunghezza per adattarsi perfettamente tra i ceppi rostrale e caudale di un lato del midollo spinale. Posizionare un secondo segmento lungo il primo segmento innestati, apposto sul lato opposto del midollo spinale. Sutura della dura chiuso negli innesti impiantati e copertura dura con un piccolopezzo di membrana silastic.
7. Muscoli vicino a strati con sutura 4-0 e incisione cutanea chiudere con clip ferita.
8. Animale posto nel tenere in gabbia barriera termica e tornare alla gabbia a casa una volta che è vigile e attivo.

3 ° giorno

9. Anestetizzare animali, barba e pulire il campo chirurgico inteso come descritto sopra (1,3). Mettere l'animale sulla barriera termica e amministrare antibiotici e analgesici come sopra (1,4). Tagliare suture superficiali per esporre membrana silastic insiste sul sito di innesto. Non disturbare l'innesto, ma piuttosto esporre il midollo spinale caudale per l'innesto e utilizzare una siringa Hamilton con cannula di vetro tirato a microinject 1ml di condroitinasi ABC in ogni lato del midollo spinale di circa 1 mm distalmente alla apposizione di innesto di midollo spinale.
10. Chiudere muscoli superficiali con suture 4-0 e l'incisione della pelle con clip ferita. Animale posto nel tenere in gabbia barriera termica e tornare alla gabbia a casa una volta che è vigile e attivo. Eseguire la stimolazione elettrofisiologica e la registrazione e l'etichettatura tracciante, come descritto in 5) e 6) di cui sopra.

8) Risultati Rappresentante

Quando questa procedura è ottimizzato il segmento di nervo periferico si integra strettamente con il midollo spinale ospite. Ascendenti e discendenti degli assoni spinali entrerà l'innesto, crescere in un parallelo relativamente rettilineo della lunghezza dell'innesto e continuano fino alla fine distale dell'innesto ad una velocità di circa 1 mm al giorno. Una volta raggiunta l'estremità distale, gli assoni penetra il midollo spinale adiacente condroitinasi se è stato usato per rimuovere i proteoglicani inibitoria dal tessuto cicatriziale circostante. Connettività funzionale sarà determinata dalla rilevazione elettrofisiologici e immunocitochimica di una risposta da parte dei neuroni del midollo spinale alla stimolazione degli assoni all'interno del trapianto. Correlazione anatomica per il recupero funzionale sarà valutata tracciando il numero e la lunghezza degli assoni che hanno esteso al di là del nuovo innesto di nervo nel midollo spinale.

Discussione

1. Per la riproducibilità dell'esperimento, è importante che il livello di lesione del midollo spinale essere coerente da animale ad animale. Pertanto è fondamentale che il processo appropriato per laminectomia vertebrale essere identificati. Perché stiamo usando una emisezione o lesione modello transezione per questo studio non vi è alcuna ambiguità circa le dimensioni della lesione o se specifici tratti della colonna vertebrale sono stati feriti o risparmiati.
2. E 'necessario che il nervo periferico essere pre-dege...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 silk suture	ArosSurgical	T5A10N10
6-0 silk suture	McKesson	2693
Ampicillin	McKesson	483549
Antibody to cFos	Sigma-Aldrich	F7799
Biotinylated dextran Amine	Invitrogen	D7135
Buprenorphin (.3mg/ml)	McKesson	12496075701
Chondroitinase ABC	Associates of Cape Cod	100332-1A
Euthasol	Webster Veterinary	07-805-9296
Hanks Balanced Salt Solution	Cellgro	21-021-CV
Isoflurane	Henry Schein	209-1966
Michel Wound Clips	Fine Science Tools	12040-02
Neurotrace Kit	Invitrogen	N7167
True Blue	Sigma-Aldrich	T5891
Xenodine	Webster Veterinary	92201
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools
Forced Exercise Wheel	Lafayette Instruments
TreadScan System	Clever System
Infinite Horizon Impact Device	Precision Systems and Instrumentation
Magnetic Stimulation Device	Magstim