1) Подготовка к микроскопической хирургии
- Хирургических станция должна быть чистой и продезинфицировать с разбавленным раствором отбеливателя перед изложением инструментов и вспомогательных материалов. Инструменты будут автоклавного 1 день до операции и хранится в стерильный контейнер. Включите Горячие Стерилизатор бисера (Fine Инструменты наук) используется для удаления патогенных микроорганизмов и микробных загрязнений из инструментов между процедурами на различных животных.
- Подключите тепловой барьер используется для поддержания температуры тела во время хирургического вмешательства. Изложить ватные тампоны и марлю колодки используются для остановки кровотечения. Подготовка малых (<2мм 3) кусков пены гель для использования в микро-гемостаза и погрузиться в стерильный физиологический раствор.
- Место крыс в камере индукции и анестезию с изофлюрана (5% испаряется в атмосфере кислорода, расход 2,0 л / мин). Удалить животных от камеры с подготовкой стола и бриться широкую область меха от предполагаемого операционного поля. Протрите 70% изопропиловый спирт начало в центре поля и излучающих наружу, а затем протереть Polyhydroxidine Решение (Xenodine) в том же порядке. Повторите эту последовательность моет 3 раза.
- Место животное на тепловой барьер, накрыть нос и рот с вдыхании конус, уменьшить изофлюрана до 3% и расход до 0,2 л / мин. Доставить соответствующую дозу антибиотиков (ампициллин) путем подкожной инъекции и анальгетик (бупренорфин 0,05 мг / кг) внутримышечно.
- Хирург скрабом руки с Xenodine раствор и ополосните водой. Хирургический стерильный халат будут установлены на хирурга, руки будут сушат стерильным полотенцем и покрывают стерильными перчатками. Эта процедура выполняется для каждой хирургической процедуры, описанные в этом тексте.
- Крышка покрытие стерильные инструменты будут удалены помощником и инструменты будут выложены на стерильной покрытия хирурга.
2) Перерезка PN способствовать дегенерации
- С животного лежа на боку сделать прямо разрез линии от головки бедренной кости к колену, держа параллельно и примерно 3 мм от бедра. Избавьтесь поверхностные мышцы бицепса бедра вдоль одной линии разрез кожи, вскрыть основные vastus латеральной мышцы.
- Использование ножниц делают небольшой разрез в латеральной vastus возле колена и распространить это вверх, к голове бедренной кости. Опять же с ножницами аккуратно отделить vastus латеральной до соединенных большеберцового и малоберцового нерва ветвей седалищного нерва визуализируются (параллельно бедренной кости).
- Трассировка этих отраслей в направлении головки бедренной кости до основного ствола седалищного нерва выявлено. Чуть ниже бифуркации седалищного нерва использования тонких щипцов тщательно отдельной соединительной ткани (эпиневрий), окружающих большеберцовой ветви нерва (это больше филиал).
- После выделения скольжения 6-0 шелковые лигатуры вокруг большеберцового нерва и затянуть. Использование микро-ножницы для разреза нерва ростральнее вязью. Pass шов через мышцу vastus латеральной и галстук в узел. Это обеспечит линии для удобного расположения обрезанный конец большеберцового нерва, когда нерв должен быть собран 7-10 дней позже.
- Вырождение большеберцового нерва до прививки обеспечивает среду, больше подходит для рост аксонов, чем свежие подготовки нерва.
- Закрыть мышц vastus латеральной с 6-0 швов шелка. Закрыть двуглавой мышцы бедра с 6-0 швов шелка. Закрыть кожи с зажимами Мишель раны. Выключите поток изофлюрана, удалите конус вдыхания носом и поместить животное в клетке на проведение тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.
3) Удаление сегмента PN
- Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер.
- Удалить раны клипов и отдельных предыдущего разреза кожи. Избавьтесь от шва поверхностных мышц подвергать vastus латеральной и прорезать шов в этой мышцы.
- Трассировка шов, чтобы сократить конца большеберцовой нерва и удалить из шва нерва. Используйте тонкий пинцет, чтобы рассекать эпиневрий от 15 мм длина голени нерв и прорубить эту дистального конца. Удалить сегмент нерва и погрузиться в стерильных Хэнкс сбалансированный солевой раствор.
- Если это гетерологичных эксперимент трансплантата эвтаназии животного при введении препарата в Euthasol. Если это аутологичных трансплантата эксперимент, ноги мышц и кожи закрыта, как описано в 2.6), подготовленных для животных шейки травмы спинного мозга, как описано ниже.
4) шейки травмы гемисекция и трансплантации
День 1
- Анестезию животного, бриться и чистить интенсивностиДед операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер. Администрирование антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4).
- Найдите затылочной выемку и видные T2 спинной позвоночного процесс и сделать надрез по всей длине между этими внешними ориентирами. Избавьтесь от средней линии поверхностных трапециевидной мышцы и отдельные основных шейных мышц ромбовидной. Держите мышцы друг от друга, вставляя спредера.
- Глубокие супраспинальных мышцы должны быть вырезаны из спинной позвоночного процессов C4, C5 и C6. Использование rongeurs выполнять частичный ламинэктомии С5 разоблачить всю правую сторону и медиальной части левой части спинного мозга. Используйте видных спинной вены в качестве ориентира для средней линии спинной мозг.
- Использование микро-лезвие скальпеля или 30 иглу, чтобы проколоть твердую мозговую оболочку и расширить разрез над C5 спинного мозга. Сделайте небольшой надрез в базовой субарахноидальное и мягкой мозговой оболочки.
- С вытащил стекло микро-канюли для аспирации начинать спинного, правую сторону спинного мозга, используя мягкое давление и микро-щипцы для разделения тканей и облегчить его удаление. Продолжите через промежуточные и вентральной части спинного мозга, чтобы создать 2 мм в длину полости, что является полным от спины к брюху и от средней линии на боковых мозговых оболочек.
- Место солевой пропитанный гелем пены в полость для достижения гемостаза.
- Удалить сегмент периферического нерва из раствора Хэнкса. Аккуратно очистите эпиневрий от проксимальных 3 мм сегмента нерва и сопоставлять этой целью ростральной стенки полости поражения гемисекция. Безопасные сегмент с 10-0 шва через эпиневрий к твердой мозговой оболочке, то шов оболочки сомкнулись над имплантированным конце трансплантата.
- Сэндвич трансплантат между 2 кусочка силиконовой мембраной (Biobrane) для защиты и легкой изоляции на более позднем этапе. Место рядом с С6, С7 и Т1 позвоночного процессов. Не сопоставлять дистального конца нерва спинного мозга или мышечной ткани.
- Закрыть мышцы в слоях с 4-0 шва и закрыть разрез кожи с раной клипов.
- Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.
День 21
- Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер и администрировать антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4). Избавьтесь поверхностные швы, чтобы разоблачить силиконовой мембраны, окружающей нерв трансплантата. Тщательно свободной длине нерва из силиконовой мембраны с использованием тонких щипцов и весной ножницы и отражаться от операционного поля.
- Осуществить частичный ламинэктомии на правой стороне C7 позвоночного процесса. Пирс оболочек мозга, что и выше (4,4) и стремлением подготовить 1 мм 3 спинной полости поражения квадрант C7 спинного мозга. Используйте солевые пропитанный гелем пена для достижения гемостаза, а затем заменить гелем пены пропитанный хондроитиназой ABC. Лечить поражения сайта в течение 15 минут, обеспечивая свежий хондроитиназой пропитанный гелем пеной каждые 5 минут.
- Обложка внешней длине нерва трансплантата с Silastic мембраны. Закрыть поверхностные мышцы 4-0 швов и разрез кожи с раной клипов. Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.
День 23
- Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер и администрировать антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4). Избавьтесь поверхностные швы, чтобы разоблачить силиконовой мембраны, окружающей нерв трансплантата. Не беспокоить трансплантата, а подвергать сайт C7 взяточничество и использование шприца Гамильтона с вытащил стеклянную канюлю microinject 1 мкл из хондроитиназой ABC в правую сторону спинного мозга примерно 1 мм дистальнее присоединением трансплантата в спинной мозг.
- Аккуратно очистите эпиневрий от дистальной 2мм сегмента нерва и сопоставлять этой целью поражения полости C7. Безопасные сегмент с 10-0 шва через эпиневрий к твердой мозговой оболочки.
- Закрыть поверхностные мышцы 4-0 швов и разрез кожи с раной клипов. Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.
5) Электрофизиологические записи потенциала действия у привитых и дистальных спинного мозга
- Чтобы определить, электрическая активность передается через аксоны, которые переродились в PNG мы должны сначала выявить и изолировать трансплантата. Особое внимание должно быть принято во время этой процедуры, чтобы избежать физического повреждения трансплантата и это, когда использование Silastic мембраны после размещения трансплантата имеет важное значение. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место йэлектронной животное на тепловой барьер.
- После открытия кожи и отделение поверхностных мышц, Silastic полос мембраны определить и тщательно расчлененный без взяток.
- Использование rongeurs удалить спинной позвоночного процесс немедленно ростральной и каудально по отношению к PNG-сайтов спинного шнур присоединение. Будьте осторожны, чтобы не нарушить трансплантат слишком много в этот подход. Сделайте разрез в твердой мозговой оболочки на обоих уровнях.
- Около 1 см ростральнее C5 трансплантат спинного сайт присоединение шнура вставить один провод (платина-иридий смеси) раздражающего электрода в спинной мозг ипсилатерального к поражению, на глубину около 1 мм. Аккуратно поднимите центральную часть трансплантата на биполярных подключен электрод. Обеспечить единый стимулирующих импульсов длительностью 10 мкА 100μsec и определить, если Есть потенциалов действия путешествия через аксоны, которые переродились в трансплантат.
- Переключатель и размещения проводов, чтобы подключить электрод становится стимулирующим электродом и один провод вставляется в спинном мозге дистальнее присоединением PNG для спинного мозга и попытке записи потенциалов действия в спинном мозге.
- В конце эксперимента обеспечивают поезда 1мА стимулы для продолжительности 100μsec при 50 Гц, в общей сложности на 1 час. Эвтаназии животных 1 час позже, заливать с 4% параформальдегида и обработки ткани спинного шнур для иммуноцитохимического обнаружения финансовых директоров в нейронах, которые были активированы регенерации аксонов в PNG.
6) Ретроградная маркировки нейронов, которые регенерации аксонов в PNG и антероградной маркировки регенерации аксонов, что обратно в спинной мозг
- Для животных не проверено электрофизиологических меры можно определить источник аксоны, которые растут в взяточничество и ходе их окончания в спинном мозге. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер и разоблачить PNG, как описано в 6.1 выше.
- Использование микро-ножницы, чтобы прорваться через трансплантат на середине пути и полосы обратно эпиневрий из разреза концов трансплантата. Отражение вырезать концы друг от друга и положить каждый на отдельном листе парафильмом.
- Место тампон из геля пены пропитанный True Blue на проксимальном конце сократить на этикетке нейронов, которые способствовали аксону к PNG. Место тампон из геля пены пропитанные биотинилированного декстран амин (BDA) на дистальном конце сократить на этикетке аксоны, которые простираются от трансплантата обратно в спинной мозг.
- Эвтаназии животных 3-4d позже, заливать с 4% параформальдегида и процесс головного и спинного мозга срезах тканей для флуоресцентной микроскопии для True Blue меченых нейронов или для BDA гистохимии для помеченных аксонов.
7) полное повреждение грудной перерезки и трансплантации
Это предлагает альтернативный подход к модели травмы шейки гемисекция выше. Здесь более серьезные, двусторонние травмы производится и сегментах периферического нерва помещаются в поражении полости, чтобы охватить и ростральной и хвостовой пни поврежденный спинной мозг.
День 1
- Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер. Администрирование антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4).
- Определить T12 позвоночного уровня в точке вставки последнего ребра. Сделайте разрез кожи с этой точки ростральной более позвоночного процессов T11, T10 и T9. Избавьтесь от поверхностной фасции через супраспинальных мышц при этих трех процессов.
- Выполнить полный ламинэктомии Т10 позвоночного процесс (вышележащих T12 сегмента позвоночника мозга). Использование микро-лезвие скальпеля или 30 иглу, чтобы проколоть мозговую оболочку и расширить разрез более Т12 спинного мозга. Сделайте небольшой надрез в базовой субарахноидальное и мягкой мозговой оболочки.
- С вытащил стекло микро-канюли для аспирации начинать T12 спинного мозга двустороннем, используя мягкое давление и микро-щипцы для разделения тканей и облегчить его удаление. Продолжите через промежуточные и вентральной части спинного мозга для создания 3 мм длиной полости, что является полным спины к брюху, а также между боковыми мозговых оболочек.
- Используйте солевые пропитанный гелем пена для достижения гемостаза, а затем заменить гелем пены пропитанный хондроитиназой ABC. Лечить поражения сайта в течение 15 минут, обеспечивая свежий хондроитиназой пропитанный гелем пеной каждые 5 минут.
- Удалить сегмент периферического нерва из раствора с Хэнком. Аккуратно отражают эпиневрий от проксимальных 4мм сегмента нерва и сократить длину уютно соответствия между ростральной и хвостовой пни одну сторону спинного мозга. Место второй сегмент наряду с первым привитым сегменте, соединенный с другой стороны спинного мозга. Шовный оболочки закрыты более имплантированных графтов и крышка оболочки с небольшимкусок силиконовой оболочкой.
- Закрыть мышцы в слоях с 4-0 шва и закрыть разрез кожи с раной клипов.
- Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.
День 3
- Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер и администрировать антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4). Избавьтесь поверхностные швы, чтобы разоблачить силиконовой мембраны вышележащих трансплантата сайта. Не беспокоить трансплантата, а подвергать спинного мозга каудально взяточничество и использование шприца Гамильтона с вытащил стеклянную канюлю microinject 1 мкл из хондроитиназой ABC в каждую сторону спинного мозга примерно 1 мм дистальнее присоединением трансплантата в спинной мозг.
- Закрыть поверхностные мышцы 4-0 швов и разрез кожи с раной клипов. Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно. Выполните электрофизиологических стимуляции и записи и трассирующими маркировки, как описано в 5) и 6).
8) представитель Результаты
Когда эта процедура оптимизирована периферических нервов сегмент будет тесно интегрироваться с принимающей спинного мозга. Восходящие и нисходящие аксоны спинного войдет трансплантата, растут в относительно прямой линии, параллельной длина трансплантата и распространяется на дистальном конце трансплантата со скоростью примерно 1 мм в день. По достижении дистального конца, аксоны проникают смежных спинного мозга, если хондроитиназой была использована для удаления тормозных протеогликанов из окружающей рубцовой ткани. Функциональные связи будет определяться электрофизиологических и иммуноцитохимического обнаружения ответ нейронов спинного шнур к стимуляции аксонов в трансплантата. Анатомические корреляции для восстановления функций будет оцениваться путем отслеживания количества и длины аксонов, которые вышли за рамки нерва трансплантата обратно в спинной мозг.