Periferik Sinir Aşılama ve Matrix Modülasyon birleştiren Yaralı Rat Spinal Kord Onarım

Özet

Spinal kord travması sonucu beyin ile iletişimi bozar. Kayıp bağlantısı geri yüklemek için uzun mesafe büyümeyi teşvik etmek için inhibitör molekülleri kaldırmak için nörotrofik faktörler ve matris-modüle enzimler ile kombinasyon halinde rejenere lifler için altyapısını sağlamak üzere bir periferik sinir grefti kullanmaktadır.

Özet

Spinal kord (SCI) travmatik yaralanma nöronların ölümü, motor ve duyusal sinir lifi (akson) yolları ve beyin ile iletişimi kesintiye uğraması bozulmasına neden olur. Araştırmamızın amaçlarından biri lezyon sitesi üzerinden bağlantı geri akson rejenerasyonu teşvik etmektir. Bunu başarmak için, periferik sinir segmentleri siyatik sinir ya da omurilik hasarlı uçları arasında doğrudan yerleştirilir veya lezyon çapında bir köprü oluşturmak için kullanılır tekniği greft (PN) geliştirdi. Diğer nöral dokuların nakli ile karşılaştırıldığında bu yaklaşım birçok avantaj vardır; rejenere aksonları belirli bir hedef alanına doğru yönlendirilebilir, rejenere akson sayısı ve kaynak kolayca izleme teknikleri tarafından belirlenir, greft ölçmek için elektrofizyolojik deneyleri için kullanılan olabilir greft aksonlar fonksiyonel iyileşme ile ilişkili olduğunu ve bir otolog sinir greft reddi olasılığını azaltmak için kullanmak mümkündür. Laboratuarımızda biz karşılaştırılabilir sonuçlar hem otolog (verici ve alıcı aynı hayvan) ve heterolog (bağışçı ve alıcı farklı hayvanların) greftler gerçekleştirdik. Bu yaklaşım, akut hem de kronik yaralanma durumlarında başarıyla kullanılmaktadır. PN greft distal sonuna ulaşmak rejenere aksonları genellikle omuriliğe geri genişletmek için başarısız, bu yüzden chondroitinase, SCI alanı çevreleyen bağ dokusu ile ilişkili inhibitör molekülleri düşmeye microinjections kullanabilirsiniz. Aynı zamanda ekzojen büyüme ve trofik molekülleri sağlayan omurilik içine uzun mesafe aksonal regrowth teşvik bulduk. Birkaç ay transplantasyonu sonrası, spinal kord yaralı hayvanlar kurtarma fonksiyonu değerlendirmek için, anatomik, davranışsal ve elektrofizyolojik testler çeşitli gerçekleştirin. Bu deneysel bir yaklaşım yaralanma farklı düzeylerde ve farklı türlerde (fare, sıçan ve kedi), birkaç spinal kord yaralanması modelleri başarılı bir şekilde kullanılır olmuştur. Önemlisi, periferik sinir grefti yaklaşım, akut ve kronik yaralı nöronlar tarafından rejenerasyonu teşvik etkilidir.

Protokol

1) mikroskobik cerrahi için hazırlığı

1. Cerrahi istasyonu, temiz ve aletleri ve aksesuar malzemeleri önce sulandırılmış çamaşır suyu çözeltisi ile filtrelenmiyor gerekir. Araçların 1 gün cerrahi öncesi otoklava ve steril bir kap içinde saklanan olacak. Farklı hayvanların prosedürleri arasındaki araçlardan patojenler ve mikrobik kirleticiler kaldırmak için kullanılan Hot Boncuk Sterilizatör (Güzel Bilim Araçları) açın.
2. Termal bariyer takın, cerrahi işlem sırasında vücut ısısını korumak için kullanılır. Kanamayı kontrol etmek için kullanılan pamuklu ve gazlı bez ayarlayın. Steril salin solüsyonu mikro-hemostaz ve batırmayın için kullanılacak Jel Köpük küçük (<2mm ³⁾ adet hazırlayın.
3. İsofluranın indüksiyon odası ve anestezi Yeri sıçan (oksijen buharlaştırılarak,% 5, debisi 2.0 L / dk). Odasından hazırlama tablo hayvan çıkarın ve kürk amaçlanan cerrahi alanında geniş bir alanda tıraş. Alanının merkezinde% 70 izopropil alkol başında ile silin ve aynı şekilde Polyhydroxidine Çözüm (Xenodine) ile ovma, dışa doğru yayılan. Yıkar 3 kez tekrarlayın.
4. Termal bariyer, kapak burun ve ağız ile inhalasyon koni Yeri hayvan,% 3 ve 0.2 L / dak akış hızı İsofluranın azaltır. Intramüsküler cilt altı enjeksiyonu ve analjezik (Buprenorfin 0.05 mg / kg) uygun doz antibiyotik (ampisilin) ​​sunun.
5. Cerrah Xenodine çözüm ellerini fırçalayın ve su ile durulayın. Steril cerrahi önlük cerrah üzerine monte edilebilir; eller steril bir havlu ile kurutulur ve steril eldiven ile kaplı olacak. Bu prosedür, bu metinde açıklanan her bir cerrahi işlem için takip eder.
6. Steril aletleri kapsayan kapağı bir asistan tarafından silinecektir ve araçlar cerrah tarafından steril bir örtü üzerinde atılacak.

2) PN transeksiyonu dejenerasyon teşvik etmek

1. Hayvan yan yatarken düz bir çizgi paralel tutarak diz doğru femur başı kesi ve femur yaklaşık 3mm olun. Altta yatan vastus lateralis kası ortaya çıkarmak için, cilt insizyonu ile aynı hat boyunca yüzeysel biceps femoris kasları kesti.
2. Kullanımı makas vastus lateralis diz yakınındaki küçük bir kesim yapmak ve femur başının doğru bu kadar uzanır. Yine makas ile siyatik sinir yapışık tibial ve peroneal sinir dallarının kadar yavaşça vastus lateralis ayrı görselleştirildiği (femur paralel çalışan).
3. Siyatik sinirin ana gövde tespit edilene kadar bu dalların femur başı doğru iz. Siyatik sinir çatallanma altında ince forseps (bu daha geniş dalıdır), tibial sinir dalı çevreleyen bağ dokusu (epineurium) dikkatli bir şekilde ayırmak için kullanın.
4. Bir kez izole tibial sinir etrafında 6-0 ipek ligatür kayma ve sıkın. Ligatür rostral sinir transeksiyonu için mikro makas kullanın. Vastus lateralis kası ile dikiş hattı Pass ve kapalı bir düğüm kravat. Sinir 7-10 gün sonra hasat edilebilir olduğunda bu tibial sinir kesme sonu kolay konumu için bir satır sağlayacaktır.
5. Aksonal büyüme için yeni bir sinir hazırlık daha önce aşılama tibial sinir dejenerasyonu daha uygun bir ortam sağlar.
6. 6-0 ipekle vastus lateralis kası kapatın. 6-0 ipek sütür ile biseps femoris kas kapatın. Michel yara klipler ile cilt kapatın. İsofluranın, akış kapatın, termal bariyer kafesi tutan Solunduğunda burun konisi yer ve hayvan kaldırmak ve uyanık ve aktif bir kez evde kafes dönmek.

3) Kaldırma PN segmenti

1. Yukarıda açıklandığı gibi amaçlanan cerrahi alan (1.3) tıraş ve temiz, hayvan anestezisi. Termal bariyer hayvan yerleştirin.
2. Yara klipleri ve ayrı önceki cilt insizyonu çıkarın. Vastus lateralis maruz yüzeysel kas dikiş kesti ve bu kas dikiş kesti.
3. Tibial sinir ucu ve sinir dikiş kaldırmak için dikiş çizgi çiziniz. Tibial sinir 15 mm uzunluğu epineurium incelemek ve bu distal sonuna kadar kesmek için ince forseps kullanın. Steril Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi sinir segment ve batırmayın çıkarın.
4. Bu ise bir heterolog greft deney Euthasol intraperitoneal hayvan euthanize. Bu aşağıda anlatıldığı gibi bir otolog greft deney, bacak kas ve 2.6 'da açıklandığı gibi cilt kapalı) ve servikal spinal kord yaralanması için hazırlanan hayvan.

4) Servikal hemisection yaralanma ve transplantasyon

1. Gün

1. Hayvan anestezisi, tıraş ve kütüphane olduğu söylenebilir temizYukarıda açıklandığı gibi ded cerrahi alan (1.3). Termal bariyer hayvan yerleştirin. Antibiyotik ve analjezikler (1.4) yukarıdaki gibi yönetin.
2. Oksipital çentik ve önde gelen T2 dorsal vertebra süreci bulun ve bu dış simge arasında tam uzunlukta bir kesi yapmak. Yüzeysel trapezius kas orta hat kesti ve altta yatan servikal rhomboideus kasları ayrı. Dışında bir dağıtıcı ekleyerek kasları tutun.
3. Derin supraspinal kasları dorsal vertebra süreçleri, C4, C5 ve C6 kesilmelidir. Kullanarak, tüm sağ tarafında ve omuriliğin sol tarafında medial kısmını açığa çıkarmak için rongeurs C5 kısmi laminektomi gerçekleştirin. Spinal kord orta hat için bir dönüm noktası olarak belirgin bir dorsal ven kullanın.
4. Delmek duramater, bir mikro-neşter bıçak ya da 30 iğne kullanın ve C5 omurilik üzerinde kesi uzatmak. Yatan subaraknoid ve pia mater küçük bir kesi olun.
5. Çekilmiş bir cam mikro-kanül, doku ayrı ve kaldırılmasını kolaylaştırmak için hafif basınç ve mikro-forseps kullanarak, omurilik dorsal, sağ tarafında aspire başlar. Dorsalden ventral ve lateral orta hat meninksler için tam 2 mm uzunluğunda bir kavite oluşturmak için spinal kord orta ve ventral kısımları ile devam edin.
6. Hemostaz sağlamak için tuzlu bulanmış jel köpük boşluğuna yerleştirin.
7. Hanks çözüm periferik sinir segmentinde çıkarın. Proksimal sinir segmentinde 3mm ve epineurium hafifçe kabuğu hemisection lezyon boşluğuna rostral duvara Bu amaçla appose. Duramater epineurium ile 10-0 sütür ile segmentinde Güvenli, daha sonra dura greft implante ucuna kapalı sütür.
8. Sandviç, daha sonraki bir zaman noktasında koruma ve kolay izolasyon için silastik membran (Biobrane) 2 adet arasında greft. C6, C7 ve T1 vertebra süreçleri yanında koyun. Distal sinir ucu, omurilik ya da kas dokusu appose etmeyin.
9. 4-0 dikiş ve yara klipleri ile yakın cilt insizyonu ile katmanları kapatın kasları.
10. Uyanık ve aktif bir kez termal bariyer ve dönüş evde kafes kafes tutarak yerleştirin hayvan.

21. gün

11. Yukarıda açıklandığı gibi amaçlanan cerrahi alan (1.3) tıraş ve temiz, hayvan anestezisi. Termal bariyer hayvan koyun ve antibiyotik ve analjezikler (1.4) yukarıdaki gibi yönetmek. Sinir grefti çevreleyen silastik membran maruz yüzeysel sütür kesin. Ince forseps ve yaylı makas ve cerrahi alanında yansıtmak kullanarak silastik membran sinir dikkatlice uzunluğu.
12. C7 vertebral sürecinin sağ tarafında kısmi laminektomi gerçekleştirin. Pierce, yukarıdaki gibi meninksler (4.4) ve aspirasyon C7 spinal kord, 1 ^mm 3 dorsal kadranda lezyon boşluğuna hazırlar . Hemostaz elde etmek ve sonra chondroitinase ABC ile ıslatılmış jel köpük yerine tuzlu su bulanmış jel köpük kullanın. 15 dakika boyunca her 5 dakikada bir chondroitinase batırılmış taze jel köpük sağlayarak, lezyon yerinde davranın.
13. Silastik zarı ile sinir grefti dış uzunluğu Kapak. 4-0 sütür ve yara klipler ile cilt insizyonu ile yüzeysel kasları kapatın. Uyanık ve aktif bir kez termal bariyer ve dönüş evde kafes kafes tutarak yerleştirin hayvan.

Gün 23

14. Yukarıda açıklandığı gibi amaçlanan cerrahi alan (1.3) tıraş ve temiz, hayvan anestezisi. Termal bariyer hayvan koyun ve antibiyotik ve analjezikler (1.4) yukarıdaki gibi yönetmek. Sinir grefti çevreleyen silastik membran maruz yüzeysel sütür kesin. Greft rahatsız değil, C7 greft sitesinde teşhir etmek ve omurilik spinal kord apozisyon greft distalinde yaklaşık 1 mm sağ tarafında chondroitinase ABC 1μl microinject çekti cam kanül ile Hamilton şırınga kullanın etmeyin.
15. Sinir segmentinde distal 2mm epineurium hafifçe kabuğu ve C7 lezyon boşluğuna Bu amaçla appose. Segment duramater epineurium ile 10-0 sütür ile sabitleyin.
16. 4-0 sütür ve yara klipler ile cilt insizyonu ile yüzeysel kasları kapatın. Uyanık ve aktif bir kez termal bariyer ve dönüş evde kafes kafes tutarak yerleştirin hayvan.

5) greft ve distal spinal kord aksiyon potansiyeli Elektrofizyolojik kayıt

1. Elektriksel aktivite, PNG içine rejenere olan aksonlar aracılığıyla iletilen olup olmadığını belirlemek için ilk olarak ortaya çıkarmak ve greft izole gerekir. Özel bakım Bu işlem sırasında, fiziksel olarak greft zarar görmesini önlemek için alınan ve bu greft yerleştirildikten sonra silastik membran kullanımı önemli bir yerdir olmalıdır. Yukarıda açıklandığı gibi amaçlanan cerrahi alan (1.3) tıraş ve temiz, hayvan anestezisi. Yeri incitermal bariyer e hayvan.
2. Cilt açılması ve yüzeysel kasları ayıran sonra, silastik zar şeritleri tespit ve dikkatli bir şekilde greft disseke.
3. Kullanımı rongeurs PNG-omurilik apozisyon sitelerine hemen rostral ve kaudal dorsal vertebra süreci çıkarın. Bu yaklaşım sırasında greft çok fazla rahatsız etmemek için özen gösterin. Duramater her iki düzeyde de bir yarık olun.
4. C5 greft-omurilik apozisyon sitesi yaklaşık 1cm rostral yaklaşık 1mm derinliğe kadar tek bir tel (platin-iridyum karışımı) lezyona ipsilateral omuriliğe uyarıcı elektrot, yerleştirin. Iki kutuplu bir çengel elektrot üzerine greft merkezi bölümü dikkatlice kaldırın. 100μsec süresi ile 10μA tek uyarıcı darbeler sağlayın ve greft içine rejenere olan aksonlar aracılığıyla seyahat aksiyon potansiyelleri olup olmadığını belirlemek.
5. Bağladım elektrot uyarıcı elektrot olur ve böylece tek bir tel, PNG, omurilik ve omurilik aksiyon potansiyelleri kayıt girişimi apozisyon distal spinal kord eklenir tel bağlantıları ve konumu açın.
6. Deneyin sonunda toplam 1hr, 50Hz 100μsec süre için 1mA uyaranların bir tren sağlar. 1hr hayvanlar daha sonra Euthanize, PNG rejenere aksonları ile aktive olan nöronlarda cFos immünositokimyasal tespiti için% 4 paraformaldehid ve süreç omurilik dokusu ile serpmek.

6) nöronların Retrograd etiketleme, PNG ve omuriliğe geri rejenere akson anterograd etiketleme aksonlar rejenere

1. Elektrofizyolojik önlemlerle test değil hayvanlar için omurilikte greft ve kendi fesih içine büyümeye akson kaynağını tespit etmek mümkün. Yukarıda açıklandığı gibi amaçlanan cerrahi alan (1.3) tıraş ve temiz, hayvan anestezisi. Termal bariyer hayvan yerleştirin ve PNG maruz yukarıda 6.1 'de açıklandığı gibi.
2. Orta noktada greft kesti ve greft uçları epineurium geri şerit mikro makas kullanın. Kesim birbirinden uzakta biter ve her yatıyordu parafilm ayrı bir kağıda yansıtır.
3. True Blue, PNG bir akson katkıda etiket nöron için proksimal kesik ucuna jel köpük ile ıslatılmış bir pledget yerleştirin. Biotinlenmiş dekstran amin (BDA), omurilik içine greft arka uzanan etiket aksonların distal kesim sonunda batırılmış jel köpük pledget yerleştirin.
4. 3-4d sonra hayvanlar Euthanize,% 4 paraformaldehid ve süreç True Blue etiketli nöron veya etiketli aksonlar BDA histokimya için floresan mikroskopi için beyin ve omurilik doku kesitlerinde serpmek.

7) Göğüs tam transeksiyonu yaralanma ve nakli

Bu yukarıdaki servikal hemisection yaralanma modeline alternatif bir yaklaşım sunmaktadır. Burada, daha ciddi bir ikili yaralanma üretilir ve periferik sinir segmentleri, süresi ve yaralı spinal kord rostral ve kaudal kütükleri lezyon boşluğuna yerleştirilir.

1. Gün

1. Yukarıda açıklandığı gibi amaçlanan cerrahi alan (1.3) tıraş ve temiz, hayvan anestezisi. Termal bariyer hayvan yerleştirin. Antibiyotik ve analjezikler (1.4) yukarıdaki gibi yönetin.
2. T12 vertebra düzeyinde son kaburga yerleştirilmesi noktasında tanımlayın. T11, T10 ve T9 vertebra süreçleri üzerinde rostral bu noktadan cilt insizyonu olun. Bu üç süreç bağlı supraspinal kasları yoluyla yüzeysel fasya kesti.
3. T10 vertebra sürecinin tam laminektomi (örten T12 omurilik segmenti) gerçekleştirin. Delmek duramater bir mikro-neşter bıçak ya da 30 iğne kullanın ve T12 omurilik üzerinde kesi uzatmak. Yatan subaraknoid ve pia mater küçük bir kesi olun.
4. Çekilmiş bir cam mikro-kanül, doku ayrı ve kaldırılmasını kolaylaştırmak için hafif basınç ve mikro-forseps kullanarak, bilateral T12 omurilik aspire başlar. Ventral ve lateral meninksler arasında tam dorsal 3 mm uzunluğunda bir kavite oluşturmak için spinal kord orta ve ventral kısımları ile devam edin.
5. Hemostaz elde etmek ve sonra chondroitinase ABC ile ıslatılmış jel köpük yerine tuzlu su bulanmış jel köpük kullanın. 15 dakika boyunca her 5 dakikada bir chondroitinase batırılmış taze jel köpük sağlayarak, lezyon yerinde davranın.
6. Hank s çözüm periferik sinir segmentinde çıkarın. Yavaşça sinir segmentinin proksimal 4mm epineurium yansıtacak ve omuriliğin bir tarafın rostral ve kaudal kütükleri arasında rahatça sığacak şekilde uzunluğu kesmek. Omurilik diğer tarafında apposed ilk aşılı segmentinde yanında ikinci bir segment yerleştirin. Sütür dura implante greftler üzerinde kapalı ve küçük bir dura kapağısilastik membran parçası.
7. 4-0 dikiş ve yara klipleri ile yakın cilt insizyonu ile katmanları kapatın kasları.
8. Uyanık ve aktif bir kez termal bariyer ve dönüş evde kafes kafes tutarak yerleştirin hayvan.

3. Gün

9. Yukarıda açıklandığı gibi amaçlanan cerrahi alan (1.3) tıraş ve temiz, hayvan anestezisi. Termal bariyer hayvan koyun ve antibiyotik ve analjezikler (1.4) yukarıdaki gibi yönetmek. Greft üzerinde silastik membran maruz yüzeysel sütür kesin. Greft rahatsız, ancak yerine greft kaudal omurilik ve omurilik spinal kord apozisyon greft distalinde yaklaşık 1 mm her iki tarafında chondroitinase ABC 1μl microinject maruz çekti cam kanül ile Hamilton şırınga kullanmak etmeyin.
10. 4-0 sütür ve yara klipler ile cilt insizyonu ile yüzeysel kasları kapatın. Uyanık ve aktif bir kez termal bariyer ve dönüş evde kafes kafes tutarak yerleştirin hayvan. Elektrofizyolojik uyarılması ve kayıt ve yukarıda tracer 5 açıklandığı gibi etiketleme) ve 6) gerçekleştirin.

8) Temsilcisi Sonuçlar

Bu yordamı optimize edilmiştir periferik sinir segmentinde yakından ev sahibi omurilik ile entegre olacak. , Artan ve spinal aksonlar azalan greft girmek greft uzunluğu nispeten düz bir çizgi paralel olarak büyümeye ve günde yaklaşık 1 mm hızında greft distal ucuna kadar uzanan. Chondroitinase çevresindeki skar dokusu inhibitör proteoglikanların kaldırmak için kullanılır olmuştur distal ucu ulaştıktan sonra, aksonlar komşu omurilik nüfuz edecek. Fonksiyonel bağlantı greft içindeki aksonlar uyarılması omurilik nöronları tarafından bir yanıt elektrofizyolojik ve immünositokimyasal algılama tarafından tespit edilecektir. Fonksiyonel iyileşme için anatomik korelasyon omurilik sinir grefti ötesine akson sayısı ve uzunluğu izleme değerlendirilecektir.

Tartışmalar

1. Deney tekrarlanabilirlik için spinal kord yaralanması, hayvandan hayvana tutarlı olması çok önemlidir. Bu nedenle laminektomi için uygun vertebra süreç tespit edilmesi önemlidir. Biz bu çalışma için bir hemisection veya transeksiyonu lezyon modeli kullanarak Çünkü lezyonun boyutu hakkında veya belirli omurilik yollarında yaralı veya yokolma olmadığını belirsizlik yoktur.
2. Periferik sinir akson büyümesinin destekleyen birkaç nörotrofik faktörler üretmek için, çünkü periferik aksonları bu başl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 silk suture	ArosSurgical	T5A10N10
6-0 silk suture	McKesson	2693
Ampicillin	McKesson	483549
Antibody to cFos	Sigma-Aldrich	F7799
Biotinylated dextran Amine	Invitrogen	D7135
Buprenorphin (.3mg/ml)	McKesson	12496075701
Chondroitinase ABC	Associates of Cape Cod	100332-1A
Euthasol	Webster Veterinary	07-805-9296
Hanks Balanced Salt Solution	Cellgro	21-021-CV
Isoflurane	Henry Schein	209-1966
Michel Wound Clips	Fine Science Tools	12040-02
Neurotrace Kit	Invitrogen	N7167
True Blue	Sigma-Aldrich	T5891
Xenodine	Webster Veterinary	92201
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools
Forced Exercise Wheel	Lafayette Instruments
TreadScan System	Clever System
Infinite Horizon Impact Device	Precision Systems and Instrumentation
Magnetic Stimulation Device	Magstim