Combinant des nerfs périphériques et de greffe matrice de modulation de réparer le cordon Rat épinière lésée

Résumé

Lésions traumatiques de la moelle épinière interrompt la communication avec le cerveau. Pour restaurer la connectivité perdue, nous utilisons une greffe du nerf périphérique pour fournir un substrat pour les fibres de régénération en combinaison avec les facteurs neurotrophiques et la matrice de modulation des enzymes pour éliminer les molécules inhibitrices de promouvoir la croissance à longue distance.

Résumé

Lésions traumatiques de la moelle épinière (SCI) provoque la mort des neurones, dérèglement des fonctions motrices et des fibres nerveuses sensorielles (axone) et la perturbation des voies de communication avec le cerveau. Un des objectifs de notre recherche est de promouvoir la régénération des axones pour restaurer la connectivité à travers le site de la lésion. Pour ce faire nous avons développé un nerf périphérique (NP) greffer technique où les segments de nerf sciatique sont soit placé directement entre les extrémités endommagées de la moelle épinière ou sont utilisés pour former un pont sur la lésion. Il ya plusieurs avantages à cette approche par rapport à la transplantation de tissus d'autres neurones; axones régénérant peut être dirigé vers une zone cible spécifique, le nombre et la source de régénération des axones est facilement déterminée par des techniques de traçage, la greffe peut être utilisé pour des expériences électrophysiologiques pour mesurer récupération fonctionnelle associée à des axones dans le greffon, et il est possible d'utiliser un nerf autologues pour réduire la possibilité de rejet de greffe. Dans notre laboratoire, nous avons effectué deux autologue (donneur et receveur sont la même animal) et hétérologues (donneur et receveur sont différents animaux) des greffes avec des résultats comparables. Cette approche a été utilisée avec succès dans des situations de blessures aiguës et chroniques. Axones régénérés qui atteignent l'extrémité distale de la greffe PN échouent souvent à prolonger de nouveau dans la moelle épinière, nous utilisons donc des microinjections chondroïtinase à dégrader des molécules inhibitrices associées à du tissu cicatriciel entourant le domaine de la SCI. Dans le même temps, nous avons constaté que la fourniture de croissance exogène et les molécules trophiques encourage plus longue distance repousse axonale dans la moelle épinière. Plusieurs mois après la transplantation nous effectuons une série de tests anatomiques, comportementales et électrophysiologiques pour évaluer la récupération de la fonction de nos animaux blessés médullaires. Cette approche expérimentale a été utilisée avec succès dans plusieurs modèles lésion de la moelle épinière, à différents niveaux de blessures et de différentes espèces (souris, rat et le chat). Surtout, l'approche du nerf périphérique greffage est efficace dans la promotion de régénération par les neurones aiguë et chronique blessés.

Protocole

1) Préparation de la chirurgie microscopique

1. La station chirurgicale doit être nettoyé et désinfecté avec une solution eau de Javel diluée avant d'installer les instruments et les matériaux accessoires. Les instruments seront autoclavés 1 jour avant la chirurgie et stocké dans un récipient stérile. Allumez le stérilisateur à chaud talon (Outils Fine Science) utilisé pour éliminer les agents pathogènes et des contaminants microbiens provenant d'instruments entre les procédures sur les différents animaux.
2. Branchez la barrière thermique utilisé pour maintenir la température du corps pendant l'intervention chirurgicale. Énoncer des cotons-tiges et tampons de gaze utilisée pour contrôler le saignement. Préparez de petits (<2 mm ³⁾ des morceaux de mousse de gel à utiliser pour les micro-hémostase et plonger dans une solution saline stérile.
3. Placez le rat dans une chambre d'induction et anesthésier avec l'isoflurane (5% vaporisé dans l'oxygène, débit 2,0 L / min). Retirer les animaux de la chambre à la table de préparation et raser une vaste zone de la fourrure du terrain destiné chirurgicale. Essuyez-les avec l'alcool commence isopropylique à 70% au centre du terrain et rayonnant vers l'extérieur, suivi d'un nettoyage avec la solution Polyhydroxidine (Xenodine) de la même manière. Répétez cette séquence de lavages 3 fois.
4. Placer les animaux sur la barrière thermique, le nez et la bouche avec couvercle conique inhalation, de réduire l'isoflurane à 3% et le débit à 0,2 L / min. Livrer dose appropriée d'antibiotiques (ampicilline) par injection sous-cutanée et analgésiques (buprénorphine 0,05 mg / kg) par injection intramusculaire.
5. Le chirurgien va frotter les mains avec une solution Xenodine et rincer à l'eau. Une blouse stérile chirurgicale sera monté sur le chirurgien; mains seront séchés avec une serviette stérile et couvert avec des gants stériles. Cette procédure est suivie pour chaque intervention chirurgicale décrite dans ce texte.
6. Le couvercle couvrant les instruments stériles seront enlevés par un assistant et d'instruments sera aménagé sur une couche stérile par le chirurgien.

2) Transection des PN pour promouvoir la dégénérescence

1. Avec l'animal couché sur le côté faire une incision ligne droite de la tête du fémur vers le genou, en gardant en parallèle et à environ 3mm du fémur. Couper à travers les muscles superficiels du biceps fémoral sur la même ligne que l'incision de la peau, pour exposer le muscle vaste externe sous-jacente.
2. Ciseaux aide faire une petite incision dans le vaste externe près du genou et d'étendre cette place vers la tête du fémur. Encore une fois avec des ciseaux délicatement séparer le vaste externe jusqu'à ce que le siamois branches du nerf tibial et péronier du nerf sciatique sont visualisées (parallèle au fémur).
3. Trace ces branches vers la tête du fémur jusqu'au tronc principal du nerf sciatique est identifié. Juste en dessous de la bifurcation du nerf sciatique utilisez une pince fine pour séparer soigneusement le tissu conjonctif (épinèvre) entourant la branche du nerf tibial (c'est la plus grande branche).
4. Une fois isolé glisser une ligature autour de la soie 6-0 nerf tibial et serrer. Utilisez des ciseaux à micro transect le nerf rostrale de la ligature. Passez la ligne de suture à travers le muscle vaste externe et attacher dans un noeud. Cela donnera une ligne pour une localisation facile de l'extrémité coupée du nerf tibial lorsque le nerf est d'être récoltés 7-10 jours plus tard.
5. Dégénérescence du nerf tibial antérieur au greffage fournit un environnement plus propice à la croissance axonale que ne le fait une préparation nerf frais.
6. Fermer le muscle vaste externe avec 6-0 points de suture en soie. Fermez le muscle biceps fémoral avec 6-0 points de suture en soie. Fermer la peau avec des clips de Michel plaies. Eteignez le flux de l'isoflurane, retirez le cône de nez par inhalation et animale dans la tenue de la cage sur barrière thermique et revenir à la maison une fois la cage, il est éveillé et actif.

3) Suppression du segment PN

1. Anesthetize animaux, se raser et de nettoyer le champ destiné chirurgicale comme décrit ci-dessus (1,3). Placez l'animal sur la barrière thermique.
2. Retirer les clips de la plaie et séparés incision cutanée précédente. Coupez suture du muscle superficiel pour exposer vastus lateralis et couper à travers la suture en ce muscle.
3. Trace la ligne de suture pour couper fin du nerf tibial et de supprimer de suture du nerf. Utilisez une pince fine pour disséquer épinèvre partir d'une longueur de 15 mm du nerf tibial et couper à travers cette extrémité distale. Enlever le segment de nerf et plonger dans la solution saline stérile Hanks Balanced.
4. Si cela est une expérience greffe hétérologue euthanasier l'animal par injection intrapéritonéale de Euthasol. Si cela est une expérience greffe autologue, le muscle de la jambe et la peau est fermée comme décrit dans 2.6) et l'animal préparé pour lésion de la moelle épinière cervicale, comme décrit ci-dessous.

4) des blessures cervicales hémisection et la transplantation

Jour 1

1. Anesthetize animaux, se raser et nettoyer les intentionsded domaine chirurgical comme décrit plus haut (1,3). Placez l'animal sur la barrière thermique. Administrer des antibiotiques et des analgésiques comme ci-dessus (1,4).
2. Repérez l'encoche occipitale et l'éminent T2 processus dorsale vertébrale et faire une incision sur toute la longueur entre ces points de repère externes. Couper à travers la ligne médiane du muscle trapèze superficielles et séparer les muscles sous-jacents rhomboideus cervicale. Gardez les muscles séparés par l'insertion d'un épandeur.
3. Les muscles profonds supraspinale doit être coupé de la dorsale processus vertébrale C4, C5 et C6. Rongeurs utilisant effectuer une laminectomie partielle de C5 pour exposer tout le côté droit et la partie médiale du côté gauche de la moelle épinière. Utilisez la veine dorsale de premier plan comme un repère pour la ligne médiane de la moelle épinière.
4. Utilisez une lame micro-scalpel ou une aiguille de calibre 30 pour percer la dure-mère et de prolonger l'incision sur le cordon médullaire C5. Faites une petite incision dans la sous-arachnoïdienne sous-jacente et la pie-mère.
5. Avec un verre de micro-canules tiré commencent à aspirer le dos, côté droit de la moelle épinière, en utilisant une pression douce et de micro-pinces pour séparer les tissus et faciliter son retrait. Continuez à travers les parties intermédiaires et ventrale de la moelle épinière pour créer une cavité 2 mm de long qui est complet à partir dorsal au bord ventral et à partir de la ligne médiane méninges latérale.
6. Placez la mousse de gel imbibé de sérum physiologique dans la cavité pour obtenir l'hémostase.
7. Enlever le segment de nerf périphérique de la solution de Hanks. Décoller doucement l'épinèvre du 3mm proximale du segment de nerf et appose cette fin sur le mur de la cavité rostrale lésion hémisection. Fixez le segment avec 10-0 suture à travers l'épinèvre à la dure-mère, puis suturer la durée fermé sur l'extrémité implantée de la greffe.
8. Sandwich du greffon entre deux morceaux de membrane silastique (Biobrane) pour la protection et l'isolement facile à un point plus tard. Place aux côtés de la C6, C7 et T1 apophyses vertébrales. Ne pas apposer la fin distal à la moelle épinière ou les tissus musculaires.
9. Fermer les muscles en couches avec suture 4-0 et incision de la peau étroite avec des clips plaie.
10. Placer dans la tenue des animaux en cage sur la barrière thermique et revenir à la maison une fois la cage, il est éveillé et actif.

Jour 21

11. Anesthetize animaux, se raser et de nettoyer le champ destiné chirurgicale comme décrit ci-dessus (1,3). Placez l'animal sur barrière thermique et d'administrer des antibiotiques et des analgésiques comme ci-dessus (1,4). Coupez les sutures superficielles pour exposer la membrane entourant le silastic greffe nerveuse. Soigneusement gratuitement la longueur du nerf de la membrane silastique l'aide de pinces fines et les ciseaux à ressort et de réfléchir à partir du champ opératoire.
12. Effectuer une laminectomie partielle sur le côté droit de la C7 vertébrale. Pierce méninges comme ci-dessus (4.4) et par l'aspiration de préparer un 1 mm ³ cavité dorsale lésion du quadrant dans le C7 de la moelle épinière. Utiliser de la mousse de gel imbibé de sérum physiologique pour obtenir l'hémostase et ensuite remplacer avec de la mousse imbibée de gel de chondroïtinase ABC. Traiter le site de la lésion pendant 15 minutes, offrant fraîcheur mousse gel de chondroïtinase imbibés toutes les 5 minutes.
13. Couvrir la longueur externe de la greffe de nerf avec membrane Silastic. Fermer muscles superficiels avec des sutures 4-0 et l'incision de la peau avec des clips plaie. Placer dans la tenue des animaux en cage sur la barrière thermique et revenir à la maison une fois la cage, il est éveillé et actif.

Jour 23

14. Anesthetize animaux, se raser et de nettoyer le champ destiné chirurgicale comme décrit ci-dessus (1,3). Placez l'animal sur barrière thermique et d'administrer des antibiotiques et des analgésiques comme ci-dessus (1,4). Coupez les sutures superficielles pour exposer la membrane entourant le silastic greffe nerveuse. Ne pas déranger la greffe mais plutôt exposer le site de la greffe C7 et l'utilisation d'une seringue Hamilton de verre tiré canule pour microinject 1 microlitre de la chondroïtinase ABC sur le côté droit de la moelle épinière d'environ 1 mm distale à l'apposition de la greffe de la moelle épinière.
15. Décoller doucement l'épinèvre de la partie distale du segment 2mm nerveuses et appose cette fin à la cavité lésion C7. Fixez le segment avec 10-0 suture à travers l'épinèvre à la dure-mère.
16. Fermer muscles superficiels avec des sutures 4-0 et l'incision de la peau avec des clips plaie. Placer dans la tenue des animaux en cage sur la barrière thermique et revenir à la maison une fois la cage, il est éveillé et actif.

5) l'enregistrement électrophysiologique des potentiels d'action dans la moelle épinière du greffon et distale

1. Pour déterminer si l'activité électrique est transmise par les axones qui ont régénéré dans le PNG nous devons d'abord d'exposer et d'isoler la greffe. Des précautions particulières doivent être prises lors de cette procédure pour éviter d'endommager physiquement la greffe et c'est là que l'utilisation de membranes Silastic après le placement de la greffe est important. Anesthetize animaux, se raser et de nettoyer le champ destiné chirurgicale comme décrit ci-dessus (1,3). E placee sur les animaux barrière thermique.
2. Après l'ouverture de la peau et la séparation des muscles superficiels, des bandes de membrane Silastic sont identifiés et disséqués libre du greffon.
3. Rongeurs Utiliser supprimer le processus dorsale des vertèbres caudales immédiatement rostral et aux sites PNG-rachidien apposition cordon. Prenez soin de ne pas déranger la greffe trop pendant cette approche. Faire une fente dans la dure-mère aux deux niveaux.
4. Environ rostrale 1cm à la C5-greffe vertébrale du site d'apposition du cordon d'insérer un fil unique (platine-iridium mix) électrode de stimulation dans la moelle épinière ipsilatérale à la lésion, à une profondeur d'environ 1mm. Soulevez délicatement la partie centrale de la greffer sur une électrode bipolaire accroché. Fournir seule impulsions stimulant de 10μA avec la durée 100μsec et déterminer s'il ya des potentiels d'action voyage à travers les axones qui ont régénéré dans le greffon.
5. Commutateur les connexions et la position de fils de telle sorte que l'électrode devient accro l'électrode de stimulation et le seul fil est inséré dans la moelle épinière distale à l'apposition de la PNG à la moelle épinière et de tenter d'enregistrer les potentiels d'action dans la moelle épinière.
6. A la fin de l'expérience de fournir un train de 1mA stimuli pour une durée 100μsec à 50Hz, pour un total de 1h. Euthanasier les animaux 1h plus tard, perfuser avec du paraformaldéhyde 4% et la moelle épinière processus pour la détection immunocytochimique de cFos dans les neurones qui ont été activés par les axones régénérés dans le PNG.

6) marquage rétrograde de neurones qui régénèrent les axones dans le PNG et marquage antérograde des axones qui se régénèrent de nouveau dans la moelle épinière

1. Pour les animaux non testés par des mesures électrophysiologiques, il est possible d'identifier la source des axones qui poussent dans le greffon et le cours de leur licenciement dans la moelle épinière. Anesthetize animaux, se raser et de nettoyer le champ destiné chirurgicale comme décrit ci-dessus (1,3). Placez l'animal sur la barrière thermique et exposer le PNG comme décrit au paragraphe 6.1 ci-dessus.
2. Utilisez des ciseaux pour couper à travers les micro de la greffe à sa mi-chemin et la bande de retour l'épinèvre des extrémités coupées de la greffe. Refléter les extrémités coupées loin de l'autre et de jeter chacun sur une feuille séparée de parafilm.
3. Placez un tampon de mousse imbibée de gel True Blue à l'extrémité proximale coupé aux neurones label qui a contribué d'un axone à l'PNG. Placez un tampon de mousse de gel trempé dans biotinylé dextrane amine (BDA) à l'extrémité distale des axones coupés étiquette qui s'étendent de l'arrière du greffon dans la moelle épinière.
4. Euthanasier les animaux 3-4d tard, perfuser avec du paraformaldéhyde 4% et le cerveau et les processus de la colonne vertébrale des coupes de tissus pour la microscopie fluorescente cordon pour True Blue neurones marqués ou pour histochimie BDA pour les axones étiquetés.

7) des blessures thoraciques transection complète et la transplantation

Cette offre une approche alternative au modèle de blessures cervicales hémisection ci-dessus. Voici un plus grave, une blessure bilatérale est produit et les segments de nerfs périphériques sont placés dans la cavité lésion à durée et les souches rostrale et caudale de la moelle épinière lésée.

Jour 1

1. Anesthetize animaux, se raser et de nettoyer le champ destiné chirurgicale comme décrit ci-dessus (1,3). Placez l'animal sur la barrière thermique. Administrer des antibiotiques et des analgésiques comme ci-dessus (1,4).
2. Identifier T12 niveau vertébral au point d'insertion de la dernière côte. Faire une incision cutanée de ce point rostrale plus apophyses vertébrales T11, T10 et T9. Couper à travers fascia superficiel dans les muscles sus-épineux attachés à ces trois processus.
3. Effectuer laminectomie complète de T10 apophyse vertébrale (T12 recouvrant segment de la moelle épinière). Utilisez une lame micro-scalpel ou une aiguille de calibre 30 pour percer la dure-mère et de prolonger l'incision sur le cordon médullaire T12. Faites une petite incision dans la sous-arachnoïdienne sous-jacente et la pie-mère.
4. Avec un verre de micro-canules tiré commencent à aspirer la moelle épinière T12 bilatéralement, en utilisant une pression douce et de micro-pinces pour séparer les tissus et faciliter son retrait. Continuez à travers les parties intermédiaires et ventrale de la moelle épinière pour créer une cavité de 3 mm de long qui est dorsale complète d'ventrale et latérales entre les méninges.
5. Utiliser de la mousse de gel imbibé de sérum physiologique pour obtenir l'hémostase et ensuite remplacer avec de la mousse imbibée de gel de chondroïtinase ABC. Traiter le site de la lésion pendant 15 minutes, offrant fraîcheur mousse gel de chondroïtinase imbibés toutes les 5 minutes.
6. Enlever le segment de nerf périphérique de la solution du Hank s. Doucement reflètent l'épinèvre du 4mm proximale du segment de nerf et de couper une longueur bien ajusté entre les souches rostrale et caudale d'un côté de la moelle épinière. Placer un deuxième segment aux côtés du premier segment greffés, revêtue de l'autre côté de la moelle épinière. Suture de la durée fermé sur les greffes implantées et couvrir avec une petite duréemorceau de membrane silastique.
7. Fermer les muscles en couches avec suture 4-0 et incision de la peau étroite avec des clips plaie.
8. Placer dans la tenue des animaux en cage sur la barrière thermique et revenir à la maison une fois la cage, il est éveillé et actif.

Jour 3

9. Anesthetize animaux, se raser et de nettoyer le champ destiné chirurgicale comme décrit ci-dessus (1,3). Placez l'animal sur barrière thermique et d'administrer des antibiotiques et des analgésiques comme ci-dessus (1,4). Coupez les sutures superficielles pour exposer la membrane recouvrant le site silastic greffe. Ne pas déranger la greffe, mais plutôt d'exposer la moelle épinière caudale à la greffe et l'utilisation d'une seringue Hamilton de verre tiré canule pour microinject 1 microlitre de la chondroïtinase ABC dans chaque côté de la moelle épinière d'environ 1 mm distale à l'apposition de la greffe de la moelle épinière.
10. Fermer muscles superficiels avec des sutures 4-0 et l'incision de la peau avec des clips plaie. Placer dans la tenue des animaux en cage sur la barrière thermique et revenir à la maison une fois la cage, il est éveillé et actif. Effectuer une stimulation électrophysiologique et l'enregistrement et l'étiquetage traceur tel que décrit dans 5) et 6) ci-dessus.

8) Les résultats représentatifs

Lorsque cette procédure est optimisé le segment du nerf périphérique en étroite intégration avec le cordon d'hôte épinière. Ascendant et descendant axones épinière entrera la greffe, de grandir dans une ligne parallèle relativement simple à la longueur de la greffe et d'étendre à l'extrémité distale de la greffe à un taux d'environ 1 mm par jour. Après avoir atteint l'extrémité distale, les axones va pénétrer le cordon adjacentes épinière si chondroïtinase a été utilisé pour enlever les protéoglycanes inhibitrices du tissu cicatriciel entourant. Connectivité fonctionnelle sera déterminée par la détection électrophysiologique et immunocytochimique d'une réponse par les neurones de la moelle épinière à la stimulation des axones au sein du greffon. Corrélation anatomique pour la récupération fonctionnelle sera évalué par le traçage, le nombre et la longueur des axones qui ont prolongé au-delà de la greffe de nerf de retour dans la moelle épinière.

Discussion

1. Pour la reproductibilité de l'expérience, il est important que le niveau de la moelle épinière être uniforme d'animal à animal. Par conséquent, il est essentiel que le processus approprié pour laminectomie vertébrale être identifié. Parce que nous sommes en utilisant un modèle ou une lésion hémisection transection pour cette étude il n'ya aucune ambiguïté au sujet de la taille de la lésion ou si spécifiques tracts épinière ont été blessés ou épargnés.
2. Il est nécessaire que le nerf périp...

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 silk suture		ArosSurgical	T5A10N10
6-0 silk suture		McKesson	2693
Ampicillin		McKesson	483549
Antibody to cFos		Sigma-Aldrich	F7799
Biotinylated dextran Amine		Invitrogen	D7135
Buprenorphin (.3mg/ml)		McKesson	12496075701
Chondroitinase ABC		Associates of Cape Cod	100332-1A
Euthasol		Webster Veterinary	07-805-9296
Hanks Balanced Salt Solution		Cellgro	21-021-CV
Isoflurane		Henry Schein	209-1966
Michel Wound Clips		Fine Science Tools	12040-02
Neurotrace Kit		Invitrogen	N7167
True Blue		Sigma-Aldrich	T5891
Xenodine		Webster Veterinary	92201
Hot Bead Sterilizer		Fine Science Tools
Forced Exercise Wheel		Lafayette Instruments
TreadScan System		Clever System
Infinite Horizon Impact Device		Precision Systems and Instrumentation
Magnetic Stimulation Device		MagStim Inc.