שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

Summary

אנו מציגים שילוב רומן רב עוצמה של nanophotonics (QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לחקור את היווצרות polyplexes polyelectrolyte, אשר צפוי לספק שליטה טובה יותר וסינתזה של polyplexes אחיד להתאמה אישית עבור חומצה מבוססי גרעין עתיד הרפוי.

Abstract

ההתקדמות הגנומיקה להמשיך את הפיתוח של דלק ותרופות כי יכול למקד בפתוגנזה ברמה תאית ומולקולרית. פונקציונלי בדרך כלל בתוך התא, גרעין חומצה מבוסס הרפוי דורשים מערכת יעילה משלוח תאיים. גישה אחת היא לאימוץ נרחב ל-DNA מורכב עם הספק גן כדי ליצור nanocomplexes אלקטרוסטטית באמצעות הרכבה עצמית, להקל על ספיגת הסלולר של דנ"א תוך הגנה עליו מפני השפלה. האתגר טמון בעיצוב רציונלית של נשאי הגן יעיל, שכן מוקדם מדי מחייב ניתוק או יציבה לא להזיק ספיגת הסלולר היעילות הטיפולית. Nanocomplexes מסונתז על ידי ערבוב בתפזורת הראה מגוון רחב של התנהגות תאיים לפרוק וסחר, אשר יוחס ההטרוגניות בגודל וביציבות של nanocomplexes. ההטרוגניות כזו המקשה על הערכה מדויקת של הרכבה עצמית קינטיקה ומוסיף הקושי correlating המאפיינים הפיזיים שלהם יעילות transfection או bioactivities. אנו מציגים התכנסות הרומן של nanophotonics (כלומר QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לאפיין בזמן אמת קינטיקה של nanocomplex את הרכבה עצמית תחת זרימה למינרית. QD-סריג מספק אינדיקציה רגישה מאוד של תחילת אינטראקציות מולקולריות למדוד כמותית לאורך כל תהליך הסינתזה, ואילו מיקרופלואידיקה מציעה microenvironment מבוקר היטב מרחבית כדי לנתח את התהליך עם רזולוציה גבוהה הזמני (~ אלפיות השנייה). עבור מערכת מודל של nanocomplexes פולימריות, בשני שלבים נפרדים בתהליך הרכבה עצמית נתפסו על ידי פלטפורמה זו האנליטית. ההיבט הקינטית של תהליך ההרכבה העצמית המתקבל על microscale יהיה יקר במיוחד microreactor מבוססי התגובות אשר רלוונטיים יישומים מיקרו בקנה מידה ננו רבים. יתר על כן, nanocomplexes עשוי להיות מותאם אישית באמצעות תכנון נכון של מכשירים microfludic, ואת התוצאה QD-סריג nanocomplexes DNA פולימריות יכול להיות מיושם בקלות להקמת מבנה תפקודי מערכות יחסים.

Protocol

א Biotinylation של דנ"א

פלסמיד דנ"א היו biotinylated קוולנטית עם גואנן ספציפי תוויות ביוטין כפי שתואר על ידי היצרן (Mirus ביו, מדיסון, ויסקונסין), אך בקנה מידה יש ​​~ 1-2 תוויות ביוטין לכל ה-DNA. ה-DNA פלסמיד (pEGFP-C1, 4.9 קילו, Clontech, Mountain View, CA) סומן בפרוטוקול זה.

1. להמיס כמות הרצויה של pDNA לתוך TE חיץ של DNase-RNase חופשי חופשי (איכות ביולוגיה מולקולרית כיתה) מים כדי ליצור פתרון ה-DNA 1μg/μL.
2. ההתנהגות התגובה תיוג באמצעות תערובות התגובה הבאה. מוסיפים את תווית ה-IT מגיב האחרון.

עבור התגובה DNA 100μg:

DNase-חופשית RNase ללא מים	75 μL
תיוג הצפת 10X	20 μL
1μg/μL DNA	100 μL
תווית ה-IT מגיב	5 μL
סך נפח	200 μL

3. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
4. לטהר את מדגם מתויג על ידי אתנול או משקעים isopropanol הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים.

הערה: סינון ג'ל עמודות מבוסס עלול להוביל ספיגת UV גבוה או רקע הקרינה, אשר עשויים להשפיע על כימות ואפיון DNA או פלואורסצנטי.
הערה: רמת biotinylation עשוי להיקבע על ידי הבה מבוסס בדיקות.

ב תיוג של פולימר קטיוני-Cy5

Chitosan (390 kDa, 83.5% deacetylated, Vanson, ברדמונד, וושינגטון) שימש פולימר קטיוני המודל במחקר זה. אמינים ראשוני בחינם על עמוד השדרה chitosan פולימר תויגו עם Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

1. כדי להקל על בנין שלם של צבע Cy5, לחשב את הכמות הנדרשת של Cy5-NHS כזה יחס טוחנת של Cy5: אמינים העיקרי הוא 1: 200.
2. התאם את ה-pH של התמיסה chitosan (במאגר אצטט 25mm) ל ~ 6.5 על ידי תוספת של NaOH. שים לב התגובה NHS הוא יעיל יותר ב-pH בסיסי, אך מסיסות של chitosan כאן מגביל את טווח ה-pH עובד.
3. תוך ערבוב, מוסיפים באיטיות את כמות מחושבת של Cy5-NHS (1 מ"ג / מ"ל ​​DMSO) לפתרון chitosan באופן טיפה אחר טיפה.
4. להתסיס את תערובת בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
5. כדי לטהר, dialyze עם 10k MWCO Slide-a-Lyzer (פירס) במשך שעה 2 נגד המאגר אצטט 1% על טמפ החדר בחושך.
6. החלף חיץ dialyze עוד שעה 2 ב temp בחדר בחושך.
7. החלף חיץ dialyze לילה ב 4 ° C בחושך.
8. חנות מטוהרים שכותרתו פולימר ב -20 ° C.

הערה: במחקר זה, עקומת הסטנדרטי הוא נבנה על ידי מדידת עוצמת פליטת Cy5-NHS אסתר ב 670 ננומטר. לאפיין את צפיפות תיוג על ידי מדידת הפליטה המתקבל מ - 670 ננומטר Cy5 שכותרתו chitosan בעקומה הסטנדרטית. ספיגת עשוי לשמש גם כדי לקבוע את היעילות תיוג אך לא בוצע כאן.

ג הכנת QD שכותרתו DNA ו-Polymer Cy5

היחס של טוחנת pDNA כדי QD הוחזק עודף (pDNA: QD ≈ 1: 2) על מנת להבטיח בנין שלם של QDs כדי pDNA. מספר QDs שכותרתו על כל pDNA ניתן להעריך דרך TEM הדמיה או מתקנים מקבילים אחרים. במחקר שלנו, במספר QDs לכל pDNA מוערך על ידי ~ 1-3 TEM וספקטרוסקופיה מולקולה בודדת. ¹ השתמש Millipore מילי-Q שיפוע מים (> 18.0 מגוואט, 0.2um מסונן) במהלך תקופת ההכנה.

1. לחשב את הסכום הנדרש עבור chitosan 10μg pDNA לפי יחס N / P הרצוי, את היחס התיאורטי של אמינים protonated בפתרון chitosan על פוספטים שלילי פתרון ה-DNA.
2. הוסף streptavidin-פונקציונליות 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) לתוך התמיסה pDNA biotinylated.
3. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר בחושך במשך 15 דקות.
4. מוסיפים את ה-DNA QD שכותרתו לתוך 50 mM פתרון נתרן סולפט להפוך את 200μL נפח סופי.
5. מדולל Cy5-chitosan, על פי היחס N / P הרצוי, עם מים מילי-Q על מנת להפוך את 200μL נפח סופי.

הערה: שמור את התגובה בחושך כדי למנוע photobleaching אפשרי.
חשוב: היזהר להשתמש 605 Qdot ITK ™ streptavidin המצומד (סדרת ITK), כמו נקודות קוונטיות בקטלוג זה נועדו לצורך סריג. סדרת Qdot קבוע הם מצומדות בשכבה PEG למנוע הלא ספציפית מחייב, במיוחד עבור תיוג הסלולר. עם זאת, ציפוי נוסף מגדיל את המרחק-acceptor התורם, וכתוצאה מכך reduced העברת יעילות אנרגיה.

ד ייצור של SU-8 מאסטרס באמצעות photolithography רגילה

1. רקיק Si הוא פיראניה ניקה אפוי ב 200 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
2. עבור עובי האב המיועד של 25μm, מעיל ספין photoresist שלילית (SU-8 2025, Microchem, ניוטון, MA) על פרוסות סיליקון Si בסל"ד 2000 למשך 30 שניות.
3. לאפות Soft רקיק על פלטה חמה עם הרמפה של 65 ° C / שעה עד 95 ° C.
4. לחשוף את האור האולטרה סגול (365nm) עבור 250mJ/cm ² דרך הסרט מסכה (CAD / אמנות שירותים, Bandon, OR) המכיל את העיצוב של microchannels.
5. לאחר חשיפה לאפות את רקיק על פלטה חמה עם הרמפה של 65 ° C / שעה עד 95 ° C.
6. פיתוח רקיק באמצעות SU-8 מפתח photoresist.
7. רקיק בדוגמת הוא אפוי קשה עם הרמפה של 65 על פלטה חמה ° C / שעה עד 200 ° C. שמירה על פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס במשך לפחות 5 שעות, ואז להתקרר בהדרגה רקיק לטמפרטורת החדר.

חשוב: ramping הדרגתית במהלך SU-8 אפייה תהליך הורים הוא הכרחי, אחרת SU-8 מבנה עשוי מנותקת פרוסות סיליקון או סדקים על SU-8 מבנה עשוי להיגרם על ידי שחרור מתח.

א Replica דפוס של PDMS מן המאסטרים Bonding כדי זכוכית מכסה

1. האדון SU-8 ממוקם סירה במשקל.
2. סיליקון מערבבים סוכן אלסטומר וריפוי (פולי (dimethylsiloxane), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) בתוך 10: 1 יחס.
3. יוצקים את התערובת PDMS על המאסטר SU-8 ולהשאיר את הסירה במשקל ייבוש ואקום כדי להסיר בועות.
4. Cure PDMS על 65 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות.
5. פיל רצועת PDMS מהתבנית האב סי.
6. פאנץ ערוץ פתחי הכניסה שקעים של המכשיר fluidic.
7. נקו את רצועת PDMS זכוכית לכסות עם אתנול ואז אוויר יבש.
8. התייחס ניקה PDMS רצועת זכוכית מכסים פלזמה חמצן (20W עבור 1min).
9. מיד האג"ח PDMS רצועה עם כיסוי זכוכית.
10. השאירו את שבב microfluidic מלוכדות בתנור על 95 מעלות צלזיוס למשך לילה.

חשוב: טיפול פלזמה ואפייה לילה חיוניים כוח מליטה משופרת.

פ צג היווצרות Nanocomplexes DNA במכשיר Microfluidic

1. מלאו את ערוץ microfluidic עם מים (כדי להבטיח שאין בועות בתוך הערוץ microfluidic), לפני טעינת ריאגנטים על מנת להבטיח זרימה חלקה במהלך הניסוי.
2. טען את ה-DNA-QD שכותרתו Cy5 שכותרתו chitosan פתרונות לשני מזרקים זכוכית בודדים, דרך צינורות המתואר בסרט.
3. חבר את צינורות עם שני פתחי הכניסה של מכשירים microfluidic. היזהר לא להכניס כל האוויר במהלך התהליך. הגדר את קצב הזרימה ב 20nL/min (PHD-2000 משאבת מזרק, Holliston, MA), בתנאים זרימה למינרית.
4. בדוק את microchannels מתחת למיקרוסקופ.
5. כאשר תזרים יציב (~ 15 עד 20 דקות), QD בתיווך סריג יש לשים לב במרכז הערוץ.
6. צלמו תמונות פלואורסצנטי (CCD מקורר, Qimaging, BC, קנדה) במקומות שונים לאורך התעלה.
7. ניתוח תמונות פלואורסצנציה עם ImageJ ו OriginLab.

באיור 1. QD-סריג מספק אינדיקציה רגיש של תחילת Nanocomplexes DNA הרכבה עצמית

1. נקודה קוונטית בתיווך תהודה פלואורסצנציה העברת אנרגיה (QD-סריג) יכול לספק אינדיקציה כמותית רגישות גבוהה של יציבות polyplex באחת סביבות חוץ או פנים סלולריים, המאפשר זיהוי חד משמעי של תחילת יחסי הגומלין בין דנ"א נושאת גן. הזוג סריג, 605QD ו Cy5, נבחרה בהתבסס על מיקסום חפיפה ספקטרלית בין התורם acceptor ומזעור פוטנציאל לחצות לדבר. עבור זוג זה, המרחק פורסטר היא 69.4Å ^3.
2. הרכבה עצמית של QD-סריג nanocomplexes DNA. פלסמיד דנ"א anionic (pDNA) ואת המוביל גן קטיוני תויגו עם QD (תורם אנרגיה) ו Cy5 (אנרגיה acceptor), בהתאמה. QD-סריג nanocomplexes נוצרו באמצעות coacervation מורכב אלקטרוסטטית. לאחר עירור ב 488 ננומטר, QD-סריג בתיווך Cy5 פליטת הצביעו היווצרות nanocomplex קומפקטי ללא פגע. השעה מגורים (t _R) יכול להיות מחושב על פי המרחק (x) אשר מודד שממנו שני הזרמים נפגשים למצב של תגובה תחת חקירה, ואת מהירות זרימת אומר (v). בשל אופיו של זרימה למינרית, ערבוב מתרחשת רק על הממשק (במרכז של כל תמונה), מאפשר חישוב מדויק של תחבורה המונית כפונקציה של t _R. רזולוציה הזמני יכול להיות מותאם על ידי שינוי applieד ספיקות. (הבלעה) סריג בתיווך אות נצפתה מיד בממשק כאשר שני זרמים נפגשו, המציין מחייב כי היה מהיר, המתרחשים בתוך כמה אלפיות לפי שיעורי זרימה שימושית. בר סולם: 100μm.

Discussion

• המשמעות של העבודה שלנו:
  1. זהו ניסיון ראשון לעקוב אחר פולימריות nanocomplex DNA הרכבה עצמית קינטיקה בזמן אמת (אלפית השנייה רזולוציה) דרך QD-סריג התגובות בתוך microfluidic שבב פשוט.
  2. QD בתיווך סריג מספק אינדיקציה רגיש מאוד כמותי של תחילת אינטראקציות מולקולריות לאורך כל תהליך ההרכבה העצמית, בעוד מיקרופלואידיקה מציעה microenvironment מבוקר היטב מרחבית כדי לנתח את התהליך במהלך הסינתזה nanocomplex DNA.
  3. השילוב של מיקרופלואידיקה nanophotonics מציע גישה חדשה ומעניינת לחקור כל סוג של תגובות complexation.
  4. כתוצאה מכך QD-סריג nanocomplexes DNA פולימריות יכול להיות מיושם בקלות להקמת מבנה תפקודי מערכות יחסים. ^1,2

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-8	MicroChem Corp.	SU-8 2025
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Plasmid DNA	Clontech Laboratories	pEGFP-C1	4.9 kb, MW = 3.3 x 106
LabelIT Biotin Labeling Kit	Mirus Bio LLC	MIR 3400	Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.
Streptavidin 605QD	Invitrogen	Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate
Cy5-NHS Ester	Amersham	PA15101
Chitosan	Vanson	390 kDa	83.5% deacetylated
Cover Glass	Fisher Scientific	12-545C	No. 1; Size: 40 x 22mm
Gastight Glass Syringe	Hamilton Co	TLL series	50μL to 500μL depending on sample volume
Tygon Tubing	Small Parts, Inc.	0.02 ID, 100ft	Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft
Connector	Small Parts, Inc.	HTX-23R	Customized in length of 0.750"
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD-2000
CCD	QImaging	Intensified Retiga Cooled
Microscope	Olympus Corporation	BX-51	100W mercury arc lamp
ImageJ	National Institutes of Health	v1.36b	http://rsb.info.nih.gov/ij
Origin Pro8	OriginLab	Student Version
Microscope Filter sets	Omega Optical	475AF40	Excitation filter in both channels
Microscope Filter sets	Omega Optical	595AF60	Emission filter in 605QD channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	670DF40	Emission filter in QD-FRET channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	500 DRLP	Long pass dichroic in 605QD channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	595DRLP	Long pass dichroic in QD-FRET channel