Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Özet

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Özet

Genomik gelişmeler, hücresel ve moleküler düzeyde patogenezi hedef terapötikler gelişme yakıt devam ediyor. Genelde hücre içinde fonksiyonel, nükleik asit temelli tedaviler etkili bir hücre içi dağıtım sistemi gerektirir. Bir yaygın olarak kabul edilen bir yaklaşım bozulması karşı koruyarak DNA hücresel alımını kolaylaştıran, elektrostatik kendini montaj yoluyla nanocomplexes oluşturmak için bir gen taşıyıcı ile karmaşık DNA. , Erken disosiasyon ya da çok istikrarlı bağlama hücresel alımı ve terapötik etkinliği için zararlı olabilir çünkü meydan okuma, etkin gen taşıyıcıların rasyonel tasarım yatıyor. Toplu karıştırma tarafından sentezlenen Nanocomplexes nanocomplexes büyüklüğü ve istikrar içinde heterojen atfedilen açma hücre içi ve ticareti davranış, çeşitli gösterdi. Böyle bir heterojenite, kendini montaj kinetiği doğru değerlendirme engelleyen ve onların fiziksel özellikleri transfeksiyon verimliliği veya bioactivities ilişkilendirerek zorluk ekler. Biz sahipliği yapacaktır (yani QD-FRET) ve Mikroakiskan laminer akış altında nanocomplex kendini montaj gerçek zamanlı kinetiği karakterize bir roman yakınsama sunuyoruz. Mikroakiskan yüksek temporal çözünürlük (~ milisaniye) ile mekansal sürecini analiz etmek için iyi kontrollü mikroçevresinin sunar ise, QD-FRET sentez süreci boyunca moleküler etkileşimler ve kantitatif ölçümü başlamasından son derece hassas bir göstergesi sağlar. Polimerik nanocomplexes modeli sistem için, iki ayrı self-montaj işlemi aşamalarında bu analitik platformu tarafından ele geçirildi. Microscale elde edilen öz-montaj işlemi kinetik yönü birçok mikro ve nano ölçekli uygulamalar için ilgili microreactor tabanlı reaksiyonlar için özellikle değerli olacaktır. Ayrıca, nanocomplexes microfludic cihazların uygun tasarımı sayesinde özelleştirilmiş olabilir, ve elde edilen polimerik DNA nanocomplexes yapı-işlev ilişkileri kurmak için kolayca uygulanabilir QD-FRET.

Protokol

DNA A. biyotinilasyon

Plazmid DNA kovalent olarak üretici (Mirus Bio, Madison, WI) tarafından açıklanan, ancak ~ DNA ortalama 1-2 biotin etiketler ölçekli guanin özel biotin etiketleri ile biotinlenmiş. Plazmid DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) bu protokol etiketli oldu.

1. 1μg/μL DNA çözümü DNaz-özgür ve RNaz-TE tamponu (moleküler biyoloji sınıf kaliteli) suya pDNA istenilen miktarda eritilir.
2. Aşağıdaki reaksiyon karışımları kullanarak etiketleme reaksiyon Davranış. BT reaktif son Etiket ekleyin.

100μg DNA reaksiyon için:

DNaz ücretsiz ve RNaz ücretsiz su	75 mcL
10X Etiketleme Tampon A	20 mcL
1μg/μL DNA	100 mcL
BT reaktif Etiket	5 mcL
Toplam Hacim	200 mcL

3. 37 ° C'de 1 saat süreyle reaksiyon inkübe edin.
4. Etanol veya isopropanol yağış standart protokoller etiketli numune arındırın.

Not: Jel filtrasyon tabanlı sütun DNA sayısallaması veya floresan karakterizasyonu etkileyebilir yüksek UV absorbans veya floresan arka plan yol açabilir.
Not: biyotinilasyon düzeyi haba tabanlı testler ile belirlenebilir.

Cy5 Katyonik Polimer B. Etiketleme

Chitosan (% 83.5 deacetylated 390 kDa Vanson, Redmond, WA) bu çalışmada bir model katyonik polimer olarak kullanılmıştır. Kitosan polimer omurgasına ücretsiz olarak birincil aminler Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ile etiketlenir.

1. Cy5 boya komple konjugasyon kolaylaştırmak için, Cy5 NHS gerekli miktarı hesaplamak Cy5, molar oranda böyle: 200: birincil aminler 1.
2. NaOH ilavesi ile ~ 6.5 pH kitosan çözümü (25mm asetat tampon) ayarlayın. Not NHS reaksiyon bazik pH daha etkilidir, ancak burada chitosanın çözünürlük çalışma pH aralığı sınırları.
3. Karıştırarak iken, yavaş yavaş bir damla bırak şekilde kitosan çözüm Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) hesaplanan miktar ekleyin.
4. Gece karanlıkta, oda sıcaklığında karışımı çalkalayın.
5. Arındırmak için,% 1 asetat tamponu karşı karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle 10k MWCO Slayt-a-Lyzer (Pierce) ile dialyze.
6. 2 saat karanlıkta, oda sıcaklığında bir başka tampon ve dialyze değiştirin.
7. Tampon ve 4 gecede dialyze ° C karanlıkta değiştirin.
8. Mağaza saflaştırılmış etiketli -20 ° C'de polimer

Not: Bu çalışmada, standart bir eğri, 670 nm Cy5-NHS ester emisyon yoğunluğu ölçümü ile inşa edilmiştir . Standart eğri Cy5 etiketli kitosan 670 nm'de elde edilen emisyon ölçüm etiketleme yoğunluğu karakterize eder. Absorbans etiketleme etkinliğini belirlemek için de kullanılır olabilir ama burada değildi.

QD etiketli DNA ve Cy5-Polimer C. Hazırlık

QD için pDNA molar oranı aşan tutulur (pDNA: QD ≈ 1: 2) pDNA için QDS tam konjugasyon sağlamak. TEM görüntüleme veya eşdeğer diğer tesisleri ile her pDNA üzerine etiketli QDS sayısı tahmin edilebilir. Bizim çalışmamızda, pDNA ortalama QDS sayısı olduğu tahmin edilmektedir ~ TEM ve tek bir molekül spektroskopisi tarafından 1-3. Hazırlanması sırasında ¹ Kullanım Millipore Milli-Q degrade su (0.2um süzülmüş> 18.0 MW).

1. 10μg pDNA istenilen N / P oranına göre chitosanın gerekli miktarda DNA çözümü olumsuz fosfat kitosan çözüm Protonlaşmış aminlerin teorik oranını hesaplayın.
2. Biotinlenmiş pDNA çözüm streptavidin Fonksiyonlu 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) ekleyin.
3. 15 dakika süreyle karanlıkta, oda sıcaklığında çözüm inkübe edin.
4. QD-işaretli DNA son hacmi 200μL yapmak için 50 mM sodyum sülfat çözeltisi içine ekleyin.
5. Milli-Q su ile son hacim 200μL yapmak için, istenilen N / P oranı göre, Cy5-kitosan seyreltilir.

Not: mümkün photobleaching önlemek için koyu reaksiyon tutun.
Önemli: Bu katalogda Kuantum nokta FRET bir amaç için tasarlanmış Qdot 605 ITK ™ streptavidin konjuge (ITK serisi), kullanmak için dikkatli olun. Düzenli Qdot serisi özellikle hücresel etiketlenmesi için, non-spesifik bağlama önlemek için PEG tabakası ile konjuge. Ancak, bu ek kaplama r, donör-alıcı uzaklığı büyütür.enerji transfer verimliliği educed.

Standart Fotolitografi SU-8 Master D. Fabrikasyon

1. Si gofret piranha ° C 'de 5 dakika süreyle temizlenmelidir ve 200 pişmiş.
2. 25μm, belirlenen ana kalınlığı, spin kat 30 saniye boyunca 2000 rpm'de Si levhası üzerindeki olumsuz fotorezist (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA).
3. Yumuşak fırında 65 bir rampa ile ocak gofret ° C / saat - 95 ° C
4. 250mJ/cm ² için UV ışık (365nm), mikro tasarım içeren bir maske film (CAD / Sanat Hizmetleri, Bandon, OR) yoluyla maruz .
5. Maruziyet sonrası, 65 bir rampa ile bir ocak gofret fırında ° C / saat - 95 ° C
6. SU-8 fotorezist geliştirici kullanarak gofret geliştirin.
7. Desenli gofret sert bir rampa, 65 ocak üzerinde pişirilir ° C / saat ile 200 ° C Oda sıcaklığına kadar gofret, daha sonra yavaş yavaş serin, en az 5 saat süreyle 200 ° C'de gofret koruyun.

Önemli: süresince kademeli Ramping SU-8 ana pişirme işlemi gereklidir, aksi takdirde SU-8 yapısı silikon gofret veya çatlak kopuk SU-8 yapısı, stres sürümü ile indüklenen olabilir .

Kapak Cam ustaları ve Bağlanma PDMS E. Replica Kalıp

1. SU-8 ana tartı tekne yerleştirilir.
2. 10 karıştırın silikon elastomer ve kür ajanı (Poli (dimethylsiloxane), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI): 1 oranında.
3. SU-8 ana PDMS karışımın üzerine dökün ve kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum desikatörde tartım tekneden ayrılabilirsiniz.
4. 1-2 saat 65 ° C'de PDMS Cure.
5. Si master kalıp PDMS şerit soyun.
6. Punch kanal girişleri ve çıkışları akışkan cihaz.
7. PDMS şerit ve etanol ile cam kapak ve hava kuru temizleyin.
8. Oksijen plazma ile temizlenmelidir PDMS şerit ve cam kapak (1dk için 20W) davranın.
9. Cam kapak ile hemen bağ PDMS şerit.
10. 95 ° C'de gece boyunca fırında gümrüklü mikroakışkan çip bırakın.

Önemli: Plazma tedavi ve gecede pişirme gelişmiş yapıştırma gücü için gerekli.

F. Monitör mikroakışkan Aygıt DNA Nanocomplexes oluşumu

1. Deney sırasında düzgün akışını sağlamak için reaktifler yüklemeden önce, mikroakışkan kanal (mikroakışkan kanal içinde herhangi bir baloncuklar olmadığından emin olmak için) su ile doldurun.
2. Video açıklanan boru yoluyla, iki ayrı cam şırınga QD etiketli DNA ve Cy5 etiketli kitosan çözümleri yükleyin.
3. Tüp mikroakışkan cihazlar iki girişleri ile bağlayın. Işlemi sırasında herhangi bir hava tanıtmak için dikkatli olun. Laminer akış koşulları altında, 20nL/min (PHD-2000 şırınga pompası, Holliston, MA) akış hızını ayarlayın.
4. Mikroskop altında mikro kontrol edin.
5. Akış stabil (~ 15 ila 20 dakika), QD-aracılı kanalın merkezi dikkat edilmelidir FRET.
6. Kanal boyunca farklı yerlerde floresan resimler (Soğutmalı CCD, Qimaging, BC, Kanada) ele alalım.
7. ImageJ ve OriginLab floresan görüntüleri analiz.

Şekil 1. QD-FRET DNA Nanocomplexes self-montaj başlangıç ​​hassas bir gösterge sağlar

1. Kuantum nokta-aracılı floresan rezonans enerji transferi (QD FRET) net tespiti için DNA ve gen taşıyıcı arasındaki etkileşimleri başlangıç ​​sağlayan, ekstra ya da hücre içi ortamlarda ya polyplex istikrar nicel ve çok hassas bir göstergesi sağlayabilir. FRET çifti, 605QD ve Cy5, donör ve alıcı arasındaki spektral örtüşme maksimize etmek ve potansiyel çapraz konuşma minimize dayalı seçildi. Bu çifti için, Förster mesafe 69.4Å ³
2. Self-assembly QD-FRET DNA nanocomplexes. Anyonik plazmid DNA (pDNA) ve katyonik gen taşıyıcı, sırasıyla QD (enerji donör) ve Cy5 (enerji alıcı) ile işaretlenmiştir. QD-FRET nanocomplexes elektrostatik karmaşık Koaservasyon yoluyla oluşmuştur. QD-FRET aracılı Cy5 emisyon 488 nm uyarma üzerine, kompakt ve sağlam nanocomplex oluşumu göstermiştir. Kalma süresi (t _R) iki dere soruşturma altında reaksiyon konumu ve ortalama akış hızı (v) buluştuğu önlemler mesafe (x) göre hesaplanabilir. Karıştırma, laminer akış doğası nedeniyle sadece hassas hesaplama t _R fonksiyonu olarak toplu taşıma izin arayüzü (her görüntünün merkezi) yer alır. Zamansal çözünürlük applie değiştirerek ayarlanabilird akış oranları. (Ankastre) FRET-aracılı sinyal uygulanan akış hızlarına göre birkaç milisaniye içinde meydana gelen bu bağlama hızlı olduğunu belirten, iki dere bir araya geldi arayüzü hemen gözlendi. Ölçek Bar: 100μm.

Tartışmalar

• Yaptığımız işin önemi:
  1. Bu basit bir mikroakışkan çipi içinde QD-FRET yanıtları aracılığıyla gerçek zamanlı olarak polimerik DNA nanocomplex kendini montaj kinetiği (milisaniye çözünürlük) izlemek için ilk girişimi.
  2. Mikroakiskan mekansal, DNA nanocomplex sentezi sırasında sürecini analiz etmek için iyi kontrollü mikroçevresinin sunuyor ise QD-aracılı FRET, moleküler etkileşimlerin başlangıcı ve self-montaj süreci boyunca son derece duyarlı ve kantitatif bir gösterge sağlar.
  3. Mikroakiskan ve sahipliği yapacaktır entegrasyonu kompleks reaksiyonlar her türlü araştırmak için yeni ve ilginç bir yaklaşım göstermektedir.
  4. Çıkan QD-FRET polimerik DNA nanocomplexes yapı-işlev ilişkileri kurmak için kolayca uygulanabilir. ^1,2

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-8	MicroChem Corp.	SU-8 2025
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Plasmid DNA	Clontech Laboratories	pEGFP-C1	4.9 kb, MW = 3.3 x 106
LabelIT Biotin Labeling Kit	Mirus Bio LLC	MIR 3400	Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.
Streptavidin 605QD	Invitrogen	Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate
Cy5-NHS Ester	Amersham	PA15101
Chitosan	Vanson	390 kDa	83.5% deacetylated
Cover Glass	Fisher Scientific	12-545C	No. 1; Size: 40 x 22mm
Gastight Glass Syringe	Hamilton Co	TLL series	50μL to 500μL depending on sample volume
Tygon Tubing	Small Parts, Inc.	0.02 ID, 100ft	Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft
Connector	Small Parts, Inc.	HTX-23R	Customized in length of 0.750"
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD-2000
CCD	QImaging	Intensified Retiga Cooled
Microscope	Olympus Corporation	BX-51	100W mercury arc lamp
ImageJ	National Institutes of Health	v1.36b	http://rsb.info.nih.gov/ij
Origin Pro8	OriginLab	Student Version
Microscope Filter sets	Omega Optical	475AF40	Excitation filter in both channels
Microscope Filter sets	Omega Optical	595AF60	Emission filter in 605QD channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	670DF40	Emission filter in QD-FRET channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	500 DRLP	Long pass dichroic in 605QD channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	595DRLP	Long pass dichroic in QD-FRET channel