Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Resumo

Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.

Resumo

Avanços na genômica continuar a alimentar o desenvolvimento de terapêuticas que possam alvo patogenia a nível celular e molecular. Tipicamente funcional dentro da célula, baseados em ácido nucléico terapêuticas requerem um sistema de entrega eficiente intracelular. Uma abordagem amplamente adotado é o de DNA complexo com um portador do gene para formar nanocomplexes via eletrostática auto-montagem, facilitando a captação celular de DNA, protegendo-o contra a degradação. O desafio consiste no desenho racional de portadores do gene eficiente, uma vez que a dissociação prematura ou excessivamente ligação estável seria prejudicial para a absorção celular e eficácia terapêutica. Nanocomplexes sintetizados através da mistura de massa mostrou uma grande diversidade de comportamento intracelular desembalar e tráfico, o que foi atribuído à heterogeneidade no tamanho e na estabilidade do nanocomplexes. Essa heterogeneidade dificulta a avaliação exata da cinética de auto-montagem e contribui para a dificuldade em correlacionar suas propriedades físico para a eficiência de transfecção ou bioativos. Nós apresentamos uma convergência romance de nanofotônica (ie QD-FRET) e microfluídica para caracterizar a cinética em tempo real do nanocomplex auto-montagem sob fluxo laminar. QD-FRET fornece uma indicação altamente sensível do início de interações moleculares e medida quantitativa em todo o processo de síntese, enquanto a microfluídica oferece um microambiente bem controlados para espacialmente analisar o processo com alta resolução temporal (~ milissegundos). Para o sistema modelo de nanocomplexes poliméricos, duas etapas distintas no processo de auto-montagem foram capturados por esta plataforma analítica. O aspecto cinética do processo de auto-montagem obtidos em microescala seria particularmente valiosos para microreactor baseado reações que são relevantes para muitas aplicações de micro e nano-escala. Além disso, nanocomplexes pode ser personalizada através de um design adequado dos dispositivos microfludic, ea conseqüente QD-FRET nanocomplexes DNA poliméricos podem ser facilmente aplicadas para o estabelecimento de relações estrutura-função.

Protocolo

A. Biotinilação de DNA

DNA plasmidial foram covalentemente biotinilado guanina com etiquetas específicas biotina, conforme descrito pelo fabricante (Mirus Bio, Madison, WI), mas dimensionada para ter ~ 1-2 rótulos biotina por DNA. DNA plasmídeo (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) foi rotulada neste protocolo.

1. Dissolver quantidade desejada de PDNA em tampão TE de DNase e livre de RNase-free (qualidade de biologia molecular-grade) de água para fazer uma solução de DNA 1μg/μL.
2. Realizar a reação rotulagem usando as misturas de reacção seguinte. Adicione o rótulo de TI último reagente.

DNA para a reação 100μg:

DNase-RNase livre e sem água	75 mL
Tampão 10X Labeling A	20 mL
1μg/μL DNA	100 L
Rotulá-la de reagente	5 mL
Volume Total	200 mL

3. Incubar a reação a 37 ° C por 1 hora.
4. Purificar a amostra rotulada por etanol ou isopropanol precipitação seguintes protocolos padrão.

Nota: as colunas de filtração em gel com base pode levar a absorbância UV alto ou o fundo de fluorescência, que pode afetar a quantificação de DNA ou a caracterização de fluorescência.
Nota: O nível de Biotinilação pode ser determinada por Haba baseado em testes.

B. Rotulagem da Polymer Cy5-Catiônicos

Quitosana (390 kDa, 83,5% desacetilado, Vanson, Redmond, WA) foi usado como um polímero catiônico modelo neste estudo. As aminas primária gratuita na espinha dorsal do polímero quitosana foram marcados com Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

1. Para facilitar a conjugação completa dos Cy5 corante, calcular a quantidade necessária de Cy5-NHS tal que a relação molar de Cy5: aminas primárias é de 1: 200.
2. Ajustar o pH da solução de quitosana (em tampão acetato 25mM) para ~ 6,5 pela adição de NaOH. Note-se que a reação do SNS é mais eficiente em pH básico, mas a solubilidade da quitosana aqui limita a faixa de pH de trabalho.
3. Agitando, lentamente adicione o montante calculado de Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) para a solução de quitosana de forma gota a gota.
4. Agitar a mistura no escuro à temperatura ambiente durante a noite.
5. Para purificar, diálise com 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) por 2 horas contra tampão acetato de 1% à temperatura ambiente no escuro.
6. Substituir buffer e diálise outra hr 2 à temperatura ambiente no escuro.
7. Substituir buffer e diálise overnight a 4 ° C no escuro.
8. Loja purificada rotulados de polímero a -20 ° C.

Nota: Neste estudo, uma curva padrão é construída através da medição da intensidade de emissão de Cy5 NHS-éster a 670 nm. Caracterizar a densidade de rotulagem, pela medição da emissão obtidos a 670 nm de Cy5 marcado com quitosana na curva padrão. Absorbância também pode ser usado para determinar a eficiência de marcação, mas não foi realizado aqui.

C. Preparação do QD-rotulados de DNA e Cy5-Polymer

A razão molar de PDNA para QD foi mantido em excesso (PDNA: QD ≈ 1, 2) para garantir a conjugação completa dos QDs para PDNA. O número de QDs rotulados em cada PDNA pode ser estimado através TEM imagens ou outros recursos equivalentes. Em nosso estudo, o número de QDs por PDNA é estimado em ~ 1-3 por TEM e espectroscopia única molécula. Use ^um Millipore Milli-Q de água gradiente (> 18,0 MW, 0.2um filtrada) durante a preparação.

1. Calcular a quantidade necessária de quitosana para 10μg PDNA desejado de acordo com relação N / P, a relação teórica de aminas protonadas na solução de quitosana para os fosfatos negativa na solução de DNA.
2. Adicionar estreptavidina-funcionalizados 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) para a solução PDNA biotinilado.
3. Incubar a solução à temperatura ambiente no escuro por 15 min.
4. Adicione o DNA-QD rotulados em 50 solução de sulfato de sódio mM para fazer a 200μL volume final.
5. Diluir Cy5-quitosana, de acordo com a desejada relação N / P, com água Milli-Q para fazer a 200μL volume final.

Nota: Mantenha a reação no escuro para evitar fotobranqueamento possível.
Importante: Tenha cuidado ao usar o Qdot 605 ITK ™ estreptavidina conjugada (a série ITK), como pontos quânticos neste catálogo são projetados com a finalidade de FRET. A série Qdot regulares são conjugados com uma camada de PEG para evitar ligações não específicas, especialmente para a rotulagem celular. No entanto, essa camada adicional aumenta a distância doador receptor, resultando em reduced eficiência da transferência de energia.

D. Fabricação do SU-8 Mestres usando fotolitografia padrão

1. Wafer Si é piranha limpo e cozido a 200 ° C por 5 min.
2. Para a espessura de 25μm mestre designado, casaco girar o fotorresiste negativo (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA), em Si wafer a 2000 rpm por 30 seg.
3. Bake suave a bolacha numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C.
4. Exponha à luz UV (365 nm) para 250mJ/cm ² a máscara de um filme (CAD / Art Services, Bandon, OR), contendo o projeto de microcanais.
5. Pós-exposição cozer a bolacha numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / hr a 95 ° C.
6. Desenvolver o wafer usando SU-8 desenvolvedor fotorresiste.
7. O wafer é difícil cozido estampados numa placa de aquecimento com uma rampa de 65 ° C / h até 200 ° C. Manter o wafer de 200 ° C por pelo menos 5 horas, então, gradualmente, esfriar a bolacha até à temperatura ambiente.

Importante: rampa gradual durante o SU-8 processo de cozimento mestre é necessário, caso contrário, o SU-8 estrutura pode destacada do wafer de silício ou fissuras na estrutura do SU-8 pode ser induzida pelo estresse de liberação.

E. Moldagem Réplica de PDMS com os mestres e União para a tampa de vidro

1. O mestre SU-8 é colocado em um barco de pesagem.
2. Mix de silicone elastômero e agente de cura (Poli (dimetilsiloxano), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI), em um 10: 1 ratio.
3. Despeje a mistura sobre o PDMS mestre SU-8 e deixar o barco pesa num exsicador de vácuo para remover as bolhas.
4. Curar o PDMS a 65 ° C por 1-2 horas.
5. Descasque a tira PDMS do molde mestre Si.
6. Entradas e saídas de soco canal do dispositivo fluídico.
7. Limpe a tira de PDMS e tampa de vidro com etanol e, em seguida, secar ao ar.
8. Tratar a limpo PDMS tiras e tampa de vidro com plasma de oxigênio (20W por 1min).
9. Imediatamente tira o vínculo PDMS com tampa de vidro.
10. Deixe o chip colado microfluídicos no forno a 95 ° C para pernoite.

Importante: O tratamento do plasma e assar durante a noite são essenciais para a força de ligação reforçada.

F. Monitorar a formação de DNA Nanocomplexes No dispositivo micro

1. Preencha o canal microfluídicos com água (para garantir que não haja bolhas dentro do canal microfluídicos), antes de carregar os reagentes para garantir fluidez durante o experimento.
2. Carregar o DNA QD-rotulados e Cy5 marcado quitosana soluções em duas seringas de vidro individuais, através da tubulação descrito no vídeo.
3. Conecte o tubo com as duas entradas de dispositivos microfluídicos. Ser cautelosos para não introduzir qualquer ar durante o processo. Definir a taxa de fluxo em 20nL/min (PHD-2000 bomba de seringa, Holliston, MA), sob condições de fluxo laminar.
4. Verifique os microcanais sob o microscópio.
5. Quando o fluxo é estável (~ 15 a 20 minutos), QD-mediada FRET devem ser observadas no centro do canal.
6. Tirar fotos de fluorescência (CCD refrigerado, Qimaging, BC, Canadá) em diferentes locais ao longo do canal.
7. Analisar as imagens de fluorescência com ImageJ e OriginLab.

Figura 1. QD-FRET fornece uma indicação sensível do início da Nanocomplexes DNA auto-montagem

1. Quantum dot-mediada transferência de energia de ressonância de fluorescência (QD-FRET) pode fornecer uma indicação quantitativa e altamente sensível de estabilidade Polyplex em qualquer ambientes extra-ou intra-celular, permitindo a detecção inequívoca do início das interações entre o DNA eo portador do gene. O par FRET, 605QD e Cy5, foi escolhido com base na maximização sobreposição espectral entre o doador eo receptor e minimizar o potencial cross-talk. Para este par, a distância é 69.4Å Förster. ³
2. Auto-montagem do nanocomplexes QD-FRET DNA. DNA plasmídeo aniônicos (PDNA) ea transportadora gene catiônicos foram marcadas com QD (doador de energia) e Cy5 (energia aceitante), respectivamente. QD-FRET nanocomplexes foram formados através de coacervação complexa eletrostática. Após a excitação a 488 nm, QD-FRET mediada emissão Cy5 indicado formação de um nanocomplex compacto e intacta. O tempo de permanência (t _R) pode ser calculado de acordo com a distância (x) que mede a partir de onde as duas correntes se encontram para a posição de reação sob investigação, ea velocidade média do fluxo (v). Devido à natureza do fluxo laminar, mistura só ocorre na interface (centro de cada imagem), permitindo o cálculo preciso de transporte de massa em função de t _R. A resolução temporal pode ser ajustada pela variação da applietaxas de fluxo d. (Inset) FRET mediada por sinal foi observada imediatamente na interface, quando as duas correntes atendidas, indicando que a ligação foi rápida, ocorrendo dentro de alguns milissegundos de acordo com as taxas de fluxo aplicadas. Bar escala: 100μm.

Discussão

• Importância do nosso trabalho:
  1. Esta é a primeira tentativa de monitorar poliméricos DNA nanocomplex auto-montagem cinética em tempo real (milissegundo resolução) através QD-FRET respostas dentro de um chip simples microfluídicos.
  2. QD-mediada FRET fornece uma indicação altamente sensível e quantitativa do aparecimento de interações moleculares e em todo o processo de auto-montagem, enquanto que a microfluídica oferece um microambiente bem controlados para espacialmente analisar o processo durante a síntese nanocomplex DNA.
  3. A integração de microfluídica e nanofotônica sugere uma abordagem nova e interessante investigar qualquer tipo de reações de complexação.
  4. O resultado QD-FRET nanocomplexes DNA poliméricos podem ser facilmente aplicadas para o estabelecimento de relações estrutura-função ^1,2.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-8	MicroChem Corp.	SU-8 2025
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Plasmid DNA	Clontech Laboratories	pEGFP-C1	4.9 kb, MW = 3.3 x 106
LabelIT Biotin Labeling Kit	Mirus Bio LLC	MIR 3400	Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.
Streptavidin 605QD	Invitrogen	Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate
Cy5-NHS Ester	Amersham	PA15101
Chitosan	Vanson	390 kDa	83.5% deacetylated
Cover Glass	Fisher Scientific	12-545C	No. 1; Size: 40 x 22mm
Gastight Glass Syringe	Hamilton Co	TLL series	50μL to 500μL depending on sample volume
Tygon Tubing	Small Parts, Inc.	0.02 ID, 100ft	Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft
Connector	Small Parts, Inc.	HTX-23R	Customized in length of 0.750"
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD-2000
CCD	QImaging	Intensified Retiga Cooled
Microscope	Olympus Corporation	BX-51	100W mercury arc lamp
ImageJ	National Institutes of Health	v1.36b	http://rsb.info.nih.gov/ij
Origin Pro8	OriginLab	Student Version
Microscope Filter sets	Omega Optical	475AF40	Excitation filter in both channels
Microscope Filter sets	Omega Optical	595AF60	Emission filter in 605QD channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	670DF40	Emission filter in QD-FRET channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	500 DRLP	Long pass dichroic in 605QD channel
Microscope Filter sets	Omega Optical	595DRLP	Long pass dichroic in QD-FRET channel