בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

Summary

מיתרי הטבור משמשים כדי לבודד לתאי שריר חלק על ידי דרכים שונות. בעבודה זו השתמשנו טיפול אנזימטי כדי לבודד לתאי שריר חלק.

Abstract

חבל הטבור האנושי (UC) היא מדגם ביולוגי שניתן להשיג בקלות רק לאחר הלידה. זה מדגם ביולוגי, רוב הזמן, מושלך ואיסוף שלהם אינה מעידה על כל סיכון נוסף בריאות היילוד או של אמו. יתר על כן חששות לא אתית גדלים. UC מורכב ידי וריד אחד ושני עורקים שממנו הן בתאי האנדותל (ECS)

Protocol

1. העורקים מתקבלים UC חתיכות של 3-7 ס"מ.
2. ג'לי וורטון של שמקיפה את העורקים הוסר בקפידה על ידי גזירה במספריים זה.
3. מחט קהה סוף בקוטר חיצוני של 0.6-1mm הוכנס על 7mm מקצה אחד של העורקים גזור.
4. כדי להסיר את הדם שנותר בתוך כלי הדם, העורקים מוחזקים אנכית perfused עם כ 20-40 מ"ל, תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS), באמצעות מזרק 20 מ"ל קשור מחט. אם יש צורך, בשלב זה כביסה חזר על עצמו כמה פעמים.
5. הנוהל חזר על עצמו אותו משתמש RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS).
6. אחת הגפיים של כלי הדם נסגר. מזרק 10 מ"ל היה קשור מחט ו perfused עם 3 מ"ל של collagenase סוג אני (800 יחידות / מ"ל ​​בפתרון שנאגרו של האנק מלח (HBSS)). ואז extremityof שני כלי נסגר גם הוא.
7. הספינה הודגר עם פוספט שנאגרו תמיסת מלח (PBS), במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהתרגשות.
8. אחרי הקצוות של כלי קוצצו כדי לאסוף את SMCs חינם. העורקים היו perfuse עם מ"ל כ 20 עד 40 מתוך DMEM-F12 בתוספת 5% FBS ו אנטיביוטיקה כדי שפופרת 50 מ"ל.
9. הצינור היה centrifuged בטמפרטורת החדר (250 גר ', 8 דקות), ותא גלולה היה resuspended ב 5 מ"ל של DMEM-F12 בתוספת 5% FBS.
10. השעיית תא הועבר קולגן מצופה T-בקבוק וטופחו על 37 ° C, תחת אווירה של 5% CO ₂ humidified.
11. לאחר 16 שעות 5, הלא חסיד תאים drebis הסלולר הוסרו, 5 מ"ל של מדיום תרבות נוספה התאים הודגרו ב 37 ° C, תחת אווירה של 5% CO ₂ humidified.
12. תרבות התקשורת התא שונה כל 2 3 ימים, עד SMCs הגיעו למפגש.
13. לאחר המפגש הגיע תאים שהם זורעים לתוך שניים או שלושה 25 ס"מ ² T-צלוחיות.

ניקוי

1. השלך מחטים במיכל החדים.
2. השלך מזרקים במיכל Biohazard גדול.
3. מכניסים את כל רקמת לשקית Biohazard קטן. סגור את השקית להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס עד שריפה.
4. משרים את כל המכשירים virucide דקות לפחות 10.
5. חזור התקשורת בשימוש למקרר.
6. השלך את הכפפות פסולת Biohazard.

Discussion

SMC יכול לשמש כמודל עבור מבחני העתיד עם תרופות נחש, לבודד מבנית לאפיין L-סוג ערוצי סידן, ללמוד היבטים תאית ומולקולרית של תפקוד כלי הדם, ולהשתמש בהם בהנדסת רקמות. SMCs ו ECS הם היסוד לפיתוח biomaterials חדש שיכול לשמש בייצור של כלי דם סינתטי למחצה לשימוש בבני אדם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-F12	Sigma-Aldrich	095K8311
Fetal bovine serum (FBS)	Biochrom AG	0117T
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	3103806
Collagen	Sigma-Aldrich	067K2302
Antibiotic			10 μL/ 1 mL of medium
Scissors			Sterilized
Needle			Diameter of 0.6-1mm
Syringe			10 - 20 mL
Physiological Saline Solution (PSS)			20-40 mL per artery
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	047K1052	3 mL per artery
Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS)			Diluted collagenase
Phosphate buffered saline solution (PBS)			Warmed to 37°C