Изоляция по правам артерии пуповины гладкомышечных клеток (HUASMC)

Резюме

Пуповины используются для изоляции гладкомышечных клеток по-разному. В этой работе мы использовали ферментативный лечения изолированных гладкомышечных клеток.

Аннотация

Человеческой пуповины (UC) является биологической пробы, которые могут быть легко получены сразу после рождения. Эта биологическая проба, большую часть времени, отбрасываются и их коллекции не предполагает какого-либо дополнительного риска для здоровья новорожденного или матери с. Кроме того никаких этических проблем подняты. UC состоит одна вена и две артерии, из которых как эндотелиальные клетки (ECS)

протокол

1. Артерии получаются из кусочков UC из 3-7 см.
2. Желе Уортон, которая окружает артерий была тщательно удалены резки его ножницами.
3. Тупой конец иглы внешним диаметром 0,6-1мм была вставлена ​​около 7 мм от одного конца расчлененный артерий.
4. Для удаления крови оставаясь внутри сосудов, артерий являются вертикально состоялся и озарен, примерно от 20 до 40 мл, физиологический раствор (PSS), используя 20-мл шприца, соединенного с иглой. При необходимости эту промывки повторялась несколько раз.
5. Такую же процедуру повторяют с использованием RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
6. Один оконечности кровеносный сосуд был закрыт. 10-мл шприц был связан с иглой и озарен 3 мл коллагеназы типа I (800 ед / мл в буферном солевом растворе Хэнка (HBSS)). Затем другие extremityof судна был также закрыт.
7. Судно инкубировали с фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS), в течение 15 мин при 37 ° С при перемешивании.
8. После концах судна были вырезаны, чтобы собрать свободные ГМК. Артерии были заливать примерно с 20 до 40 мл DMEM-F12 с добавлением 5% от FBS и антибиотиков для 50-мл трубки.
9. Трубки центрифугировали при комнатной температуре (250 г, 8 мин), а клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл DMEM-F12 с добавлением 5% от FBS.
10. Клеточная суспензия была передана коллагена покрытием T-колбы и инкубировали при 37 ° С, при 5% СО ₂ влажной атмосфере.
11. После 5 16 ч, не соблюдают клеток и клеточных drebis были удалены, 5 мл культуральной среде был добавлен и клетки инкубировали при 37 ° С, при 5% СО ₂ влажной атмосфере.
12. СМИ клеточной культуры меняли каждые 2 3 дня, пока не достигли слияния ГМК.
13. После слияния клетки достигли они были посеяны на две или три 25 см ² T-колб.

Уборка

1. Утилизировать иглы в контейнере острых предметов.
2. Утилизация шприцев в большой контейнер для биологически опасных.
3. Положите все ткани в небольшой сумке биологической опасности. Закройте пакет и заморозить при -20 ° С до сжигания.
4. Замочить всех инструментов в virucide по крайней мере 10 мин.
5. Возврат неиспользованных средств массовой информации в холодильник.
6. Утилизировать перчатки в биологически опасных отходов.

Обсуждение

SMC может быть использована в качестве модели для будущих анализов с констриктор наркотики, чтобы изолировать и структурно охарактеризовать L-типа кальциевых каналов, изучать клеточные и молекулярные аспекты сосудистую функцию и использовать их в тканевой инженерии. ГМК и этике имеют ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-F12	Sigma-Aldrich	095K8311
Fetal bovine serum (FBS)	Biochrom AG	0117T
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	3103806
Collagen	Sigma-Aldrich	067K2302
Antibiotic			10 μL/ 1 mL of medium
Scissors			Sterilized
Needle			Diameter of 0.6-1mm
Syringe			10 - 20 mL
Physiological Saline Solution (PSS)			20-40 mL per artery
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	047K1052	3 mL per artery
Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS)			Diluted collagenase
Phosphate buffered saline solution (PBS)			Warmed to 37°C