Isolamento da Human Umbilical células musculares arteriais (HUASMC)

Resumo

Os cordões umbilicais são usados ​​para isolar as células do músculo liso por caminhos diferentes. Neste trabalho utilizou-se o tratamento enzimático de células musculares lisas isoladas.

Resumo

O cordão umbilical humano (UC) é uma amostra biológica que pode ser facilmente obtida logo após o nascimento. Esta amostra biológica é, na maioria das vezes, descartada e sua coleção não implica qualquer risco acrescido para a saúde dos recém-nascidos ou a mãe s. Além disso há as questões éticas são levantadas. A UC é composta por uma veia e duas artérias do qual ambas as células endoteliais (CE)

Protocolo

1. Artérias são obtidos a partir de peças UC de 3-7 cm.
2. Geleia de Wharton que envolve as artérias foi cuidadosamente removido, cortando-a com uma tesoura.
3. Uma agulha sem corte-extremidade de um diâmetro externo de 0,6-1mm foi inserido cerca de 7 mm de uma extremidade das artérias dissecadas.
4. Para remover o sangue restante no interior dos vasos, as artérias são verticalmente realizada e perfundidos com, aproximadamente 20 a 40 mL, solução salina fisiológica (PSS), usando uma seringa de 20 ml conectada a uma agulha. Se necessário, esta etapa de lavagem foi repetida por várias vezes.
5. O mesmo procedimento foi repetido utilizando RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
6. Uma extremidade do vaso sangüíneo foi fechado. A seringa de 10 mL foi conectada à agulha e perfundidos com 3 mL de colagenase tipo I (800 unidades / mL em solução de Hank Sal Buffered (HBSS)). Em seguida, o extremityof outros o navio também foi fechado.
7. O navio foi incubada com solução salina fosfato (PBS), por 15 min a 37 ° C com agitação.
8. Após o término do navio foram cortadas para recolher o SMCs livre. As artérias foram perfundir com aproximadamente 20 a 40 mL de DMEM-F12 suplementado com 5% de SFB e antibióticos a um tubo de 50 mL.
9. O tubo foi centrifugado à temperatura ambiente (250 g, 8 min) e pellet celular foi ressuspendido em 5 mL de DMEM-F12 suplementado com 5% de FBS.
10. A suspensão celular foi transferida para um colágeno revestido T frasco e incubados a 37 ° C, sob uma atmosfera de 5% CO ₂ umidificado.
11. Após 5 16 h, as células não-aderentes e drebis celulares foram removidos, 5 mL de meio de cultura foi adicionado e as células foram incubadas a 37 ° C, sob uma atmosfera de 5% CO ₂ umidificado.
12. Os meios de cultura de células foi trocado a cada dois três dias, até que chegou SMCs confluência.
13. Depois que as células atingiram confluência foram semeados em dois ou três 25 cm ² T-frascos.

Limpeza

1. Dispor de agulhas em recipiente adequado.
2. Dispor de seringas em recipiente biohazard grande.
3. Colocar todo o tecido em um pequeno saco de risco biológico. Feche o saco e congelar a -20 ° Celsius até a incineração.
4. Mergulhe todos os instrumentos em virucide por pelo menos 10 min.
5. Retorno de mídia não utilizados para geladeira.
6. Dispor de luvas em resíduos de risco biológico.

Discussão

O SMC pode ser usado como modelo para testes futuros com drogas constrictor, para isolar e caracterizar estruturalmente os canais de cálcio tipo L, para estudar os aspectos celulares e moleculares da função vascular e usá-los em engenharia de tecidos. SMCs e ECs são fundamentais para o desenvolvimento de novos biomateriais que podem ser usados ​​na produção de semi vasos sanguíneos sintético para ser usado em humanos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM-F12	Sigma-Aldrich	095K8311
Fetal bovine serum (FBS)	Biochrom AG	0117T
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	3103806
Collagen	Sigma-Aldrich	067K2302
Antibiotic			10 μL/ 1 mL of medium
Scissors			Sterilized
Needle			Diameter of 0.6-1mm
Syringe			10 - 20 mL
Physiological Saline Solution (PSS)			20-40 mL per artery
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	047K1052	3 mL per artery
Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS)			Diluted collagenase
Phosphate buffered saline solution (PBS)			Warmed to 37°C