תרופות משלוח מערכתית מקומי לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית מודלים מכרסמים

Summary

בדיקות פרה יסודית של תרופות הפועלות על מערכת העצבים המרכזית כרוך לעתים קרובות בהערכת השוואת biodistribution התרופה בשיתוף עם מסלולים ספציפיים של הממשל. הנה שלוש שיטות נפוצות של משלוח מערכתית (תוך ורידי, intraperitoneal, ובעל פה), כמו גם שיטה למסירה מקומית (הסעה משופרת משלוח) הם הוכיחו בעכברים.

Abstract

בדיקות פרה יסודית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הרפוי כולל שיקול של מסלולים של הממשל biodistribution סוכן בהערכת היעילות הטיפולית. בין שני הסיווגים העיקריים של הממשל המקומי לעומת המערכתיות, גישות משלוח מערכתית הם העדיפו לעתים קרובות בשל קלות הניהול. עם זאת, משלוח מערכתית עלול לגרום ריכוז התרופה הכי מוצלח להיות מושגת בתוך מערכת העצבים המרכזית, להוביל למסקנות שגויות לגבי יעילות סוכן. מקומי משלוח הסמים שיטות פולשניות יותר, אבל עשוי להיות נחוץ כדי להשיג טיפולית CNS רמות התרופה. כאן, אנו להפגין טכניקה נכונה במשך שלושה מסלולים של אספקת סמים מערכתית: הזרקה תוך ורידי, הזרקה intraperitoneal, ו gavage הפה. בנוסף, אנו מציגים שיטה למסירה המקומית למוח: הסעה משופרת המסירה (CED). השימוש של תרכובות fluorescently שכותרתו נכלל בתחום ההדמיה עבור vivo ואימות של והתרופות הנכון. שיטות מוצגים באמצעות מודלים Murine, אבל יכול בקלות להיות מותאם לשימוש אצל חולדות.

Protocol

1. משלוח שיטות מערכתית

למרות משלוח מערכתית של תרופות לא הגישה היעילה ביותר להשגת ריכוזי התרופה גבוה מערכת העצבים המרכזית, משלוחים מערכתית נוח ומקובל היטב על ידי המטופלים. כאן, אנו תדגים נהלי המתאים שלוש גישות בשימוש שגרתי ניהול מערכתי: הזרקה תוך ורידי, הזרקה intraperitoneal, ו gavage הפה.

א הזרקה תוך ורידי (עורק הזרקת Tail)

1. לפני תחילת הליך, משקל הגוף של כל עכבר צריך להיות מוקלט. כמו בכל במחקרים פרה, משקל הגוף יש לעקוב באופן קבוע (פעמיים בשבוע או יותר) כדי להעריך את פוטנציאל רעילות התרופה. לא יותר מ 1% ממשקל הגוף של העכבר בנפח צריך להיות מוזרק בכל פעם אחת. לדוגמה, לא יותר 0.2mL של נוזל צריך להיות מוזרק עכבר 20 גרם. נוזלים כל מוזרק לווריד צריך להיות מעוקר בשיטה המתאימה.
2. העכבר יש לחמם למשך 5-10 דקות או באמצעות כרית חימום או מנורת חום כדי להרחיב את הווריד הזנב. אם באמצעות מנורת החום, לפקח על העכבר בכל עת כדי למנוע היפרתרמיה.
3. עכבר מועבר למכשיר מחזיק, אשר מגביל את העכבר תוך מתן אפשרות גישה וריד הזנב (ראה וידאו). ב זנב העכבר ישנם ארבעה כלי גלוי: כלי בצידי הגב ואת לרוחב הם ורידים, ואת כלי בצד הגחוני הוא עורק. כדי לגשת וריד הזנב, הזנב של העכבר מוחזק בנקודה דיסטלי ביותר, לסובב ב -90 מעלות כך הווריד פונה מעלה. הזריקה היא לנקות עם מטלית אלכוהול מזרק אינסולין 28g מוכנס, לצד משופעים למעלה, לתוך הווריד (ראה וידאו). אם המחט ממוקם כראוי הווריד, הוא אמור לנוע בחופשיות וללא לחץ. לאט לאט להזריק את התרופה עם לחץ גם על 5-10 שניות. אם שלפוחית ​​מופיע על הזנב, להפסיק הזרקה, כמו זו מצביעה על כך המחט היא כבר לא בתוך הווריד.
4. לאחר ההזרקה, להפעיל לחץ עדין על הזריקה עד שהדימום ייפסק. זה בדרך כלל לוקח 30-60 שניות. צג את העכבר למשך 5-10 דקות לאחר ההזרקה כדי להבטיח כי אין דימום נוסף.

ב הזרקת intraperitoneal

1. לפני תחילת ההזרקה, התרופה צריכה להיות טעון לתוך מזרק מצורף מחט 28g. ודא כי יש מקום המזרק לציור בחזרה על הבוכנה לפני הזריקה (למשל, אם הזרקת 200μL, לוודא כי הוא קיבולת מזרק 300μL או יותר).
2. הסר את העכבר מהכלוב בזנב ולמקם אותו על משטח מחוספס, כך העכבר יש משהו אחיזה. מכסה הכלוב היא בדרך כלל מספקת. אפשר העכבר כדי למתוח את הגוף שלה ואז בעזרת היד הלא דומיננטית שלך, לתפוס את העור בצד האחורי של העכבר, מקפיד קלות קמצוץ העור ככל האפשר בין האגודל האצבע והאמה (ראה וידאו). הפעל את העכבר מעל כך את הבטן של העכבר פונה מעלה. אם העכבר יכול לנוע בחופשיות בראשה, לשחרר את האחיזה ולנסות שוב, כדי למנוע ננשך במהלך ההזרקה.
3. ביד הדומיננטית שלך, להרים את המזרק והכנס את המחט בזווית של 30 מעלות לתוך ברבע השמאלי התחתון של העכבר (ראה וידאו). החזקת העכבר הפוכה מעט יעזור להזיז את האיברים מן הזריקה. כדי לוודא שהמחט נמצאת בחלל intraperitoneal, למשוך בחזרה על הבוכנה את המזרק. אם כל נוזל או דם מופיע המזרק, אז המחט לא במרחב intraperitoneal, ויש להסירם. אם לא נוזל aspirated לתוך המזרק, ואז מזריקים את תוכן המזרק עם הלחץ גם על 1-5 שניות, שחרר את העכבר.
4. צג את העכבר למשך 5-10 דקות לאחר ההזרקה על מנת להבטיח כי העכבר חוזר רמות הפעילות הרגילה.

ג אוראלי Gavage

1. לפני תחילת ההזרקה, להקליט את משקל העכבר. הנפח המקסימלי שניתן להעביר על ידי gavage הפה 10 מ"ל לקילוגרם של משקל גוף. לדוגמה, עוצמת קול גבוהה יותר עבור עכבר 20 גרם יהיה 200μL. ניסיון להזריק כמויות גדולות עלול לגרום ריפלוקס, אשר יגרום משלוח סמים שלם. אם יש צורך לנהל כרכים גדול יותר שצוין לעיל, רבים כמו שלוש מנות יכול להיות מנוהל על 24 שעות.
2. כדי למנוע ניקוב הוושט, חשוב למדוד את אורך המחט gavage עבור כל עכבר. החזק קצה הכדור 18g מעוקל מחט gavage על הצלע האחרונה של העכבר, ולאחר מכן לסמן את אורך בקצה ראשו של העכבר באמצעות סמן קבע (ראה וידאו). במהלך gavage, סימן זה תהיה נקודת עצירה במהלך הכנסת מחט לתוך הפה של העכבר.
3. לרסן את העכבר באמצעות אחיזה ביד זהה זריקה intraperitoneal. הכנס את המחט gavage בפה, על הלשון, אדוהnce את המחט דרך הלוע. אל תכניס את המחט בעבר סימן לעצור. המחט צריכה להתקדם בצורה חלקה בלי לחץ (ראה וידאו). אם אתה נתקל בלחץ, להפסיק למשוך את המחט כדי למנוע הזרקת נוזל לריאות.
4. בעזרת המחט במקום, לוחץ על המתג מעל 1-5 שניות ולאחר מכן להסיר את המחט בזווית זהה שזה הוכנס. צג את העכבר למשך 5-10 דקות, הקדשת תשומת לב סימנים של נשימה מאומצת אשר עשוי להצביע על נוזל כי חתמה על הריאות.

2. משלוח מקומי

חריפה הסעה משופרת משלוח

א בנייה Probe

צינורית ריפלוקס עמידים CED עבור מכרסמים עדיין לא זמינה באופן מסחרי. להלן נדגים שיטה לבנייה צינורית אשר הותאם מתוך שיטה שתוארה לראשונה על ידי קראוזה ואח' (קראוזה 2005).

• הצינורית מורכב משלושה חלקים (איור 1): צינורות 100uM סיליקה בקוטר שדרכו זורם infusate, מחט מתכת נוקשה תמיכה מבנית, וגמישה צינורות טפלון לטעינת infusate.
• כדי להשיג את מחט מתכת קשיחה, השתמש להבה פתוחה כדי להמיס את הפלסטיק על קטטר Surflo IV (24G stylet) באמצעות פינצטה להוציא את המחט מתכת. שאר הקטטר יכול להיות מושלך. גזור אורך של צינורות סיליקה (OD 0.163mm), מעט יותר מאשר מחט המתכת, באמצעות להב חד בקצה גילוח. התפקיד סיליקה צינורות בטיפה קטנה של דבק מהיר cyanoacrylate משחק המבוסס (למשל, בדבק מגע דבק), נזהר שלא לקבל כל דבק על הקצוות של הצינור. הכנס את צינורות סיליקה את המחט מתכת ולתת להתייבש במשך 5 דקות.
• לאחר יבש, צינורות סיליקה צריך להיות מודבקת היטב המחט. קצוות של סיליקה צריך להיות מטופח, כך 2mm של צינורות בולט סיליקה מסוף הצביע המחט ו 3mm של צינורות בולט סיליקה מסוף שטוח (ראה וידאו).
• חותכים מקטע של צינור טפלון 20 ס"מ אורך. מגלגלים את מחט מתכת טיפה קטנה של דבק, שוב נזהר שלא לקבל דבק על הקצוות של הצינור סיליקה כמו זה יהיה להדביק את הצינורית. הכנס את המחט לתוך צינורות טפלון עד לעומק של 1cm. תן יבש במשך דקה 1. באמצעות אקדח דבק, להחיל טיפת דבק חם משותף בין מחט המתכת צינורות טפלון (ראה וידאו). ודא משותף כולו מכוסה מכל הצדדים ולתת להתייבש במשך שעה לפחות 1. Cannulas יכול להתבצע עד שבוע מראש לאחסן בטמפרטורת החדר.

ב 'סדר עירוי

• כדי להכין את אזור הניתוח, משטחים כל צריך לרסס עם חומר חיטוי, כגון פתרון chlorhexidine 2%. כפפות מנתחים סטרילית יש ללבוש במהלך ההליך. משטחים מכוסים עם וילונות ואז סופג. אספקה ​​הבאים צריך להיות ממוקם באזור הניתוח:
  • כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף העכבר
  • שתי צלחות פטרי קטן, אחד המכיל מי חמצן 3%, ואף אחד המכיל chlorhexidine 2%
  • גזה סטרילי כותנה מטליות
  • אזמלים חד פעמי סטרילי (מספר 21)
  • מחטים 22g סטרילית
  • עכבר stereotaxic מסגרת
  • שיעור מבוקרת מזרק משאבה
  • Autoclaved עכבר העור מהדק, סיכות, ואת מסיר מצרך
• כדי הגדרת את הצינורית CED, לצרף מזרק 1mL אל צינורות טפלון באמצעות סט של מתאמי מזרק פלסטיק. הצינורית צריך להיות מודבקת למסגרת stereotaxic כך הוא בניצב לפני השטח כירורגי (ראה וידאו). כדי לחטא את הצינורית, למלא את המזרק 1mL עם 70% אתנול ו לוחץ על המתג כדי להפעיל את אתנול באמצעות צינורית. חזור על תהליך זה באמצעות סליין סטרילית, ובדוק אם ההדלפות סביב המפרקים צינורית. כדי לחטא את החלק החיצוני של הצינורית, לנגב בעדינות עם אתנול 70% לנגב.
• מלאו את הצינורית עם מי מלח סטרילית ולאחר מכן למשוך את הבוכנה עד כדי כך בועת אוויר קטנים נשאבים לתוך הצינורית. זו בועת אוויר יפרידו את infusate מ מלוחים של הצינורית. ואז, infusate backload שלך (ראה וידאו). חבר את מזרק כדי לשאוב את המזרק ואת משאבת הממשלה על ידי ריצה בקצרה את הצינורית.
• עכבר שלווים באמצעות הרדמה המוזרק להכין את העור על ידי שטיפת מספר פעמים (שניות 50-10) עם פיסת גזה סטרילי טבול הפתרון chlorhexidine 2%. משחת עיניים צריך להיות מוחל על העכבר כדי לשמור על לחות נאותה במהלך ההליך. באמצעות אזמל סטרילי, ליצור חתך sagittal יחד במרכז הגולגולת, כ 1.5cm ארוך (ראה וידאו). פני הגולגולת הוא ניקה ואז באמצעות מקלון צמר גפן טבול פתרון 3% חמצן. תשמרי על עצמך כדי להימנע מקבלת חמצן בעיני העכבר. התפרים של הגולגולת צריכה להיות ברורה בנקודה זו: אם הם אינם גלויים, ספוגית בעדינות את הגולגולת עם frאש ספוגית צמר גפן טבול בתמיסת מי חמצן 3%.
• זהה את גבחת (איור 2), ואז מודדים 2 מ"מ ימינה 1mm האחורי של מבנה זה כדי לאתר את האתר עירוי. באמצעות מחט סטרילית 22g, בעדינות ליצור חור בגולגולת, בשלב זה, על ידי סיבוב המחט נגד הגולגולת (ראה וידאו). הימנע מכריח את המחט כלפי מטה כנגד הגולגולת.
• בשלב זה, העכבר צריך להיות ממוקם בתוך מסגרת stereotaxic ולהתחיל לקבל הרדמה נשאפים (ראה וידאו). ניהול ההרדמה ברמה נמוכה (1%), בזהירות לפקח על העכבר לשינויים קצב הנשימה, התאמת הרדמה בהתאם.
• מקם את הצינורית מעל החור בגולגולת ואז 3mm נמוך מתחת לפני השטח את הגולגולת. בגין אינפוזיה, באמצעות שיעורי הבאים המשכים:

  0.1 μL / דקה 5 דקות
  0.2 μL / דקה 5 דקות
  0.5 μL / דקה 5 דקות
  0.8 μL / דקה עבור 7.5 דקות
  OFF דקה 1

• בסוף העירוי, לאט להסיר את הצינורית ואת ספוגית את הגולגולת עם מי חמצן 3%. החל שעווה עצם סטרילי אל החור (ראה וידאו). בעזרת מלקחיים, למשוך את העור יחד מעל הגולגולת מצרך להיסגר. עצירות צריכה להינתן להקלה בכאב שלאחר הניתוח.
• צג את העכבר שלאחר הניתוח עד שהוא חוזר להכרה וניידות. בשל אורכו של ההליך, זה עלול לקחת עד שעה עבור העכבר כדי להחזיר לפעילות מלאה. במהלך הזמן הזה במקום את הכלוב העכבר על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה, ואל הבית העכבר מתאוששת עם עכברים פעילים אחרים.
• סיכות העור יש להסיר שבוע לאחר הניתוח.

ג Imaging in vivo

Infusate fluorescently שכותרתו ניתן הדמיה הבאים הממשל CED, והוא יכול להיות במעקב אחר שינויים בעוצמת האות, כמו גם במיקום האות. בדרך כלל, הדרך הטובה ביותר היא להמתין 2-3 שעות לאחר העירוי לתמונה, כדי לאפשר העכבר כדי להתאושש העירוי.

• עבור הרדמה במהלך הדמיה, להשתמש רמה נמוכה של הרדמה נשאפים. מקם את העכבר, בצד הגב למעלה, בתחנת דימות (למשל, IVIS לומינה, Caliper מדעי החיים, Alameda, CA). באמצעות הגדרת מסנן מתאים פלואוריד כי הוא הדמיה, לרכוש תמונה. עבור CED, עירוי מוצלח צריך להראות רוב החומר במוח סמוך לאתר אינפוזיה (איור 3).

3. נציג תוצאות

חוסר תגובה שלילית על הממשל של טיפול הוא אינדיקטור חשוב של זריקה מוצלחת. לדוגמה, לאחר הזרקה לווריד הזנב לא צריך להיות שינוי במראה (למשל, גודל, צבע) של הזנב. בועה או שלפוחית ​​בעקבות הזרקה לווריד הזנב יצביע תת עורית, ולא מסירה תוך ורידי, טיפול. עבור זריקות intraperitoneal, מכה על העור או שינוי צבע של הבטן עשוי להצביע על הזרקה תת עורית או נזק מבנים פנימיים. ב gavage הפה, עכבר עם נשימה מאומצת או שיעול עשוי להצביע על כך הנוזל שהוזרק לתוך הריאות ולא לקיבה.

עבור CED, תפקוד נוירולוגי חשוב להערכת הממשל מוצלח של הטיפול. עכבר כי הוא מציג התקפים או hemiparesis אולי קיבלו עירוי פסולים. אם infusate פלורסנט משמש, in vivo הדמיה יכול להיות מיושם להערכת הממשל מוצלח (איור 3). אם infusate לא מותאמת לאתר של הזרקה, עירוי לא היה מוצלח.

איור 1: קנית CED ו כירורגי הגדרת. אלמנטים בסיסיים של אספקה ​​הסעה משופרת הניתוח הגדרת מוצגים. משאבת microinfusion (א) מצורפת צינורית אינפוזיה (B, הראו מוגדל בחלק העליון). מסגרת stereotaxic (ג) משמש כדי למקם את החללית. תמונה זו אינה כוללת חימום ציוד הרדמה משמש גם במהלך ההליך.

איור 2: גולגולת עכבר התפרים. האתר עירוי CED (הכוכב האדום) יכול להיות ממוקם על ידי זיהוי בצומת של התפרים sagittal ו העטרה (גבחת) ולאחר מכן מדידה 2 מ"מ לרוחב ו 1mm האחורי של גבחת.

איור 3: תוצאות נציגת CED מוצלח. ליposomes שכותרתו עם הרבה צבע אדום ניאון היו חדורים לתוך המוח העכבר על ידי CED הדמיה הן in vivo ו vivo לשעבר. עירוי מוצלח מראה אות ניאון מקומי לאתר של עירוי הן in vivo (א) לשעבר vivo (B). האות צריך להיות מקומי כדי בחצי הכדור חדורים ללא דליפה לתוך האונה הנגדי.

איור 4: תמונה ייצוגית של CED מוצלחת לתוך גזע המוח עכברוש. ליפוזומים fluorescently שכותרתו היו החדיר לתוך גזע המוח עכברוש. בחולדות, ככל 20μL יכול להיות רווי. עובי מוגבר של הגולגולת עכברוש ועומק הזרקה מנועה in vivo הדמיה, אבל המיקום עירוי הנכון יכול להיות מאומת על ידי הדמיה vivo לשעבר של המוח גזור.

Discussion

הערכה Preclinical של היעילות של כל סוכן טיפולית חייבת להביא בחשבון מאפייני תרופתי של הסוכן ואת רקמת היעד של עניין. בעוד שיטות מערכתית של הממשל הם בכלל קליל יותר נסבל טוב יותר על ידי החולים, הסלקטיביות של מחסום דם מוח לעתים קרובות מחייב אספקה ​​מקומית של טיפול לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית. הנה, יש לנו הפגינו שיטה אחת של משלוח ישירות אל המוח: CED. צורות אחרות של משלוח מקומי למוח כוללים ניהול ישיר נוזל השדרה, הזרקת בולוס intratumoral, הזרקת חדרית. שיטות אלה, diffusibility של טיפולי חשוב מאוד, עם דיפוזיה עניים להגביל את אזור הכיסוי כדי מילימטרים ספורים מאתר ההזרקה (Jain 1989, בובו 1994). לעומת זאת, CED משתמשת בלחץ חיובי כדי להגדיל את שטח של חלוקת תרופות (בובו 1994), תוך מתן טיפול הכוונה למבנים neuroanatomical ספציפיים. במעבדה שלנו, יש לנו CED ביצע בהצלחה לתוך גזע המוח, כמו גם לתוך putamen caudate במכרסמים (איור 4).

היכולת לנהל CED במודלים של מכרסמים הפך חשוב יותר ויותר בשיתוף עם עניין גובר למקסם את היעילות הטיפולית בטיפול בסוגים שונים של מחלות מערכת העצבים המרכזית. CED ניתן להשתמש כדי לספק מגוון של סוכנים, כולל חלבונים מטוהרים, תרופות מולקולה קטנה, ווירוסים (גיל 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). מגוון של מחלות ניתן לטפל CED כולל סרטן של מערכת העצבים המרכזית (ימשיטה 2007) וכן מחלות ניווניות כגון פרקינסון (גיל 2003). כמו מחקר CED ממשיכה להתרחב, את הצורך בתחום ההדמיה vivo של טיפול מנוהל CED הוא דומה גוברת. בעוד דימות פלואורסצנטי הפגינו כאן עלול לא להיות גלויים דרך הגולגולת האנושית, שיטות אחרות העסקת שיתוף עירוי של סוכנים בניגוד MRI (דיקינסון 2008) מושכים עניין להערכת הישימות לניטור infusates בחולים עם מחלה במערכת העצבים המרכזית.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Chlorhexidine		Fisher	NC9756995	AKA “Nolvasan”
20g Needle		Becton Dickinson	305175
28g Needle (with syringe)		Fisher	22-004-270	AKA Insulin Syringe
3% Hydrogen Peroxide		Fisher	H312P-4	Store away from light
Cotton Swabs		Fisher	23-400-100	Autoclave before use
Cyanoacrylate-based Adhesive		Fisher	NC9592632	AKA “Krazy Glue”
Disposable Scalpels		Feather	2975	No. 21
Gauze		Fisher	22028563	Autoclave before use
Heating Pad		Dunlap	HP950
I.V. Catheter		Fisher	14-841-20
Infusion Pump		BASi	MD-1000, MD-1001
Living Image Software		Caliper Life Sciences	Contact for Quote
Ophthalmic Ointment		Cardinal Health	1272830	AKA “Akwa Tears”
Plastic Syringe Adaptors		Upchurch Scientific	P-604, P-200NX, P-215X, P-630	Fits on Luer Lock Syringes
Silica Tubing		Polymicro Technologies	2000020
Skin Stapler, Staples, Remover		Stoelting	59020
Stereotaxic Frame		Stoelting	51725
Teflon Tubing		Upchurch Scientific	1520
Xenogen Lumina		Caliper Life Sciences	Contact for Quote