齧歯類モデルで中枢神経系の疾患を治療するための全身および局所薬物送達

要約

中枢神経系に作用する薬剤の徹底した前臨床試験は、しばしば特定の投与経路に関連して薬剤の生体内分布を評価し、比較が行われ。ここでは、三、一般的に使用される全身送達の方法（、静脈内、腹腔内、および経口）と同様にローカル配信するための方法（対流強化配信）はマウスで実証されています。

要約

中枢神経系（CNS）の徹底した前臨床試験は、治療薬は、治療効果を評価する際に管理し、エージェントの生体内分布の経路の検討を含んでいる。管理の二つの主要な分類との間で、ローカル対全身、全身送達のアプローチは、多くの場合、管理の容易さのために好ましい。しかし、全身送達は、CNSにおいて達成されている次善の薬物濃度は高くなり、エージェントの有効性についての誤った結論につながる可能性があります。地元のドラッグデリバリーの方法はより侵襲的ですが、治療中枢神経系の薬物濃度を達成するために必要な場合があります。静脈内注射、腹腔内注射、および経口胃管栄養法：ここでは、全身薬物送達の3つのルートのための適切な手法を示す。対流強化配信（CED）：さらに、我々は、脳へのローカル配信のための方法を示しています。蛍光標識化合物の使用は、適切な薬剤投与のin vivoイメージングと検証のために含まれています。メソッドは、マウスモデルを使って表現されますが、簡単にラットでの使用に適合させることができる。

プロトコル

1。全身の配信方法

薬物の全身送達は、CNSに高い薬物濃度を達成するための最も効率的なアプローチではないが、全身の納入は、便利でよく患者さんに受け入れています。静脈内注射、腹腔内注射、および経口胃管栄養法：ここで、我々は3つの日常的に使用される全身投与のアプローチのための適切な手順を紹介します。

A.静脈内注射（尾静脈注射）

1. 手順を開始する前に、各マウスの体重を記録する。すべての前臨床試験と同様に、体重は、潜在的な薬剤の毒性を評価する（週2回以上）定期的に監視する必要があります。ボリュームのマウスの体重の1％以下が一度に注入する必要があります。例えば、これ以上の流体の0.2mlのよりは20グラムのマウスに注射してはならない。静脈内に注射、すべての流体は、適切な方法により滅菌されるべきである。
2. マウスは、尾静脈を拡張するための加熱パッドや熱のランプのいずれかを使用して5〜10分間温めてください。熱灯を使用する場合は、温熱療法を避けるために、すべての回でマウスを監視する。
3. マウスは、尾静脈（ビデオを参照）へのアクセスを許可しながらマウスを抑制する保持装置に転送されます。マウスの尾四つ目に見える血管があります。背側面上の血管は静脈であり、腹側の血管は動脈です。尾静脈にアクセスするには、マウスの尾は最も遠位の時点で開催され、静脈が上を向くように90度回転させている。注射部位をアルコール綿で洗浄され、28グラムのインスリン注射器は（ビデオ参照）を静脈内に、、面取り面を上に挿入されます。針が適切に静脈内に配置されている場合、それは圧力なしに、自由に移動してください。ゆっくりと5〜10秒以上であっても圧力で薬剤を注入する。ブリスターが尾に表示されている場合、これは針が静脈にもはやないことを示していないとして、注入停止。
4. 出血が止まるまで注入した後、注射部位に穏やかな圧力を与える。これは、通常30〜60秒かかります。それ以上の出血がないことを保証するために、注入後5〜10分間マウスを監視します。

B.腹腔内注射

1. 注入を開始する前に、薬は28グラム針に接続された注射器にロードする必要があります。注射の前にプランジャーをバック描画するための注射器にはスペースがあることを確認してください（200μLを注入する場合などは、、シリンジの容量は300μL以上であることを確認してください）​​。
2. マウスはグリップに何かを持つように、その尾部でケージからマウスを削除し、テクスチャ表面の上に置きます。ケージの蓋は通常は十分です。マウスがその身体をストレッチしてから、非利き手を使用できるよう、軽く親指と人差し指と中指（ビデオ参照）の間に、できるだけ多くの皮膚を挟まないように注意しながら、マウスの背中に皮膚を把握する。マウスの腹部は上を向いているので、マウスの電源を入れます。マウスが自由にその頭を動かすことができれば、注入時に噛まれることを避けるように、グリップを離して、もう一度試してください。
3. あなたの利き手で、注射器を拾うと、マウスの左下の象限（ビデオを参照）に30度の角度で針を挿入する。わずかに反転にマウスを置くと離れて注射部位からの臓器を動かすのに役立ちます。針は、腹腔内のスペースになっていることを保証するために、シリンジのプランジャーを後方に引いて。あらゆる液体や血液が注射器に表示される場合、針は腹腔内のスペースではなく、削除する必要があります。ない流体を注射器に吸入されていない場合は、1〜5秒以上であっても圧力でシリンジの内容を注入し、マウスを離します。
4. マウスは正常な活動レベルに戻すことを保証するために、注射後5〜10分間マウスを監視します。

C.強制経口投与

1. 注入を開始する前に、マウスの体重を記録する。強制経口投与によって供給可能な最大量は体重1kg当たり10mLをです。例えば、20グラムのマウスの最大量は200μLとなります。大きなボリュームを注入しようとすると、不完全な薬物送達を引き起こすれる、逆流が発生する可能性があります。それは上記以上のボリュームを管理する必要がある場合は、最大3つの用量は、24時間かけて投与することができる。
2. 食道を穿刺を避けるために、それは、各マウスの強制経口投与針の長さを測定することが重要です。マウスの最後の肋骨に強制経口針を湾曲18グラム、ボールの先端を保持し、永久的なマーカーを使用して、マウスの頭部の先端に長さをマーク（ビデオ参照）。強制経口投与時には、このマークを使用すると、マウスの口に針を挿入すると停止するポイントになります。
3. 腹腔内注射の場合と同じ手のグリップを使用してマウスを抑制する。舌を介して、口の中で強制経口投与針を挿入し、アドバ咽頭を通して針をNCEは。停止マークを過ぎた針を挿入しないでください。針は、どの圧力（ビデオを参照）することなくスムーズに進むはずです。もし圧力が発生した場合は、停止し、肺に液体を注入することを避けるために針を撤回。
4. 代わりに針で、1〜5秒以上のプランジャーを押し下げ、次にそれが挿入されたことと同じ角度で針を取り除く。液体が肺に入ったことを示す可能性があります苦心呼吸の兆候には細心の注意を払って、5〜10分間マウスを監視します。

2。ローカル配信

急性対流の強化配信

A.プローブ建設

げっ歯類の混合物を還流耐CEDカニューレは、まだ市販されていません。ここではまず、クラウゼら （クラウゼ2005）により記載された方法から適応されたカニューレの構築方法をデモンストレーションを行います。

• 100uM直径のシリカチューブ注入物が流れる、剛性構造支持のための金属針、および柔軟性のあるテフロンチューブ注入物をロードするための：カニューレは、三つの部分（ 図1）があります。
• 硬い金属の針を入手するには、Surflo静脈カテーテル（24グラムスタイレット）のプラスチックを溶融し、ピンセットを使用すると、金属針を除去するために裸火を使用してください。カテーテルの残りは破棄することができます。シングルエッジカミソリの刃を使用して、金属の針よりも少し長くシリカチューブ（外径0.163ミリメートル）の長さをカット。チューブの端面上の任意の接着剤を得るように注意しながらシアノアクリレート系速効性接着剤（例えばクレイジー接着剤）の小滴の役割シリカチューブ、。金属の針でシリカチューブを挿入し、5分間乾燥させる。
• 一度乾燥、シリカチューブがしっかりと針に貼付してください。シリカの両端が針と平らな端からシリカチューブの突出の3mmの先端からシリカチューブの突出の2ミリメートル（ビデオ参照）ようにトリミングする必要があります。
• 長さのテフロンチューブを20cmのセクションをカット。再びこれはカニューレを詰まらせるのでシリカチューブの端部に接着剤を得るように注意しながら、接着剤の小滴中の金属針をロールバックします。 1cmの深さにテフロンチューブに針を挿入します。 1分間乾燥させます。グルーガンを使用して、金属針とテフロンチューブ（ビデオを参照）とのジョイントにホットグルーのドロップを適用する。全体のジョイントがすべての側面に覆われていることを確認し、少なくとも1時間乾燥させる。カニューレは、事前に週まで行われ、室温で保存することができます。

B.の輸液手順

• 外科領域を準備するには、全ての表面は、2％クロルヘキシジン液などの消毒剤、噴霧されるべきである。無菌手術用手袋は、作業中に着用してください。表面は、吸収性のカーテンで覆われている。次の消耗品は、外科領域に配置してください。
  • マウスの体温を維持するために加熱パッド
  • 2％クロルヘキシジンを含む3％の過酸化水素を含むもの、一、二小シャーレ
  • 滅菌ガーゼや綿棒
  • 滅菌使い捨てメス（ナンバー21）
  • 滅菌22グラム針
  • マウス定位フレーム
  • 制御された速度のシリンジポンプ
  • オートクレーブしたマウス皮膚ホッチキス、ステープル、およびステープルリムーバー
• CEDカニューレを設定するには、プラスチック製のシリンジアダプタのセットを使用して、テフロンチューブに1mLの注射器を取り付けます。それは（ビデオ参照）外科表面に垂直になるようカニューレは定位固定フレームに貼付してください。カニューレを駆除するために、70％エタノールで1mLの注射器を記入し、カニューレを介してエタノールを実行するためのプランジャーを押し下げる。滅菌生理食塩水を使用してこのプロセスを繰り返し、そしてカニューレの関節周辺で漏れをチェックします。カニューレの外側を消毒するために、軽く拭く70％エタノールで拭いてください。
• 滅菌生理食塩水でカニューレを記入し、小さな気泡がカニューレに描画されるように注射器を後方に引いて。この気泡は、カニューレの生理食塩水から注入物を分離します。その後、荷物を積み込むあなたの注入物（ビデオを参照）。簡単にカニューレを実行することにより、シリンジポンプとプライムポンプにシリンジを接続してください。
• 注入された麻酔薬を使用し、滅菌ガーゼで数回（5〜10秒間）スワブで肌を準備落ち着いたマウスは、2％クロルヘキシジン溶液に浸漬。眼軟膏は、手順の間に十分な水分を維持するためにマウスに適用する必要があります。滅菌メスを使用して、（ビデオを参照）長さ約1.5センチメートル、頭蓋骨の中心に沿って矢状切開を作成します。頭蓋骨の表面は、3％過酸化水素溶液に浸した綿棒を使用して洗浄される。マウスの目には過酸化水素を避けるように注意してください。頭蓋骨の縫合線は、この時点では明らかなはずである：それらは表示されない場合は、軽く綿棒FRと頭蓋骨ESH綿棒は、3％過酸化水素溶液に浸漬。
• 注入部位を見つけるためにブレグマ（ 図2）し、右側に2ミリメートルを測定し、この構造体の1mmの後部を識別します。滅菌22グラム針を使用して、静かに（ビデオを参照）頭蓋骨に対して針をねじることによってこの時点で頭蓋骨に穴を作成します。頭蓋骨に対して下向きの針を強制的に避けてください。
• この時点で、マウスを定位フレームに配置され、吸入麻酔薬を（ビデオを参照）の受信を開始する必要があります。低レベル（1％）で麻酔剤を投与する、と慎重にそれに応じて麻酔薬を調整し、呼吸数の変化をマウスを監視する。
• 頭蓋骨の穴を介してカニューレを配置し、下の3ミリメートル頭蓋骨の表面の下に。以下のレートと継続時間を使用して、点滴を開始します。

  5分間で0.1μL/分
  5分間0.2μL/分
  5分間0.5μL/分
  7.5分に対して0.8μL/分
  OFF 1分間

• 点滴の終わりに、ゆっくりカニューレを取り外し、綿棒3％の過酸化水素と頭蓋骨。穴に無菌骨のワックスを適用します（ビデオ参照）。鉗子を使用して、閉じて頭蓋骨と主食を介して一緒に肌を描く。ブプレノルフィンは術後鎮痛のために投与すべきである。
• それは意識と機動性を取り戻すまで、術後マウスを監視します。手続きの長さのために、それは完全な活性を回復するためにマウスのための時間を要することがあります。この時間の間に低体温を避けるために、加熱パッド上でマウスのケージを置き、他のアクティブなマウスと回復のマウスを収容していない。
• 皮膚のステープルは、手術から1週間後に削除する必要があります。

in vivoイメージング C.

蛍光標識注入物は、CED投与後の撮像することができ、信号強度の変化だけでなく、信号の位置を監視することができます。通常は、マウスは注入から回復できるようにするように、イメージへの注入後2〜3時間を待つことが最善の方法です。

• 撮影時の麻酔の場合は、吸入麻酔薬の低レベルを使用してください。イメージングステーション（例えば、IVISルミナ、キャリパーライフサイエンス、アラメダ、カリフォルニア州）の位置までマウス、背側、。撮像されているフッ素の適切なフィルタ設定を使用して、画像を取得する。 CEDの場合は、成功した注入は注入部位（ 図3）に近い、脳内物質のほとんどを表示する必要があります。

3。代表的な結果

治療の投与の副作用の欠如は、成功した注射の重要な指標である。例えば、尾静脈注射後のテールの外観には変化（例えば、サイズ、色）があってはならない。尾静脈注射後のバブルやブリスターは皮下ではなく、治療の静脈内、配信を示すことになる。腹腔内注射の場合は、腹部の皮膚変色でバンプは、皮下注射や内部構造への損傷を示している場合があります。強制経口投与では、呼吸や咳をその流体を示している可能性がこじつけとマウスはむしろ胃に比べて、肺に注入した。

CEDの場合は、神経学的機能は、治療の成功した管理を評価する上で重要です。発作や片麻痺を展示しているマウスは、不適切な輸液を受けている場合があります。蛍光注入物が使用されている場合は、in vivoイメージングに成功した政権（ 図3）を評価するために適用することができます。注入物が注入部位に局在化されていない場合は、注入は成功しませんでした。

図1：CEDカニューレと外科セットアップ。対流強化された配信の基本的な要素は、外科的にはセットアップが示されている。 microinfusionポンプは、（）注入カニューレ（B、上部に拡大して示す）に接続されています。定位フレーム（C）は、プローブを配置するために使用されます。この画像は、手順の実行中にも使用加熱し、麻酔機器は含まれません。

図2：マウスの頭蓋骨の縫合線。 CED注入部位（赤い星）矢と冠状縫合（ブレグマ）の交点を識別し、ブレグマの2ミリメートル横方向は1mm後方を測定することによって見つけることができます。

図3：正常なCEDから代表的な結果。李遠赤色蛍光色素で標識posomesはCEDによって、マウスの脳に注入し、 インビボおよびex vivoの両方で画像化した。成功注入は 、in vivo（A） 及び ex vivo（B） の両方の注入の部位に局在する蛍光シグナルを示しています。信号が対側半球へ漏洩することなく注入半球にローカライズする必要があります。

図4：ラット脳幹に成功したCEDの代表画像。蛍光標識リポソームをラットの脳幹に注入した。ラットでは、できるだけ多く20​​μLとしては、注入することができます。注入の増加、ラットの頭蓋骨の厚さと深さは 、in vivoイメージングでは除外しますが、正しいの注入位置は、解剖脳のex vivoでのイメージングによって検証することができます。

ディスカッション

どんな治療薬の効果の前臨床評価は考慮に入れ、エージェントと関心の標的組織の薬理学的特性を取る必要があります。投与の全身の方法が一般的に、より容易な、より良い患者で忍容性であるが、血液脳関門の選択性は、多くの場合、中枢神経系疾患を治療するための治療のローカル配信が必要となる。 CED：ここでは、脳への直接配信の一つの方法を示している。脳へのローカル配信の他の形態では、脳脊髄液への直接投与、腫瘍内ボーラス注射、および心室の注入が含まれています。これらのメソッドの場合は、治療の拡散は、注射部位から数ミリメートル（ジャイナ教1989年、ボボ1994）へのカバレッジの領域を制限する貧しい人々拡散して、非常に重要です。それでも特定の神経解剖学的構造に標的治療可能にしながら、対照的に、CEDは、薬剤の分布の面積（ボボ1994）高めるために正圧を使用しています。当研究室では、我々は正常に実行脳幹にだけでなく、げっ歯類の尾状核被殻（ 図4）にCEDている。

齧歯類モデルでCED遂行する能力は、中枢神経系疾患の様々な種類の治療時に治療効果を最大化することへの関心の高まりに伴ってますます重要になっている。 CEDは、精製タンパク質、小分子薬、およびウイルス（ギル2003デジャン2003 Szerlip 2007）を含む種々の薬剤を、提供するために使用することができます。 CEDで治療できる疾患の範囲は、CNSの癌（山下2007）だけでなく、パーキンソン病（ギル2003）などの神経変性疾患が含まれています。 CEDの研究は、CED投与療法のin vivoイメージングのための必要性を拡大し続けて同様に増加している。蛍光イメージングは​​、おそらく人間の頭蓋骨を介して見えなくなってしまうここで紹介しながら、MRI造影剤の共同注入（ディッキンソン2008）を採用する他の方法は、中枢神経系疾患患者でinfusatesを監視するための適用性を評価するための関心を集めている。

資料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Chlorhexidine		Fisher	NC9756995	AKA “Nolvasan”
20g Needle		Becton Dickinson	305175
28g Needle (with syringe)		Fisher	22-004-270	AKA Insulin Syringe
3% Hydrogen Peroxide		Fisher	H312P-4	Store away from light
Cotton Swabs		Fisher	23-400-100	Autoclave before use
Cyanoacrylate-based Adhesive		Fisher	NC9592632	AKA “Krazy Glue”
Disposable Scalpels		Feather	2975	No. 21
Gauze		Fisher	22028563	Autoclave before use
Heating Pad		Dunlap	HP950
I.V. Catheter		Fisher	14-841-20
Infusion Pump		BASi	MD-1000, MD-1001
Living Image Software		Caliper Life Sciences	Contact for Quote
Ophthalmic Ointment		Cardinal Health	1272830	AKA “Akwa Tears”
Plastic Syringe Adaptors		Upchurch Scientific	P-604, P-200NX, P-215X, P-630	Fits on Luer Lock Syringes
Silica Tubing		Polymicro Technologies	2000020
Skin Stapler, Staples, Remover		Stoelting	59020
Stereotaxic Frame		Stoelting	51725
Teflon Tubing		Upchurch Scientific	1520
Xenogen Lumina		Caliper Life Sciences	Contact for Quote