Kemirgen Modeller Merkezi Sinir Sistemi Hastalıkları Tedavisinde Sistemik ve Yerel İlaç Taşıyıcı

Özet

Kapsamlı preklinik test merkezi sinir sistemine etkili ilaçların genellikle belirli uygulama yolları ile bağlantılı olarak değerlendirilmesi ve ilaç biodistribution karşılaştıran içerir. Burada, yaygın olarak kullanılan üç sistemik teslimat yöntemleri (intravenöz, intraperitoneal ve sözlü) yanı sıra yerel teslimatı için bir yöntem (konveksiyon gelişmiş teslimat) farelerde gösterilmiştir.

Özet

Merkezi sinir sistemi (MSS) Kapsamlı preklinik test terapötik tedavi etkinliğinin değerlendirilmesinde dikkate yönetim ve ajan biodistribution yolları içerir. Yönetiminin iki önemli sınıflandırmalar arasında, yerel ya da sistemik, sistemik teslim yaklaşımlar genellikle uygulama kolaylığı nedeniyle tercih edilmektedir. Ancak, sistemik teslimat MSS elde suboptimal ilaç konsantrasyonu ve ajan etkinliği ile ilgili hatalı sonuçlara neden olabilir. Yerel ilaç dağıtım yöntemleri daha invaziv, ancak tedavi merkezi sinir sistemi ilaç düzeyleri elde etmek için gerekli olabilir. Intravenöz enjeksiyon, intraperitoneal enjeksiyon ve ağızdan sonda: Burada, sistemik ilaç dağıtım üç güzergah için uygun tekniği göstermektedir. Konveksiyon geliştirilmiş teslimat (CED): Buna ek olarak, beyin yerel teslimat için bir yöntem gösteriyor. Uygun ilaç yönetiminin in vivo görüntüleme ve doğrulama için floresan etiketli bileşiklerin kullanımı dahildir. Yöntemleri fare modelleri kullanılarak sunulmaktadır, ancak sıçanlarda kullanmak için kolayca adapte edilebilir.

Protokol

1. Sistemik Teslim Yöntemleri

Sistemik ilaç teslim MSS yüksek ilaç konsantrasyonları elde etmek için en etkili yaklaşım olmasına rağmen, sistemik teslimatlar uygun ve hastalar tarafından iyi kabul edilir. Intravenöz enjeksiyon, intraperitoneal ve ağızdan sonda: Burada, biz rutin olarak kullanılan üç sistemik yönetim yaklaşımları için uygun prosedürleri gösterecektir.

A. İntravenöz Enjeksiyon (Kuyruk Ven Enjeksiyon)

1. Yordama başlamadan önce, vücut ağırlığının her bir fare kayıt altına alınmalıdır. Tüm preklinik çalışmalarda olduğu gibi, vücut ağırlığı, potansiyeli ilaç zehirlenmesi değerlendirmek için (haftada iki kez veya daha fazla) düzenli olarak izlenir olmalıdır. Tek bir anda farenin hacmi vücut ağırlığının% 1 den fazla enjekte edilmelidir. Örneğin, daha fazla sıvı 0.2mL daha 20g bir fare enjekte edilmelidir. Damar içine enjekte tüm sıvılar uygun bir yöntem ile sterilize edilmelidir.
2. Fare, bir ısıtma yastığı veya kuyruk ven genişletmek için bir ısı lambası kullanarak 5-10 dakika ısınmış olmalıdır. Eğer bir ısı lambası kullanarak, hipertermi önlemek için her zaman fare monitör.
3. Fare fare kuyruğu ven (video) erişime izin verirken engeller bir holding cihazı, transfer edilir. Fare kuyruğu dört görünür damarları vardır: dorsal ve lateral tarafta damarları damarlar ve ventral tarafta damar bir arter. Farenin kuyruk kuyruk ven erişmek için, en distal noktada düzenlenen ve damar yukarı baktığından emin 90 dereceye kadar döndürülebilir. Enjeksiyon yerinde bir alkollü bez ile temizlenir ve 28g bir insülin enjektörü (video) damar içine, eğimli yan eklenir. Iğne ven düzgün bir şekilde yerleştirilir ise, özgürce ve baskı olmaksızın hareket etmelidir. 5-10 saniye içinde bile basıncı yavaşça ilaç enjekte edilir. Blister kuyruk belirirse bu iğne ven artık olduğunu belirttiği gibi, enjekte durdurmak.
4. Kanama durana kadar, enjeksiyondan sonra enjeksiyon yerinde hafif bir basınç uygulanır. Bu normalde 30-60 saniye sürer. Enjeksiyondan sonra 5-10 dakika daha fazla kanama olduğunu sigortalamak için fare izleyin.

B. İntraperitoneal Enjeksiyon

1. Enjeksiyon başlamadan önce, ilaç 28g iğne takılı bir şırınga içine yüklenmiş olması gerekir. Alanı (örneğin, 200μL enjekte eğer şırınga kapasitesi 300μL veya daha büyük olduğundan emin olun) enjeksiyondan önce pistonu geri çekme şırınga içinde olduğunu emin olun.
2. Fare kavrama bir şey vardır ki, kendi kuyruğunu fare kafesinden çıkarın ve dokulu bir yüzey üzerine yerleştirin. Bir kafes kapağı genellikle yeterlidir. İzin fare gövdesi esneme ve daha sonra non-dominant el kullanarak, hafifçe başparmak ve işaret ve orta parmakları (video) arasında mümkün olduğunca cilt bakımı çimdik, fare geri cilt kavramak. Fare, fare karın yukarı bakacak olduğunu üzerinde açın. Fare başını serbestçe hareket edebilir, enjeksiyon sırasında ısırılan önlemek amacıyla, kavrama serbest bırakın ve yeniden deneyin.
3. Baskın el ile, şırınga alıp farenin sol alt kadran (Video) 30 derecelik bir açıyla iğneyi. Holding biraz ters fare enjeksiyon yerinde uzak organlara hareket etmesine yardımcı olacaktır. Iğne intraperitoneal alan olduğundan emin olmak için, şırınga pistonu geri çekin. Herhangi bir sıvı veya kan şırınga görünüyorsa, daha sonra iğne intraperitoneal boşlukta değildir ve çıkarılmalıdır. Şırınganın içine herhangi bir sıvı aspire edilir, sonra 1-5 saniye içinde bir hatta basınç ile şırınga içeriğini enjekte ve fareyi bırakın.
4. Fare, fare, normal bir aktivite düzeyleri döner olmasını sağlamak için enjeksiyondan sonra 5-10 dakika süreyle izleyin.

C. ağızdan sonda

1. Enjeksiyon başlamadan önce, farenin ağırlığını kaydedin. Ağızdan sonda ile teslim edilebilir maksimum hacmi vücut ağırlığının kilogramı başına 10 ml. Örneğin, 20g bir fare için maksimum ses 200μL olacaktır. Daha büyük hacimlerde enjekte çalışılıyor reflü neden olabilir, eksik ilaç dağıtım neden olacaktır. Yukarıda belirtilenden daha büyük birimleri yönetmek için gerekli ise, en çok üç doz 24 saat boyunca uygulanmalıdır.
2. Yemek borusu delinmesiyle önlemek için, her bir fare için sonda iğne uzunluğunu ölçmek için önemlidir. Farenin son kaburga gavaj iğne kavisli bir 18g topu ucu tutun ve daha sonra kalıcı bir kalem kullanarak (video) farenin başının ucunda uzunluğu işareti. Sonda sırasında, bu işareti farenin ağzına iğneyi bir durak noktası olacaktır.
3. Intraperitoneal enjeksiyon için aynı el kavrama kullanarak fare kısıtlamaktadır. Dil üzerinde, ağız gavaj iğne takın ve Advayutak yoluyla iğne nce. Durma işareti geçmiş iğne sokmayın. Iğne (video) herhangi bir baskı olmadan rahatça devam etmelidir. Basınç ile karşılaşırsanız, durun ve akciğerler içine sıvı enjekte önlemek için iğneyi çıkartın.
4. Bir yerde bir iğne ile, 1-5 saniye içinde piston deprese ve sonra takılı olduğunu aynı açıyla iğne kaldırmak. Bu sıvının akciğerlere girmiştir gösterebilir yorucu nefes herhangi bir işaret ile yakından ilgilenerek, 5-10 dakika fare izleyin.

2. Yerel teslimat

Akut Konveksiyon-Geliştirilmiş Teslimat

A. Probe İnşaat

Kemirgenler için reflü dayanıklı CED kanül henüz ticari olarak mevcut değildir. Burada ilk unizm ve ark (unizm 2005) tarafından tanımlanan bir yöntem adapte kanül yapımı için bir yöntem göstereceğiz.

• 100uM çapı silika tüp infusate akar, yapısal destek için sert bir metal iğne ve infusate yüklemek için esnek teflon tüp üzerinden kanül, üç parça (Şekil 1 )
• Sert metal iğne elde etmek için açık bir alev, bir Surflo IV Kateter (24g stile) plastiği eritebilir ve cımbız metal iğne kaldırmak kullanarak kullanın. Kateter geri kalanı atılmalıdır. Tek bir kenarı jilet kullanarak metal iğne biraz daha uzun bir silika boru uzunluğu (OD 0.163mm), kesin. Hortumun ucunda herhangi bir tutkal almak için özen siyanoakrilat tabanlı hızlı hareket eden yapışkan (örneğin Krazy Glue) küçük bir damla rol silika tüp,. Silika tüp metal iğne yerleştirin ve 5 dakika kurumasını bekleyin.
• Kuruduktan sonra, silika tüp sıkıca iğne yapıştırılmış olmalıdır. Silika uçları kesilmiş olmalı, böylece iğne ve düz ucunu (video) silika tüp çıkıntı 3mm sivri ucundan silika tüp çıkıntı 2mm.
• Teflon hortum 20 cm uzunluğunda bir bölümü kesin. Bu kanül yapışmasına neden olarak silika tüp ucunda yapıştırıcı almak için tekrar bakımı, küçük bir damla yapıştırıcı metal iğne döndürün. 1 cm derinliğe kadar teflon tüp içine iğne takın. 1 dakika kurumasını bekleyin. Bir tutkal tabancası kullanarak, sıcak tutkal metal iğne ve teflon tüp (video) arasındaki ortak bir damla uygulanır. Tüm eklem her tarafta kapalı olduğundan emin olun ve en az 1 saat süreyle kurumaya bırakın. Kanüller bir hafta önceden yapılmış ve oda sıcaklığında saklanan olabilir.

B. İnfüzyon Prosedürü

• Cerrahi alanı hazırlamak için, tüm yüzeyler% 2 klorheksidin böyle bir çözüm olarak bir dezenfektan ile püskürtülür olmalıdır. Işlem sırasında steril cerrahi eldiven giyilmelidir. Yüzeyler sonra emici perdeler ile kaplıdır. Aşağıdaki malzemeleri, cerrahi alanda yer almalıdır:
  • Fare vücut ısısını korumak için ısıtma yastığı
  • % 2 klorheksidin içeren% 3 hidrojen peroksit içeren tek ve bir, iki küçük Petri kutularına
  • Steril gazlı bez ve pamuklu
  • Steril tek neşter (Sayı 21)
  • Steril 22g iğneler
  • Fare stereotaksik çerçevesi
  • Kontrollü oranı şırınga pompası
  • Otoklavlı fare cilt zımba, zımba, zımba teli sökücü
• CED kanül set-up için bir 1ml şırınga, bir dizi plastik şırınga adaptörleri kullanarak Teflon boru takın. (Video) cerrahi yüzeyine dik olacak şekilde kanül stereotaksik çerçeve yapıştırılmış olmalıdır. Kanül dezenfekte etmek için, 1 ml şırınga% 70 etanol ile doldurmak ve etanol kanül aracılığı ile çalıştırmak için piston bastırın. Steril serum fizyolojik ile bu işlemi tekrarlayın ve kanül eklem çevresindeki herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Kanül dış dezenfekte etmek için,% 70 etanol silin hafifçe silin.
• Kanül steril tuzlu su ile doldurun ve daha sonra küçük bir hava kabarcığı kanül içine çekilir böylece şırınga geri çekin. Bu hava kabarcığı kanül salin infusate ayrı olacaktır. Sonra, backload infusate (video). Kanül kısaca çalıştırarak şırınga pompa ve pompa asal şırınga bağlayın.
• % 2 klorheksidin solüsyonu enjekte anestezi ve steril bir gazlı bez parçası ile birkaç kez (5-10 saniye için) sürüntü cildi hazırlamak kullanarak fare sakinleştirmek batırılmış. Oftalmik merhem işlem sırasında yeterli nemi korumak için fare uygulanmalıdır. Steril bir bistüri kullanarak, uzun yaklaşık 1.5cm (video), kafatasının merkezinde sagital boyunca bir kesi oluşturun. Kafatası yüzeyi daha sonra% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ile ıslatılmış pamuklu bir bez kullanılarak temizlenebilir. Fare gözünde hidrojen peroksit kurtulmak için özen gösterin. Kafatasının sütür hatları bu noktada az görünür olmalı: görünür değilse, yavaşça bir fr kafatası çubuklaESH pamuklu% 3 hidrojen peroksit çözeltisi batırılmış.
• Infüzyon site bulmak için bregma (Şekil 2) ve ardından sağ 2mm ölçmek ve bu yapının 1mm posterior belirleyin. 22g steril iğne kullanarak, kafatası (video) karşı iğne bükerek yavaşça bu noktada kafatasında bir delik oluşturmak. Kafatası karşı aşağı iğne zorlamadan kaçının.
• Bu noktada, fare stereotaksik çerçeveye yerleştirilir ve inhalasyon anestezi (video) almaya başlamak olmalıdır. Düşük bir seviyede (% 1) Yönetici, anestezi ve anestezi buna göre ayarlayarak, solunum hızı değişiklikleri için fare dikkatle izlemek.
• Kafatasına delik üzerinde kanül ve daha sonra alt kafatası yüzeyinin altında 3mm yerleştirin. Aşağıdaki oranları ve süreleri kullanarak, infüzyon başlayın:

  0.1 mcL / dk 5 dakika
  0.2 mcL / dk 5 dakika
  0.5 mcL / dakika 5 dakika
  0,8 mcL / dk 7.5 dakika
  OFF 1 dakika

• Infüzyon sonunda kanül ve çubukla% 3 hidrojen peroksit ile kafatası, yavaş yavaş çıkarın. (Video) delik steril kemik mum uygulayın. Forseps kullanarak, yakın kafatası ve elyaf üzerinde birlikte cilt çizin. Buprenorfin post-operatif ağrı kesici verilmelidir.
• Bu bilinç ve hareketlilik yeniden kazanıncaya kadar ameliyat sonrası fare izleyin. Prosedürün uzunluğu nedeniyle, tam aktivite kazanmak için fare için bir saat kadar sürebilir. Bir ısıtma yastığı üzerinde fare kafes bu kez yer sırasında hipotermi önlemek için, ev ve diğer aktif fare ile kurtarma fare yok.
• Cilt zımba, ameliyattan bir hafta sonra çıkarılmalıdır.

C. Vivo Görüntüleme

Floresan etiketli infusate CED yönetim yansıması ve sinyal yoğunluğundaki değişikliklerin yanı sıra sinyal konumu için izlenebilir. Tipik olarak, fare infüzyon kurtarmak için izin vermek, böylece görüntünün infüzyondan sonra 2-3 saat beklemek en iyisidir.

• Görüntüleme sırasında anestezi için, inhale anestezik düşük bir seviyede kullanın. Pozisyon fare, bir görüntüleme istasyonuna kadar dorsal tarafına, (örneğin, IVIS Lumina, kaliper Yaşam Bilimleri, Alameda, CA). Görüntülü olan flor için uygun bir filtre ayarı kullanarak, bir görüntü kazanır. CED için, başarılı bir infüzyon infüzyon sitesi yakınındaki beyin (Şekil 3) malzemenin en göstermelidir.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Tedavi verilmesi için olumsuz tepki eksikliği, başarılı bir enjeksiyon önemli bir göstergesi. Örneğin, kuyruk kuyruk damar enjeksiyonu takiben görünüş olarak herhangi bir değişiklik (örneğin, boyut, renk) olmalıdır. Kuyruk damar enjeksiyonu takiben bir kabarcık veya kabarcık subkutan, intravenöz tedavi, teslimat yerine işaret eder. Intraperitoneal, karın cilt veya renk değişikliği üzerinde bir şişlik subkutan enjeksiyon ya da iç yapılarına zarar gösterebilir. Ağızdan sonda ile bir fare, solunum veya öksürük bu sıvı mideye değil, akciğerlere enjekte edildi gösterebilir yorucu.

CED için, nörolojik fonksiyon başarılı bir şekilde tedavi uygulanması değerlendirilmesi için önemlidir. Nöbet veya hemiparezi sergileyen bir fare uygunsuz bir infüzyon almış olabilirsiniz. Floresan infusate kullanılması durumunda, in vivo görüntüleme başarılı yönetimi (Şekil 3) değerlendirmek için uygulanabilir. Infusate enjeksiyon yerinde lokalize değilse, infüzyon başarılı değildi.

Şekil 1: CED Kanül ve Cerrahi Set-up. Konveksiyon geliştirilmiş teslim temel unsurları cerrahi set-up gösterilmiştir. Mikroinfüzyon pompası (A) (B, üst kısmında genişlemiş gösterilen), infüzyon kanülü takılır. Prob konumuna stereotaksik bir çerçeve (C) kullanılır. Bu görüntü ısıtma içermez ve aynı zamanda işlem sırasında kullanılan anestezi ekipmanları.

Şekil 2: Fare Kafatası Dikiş Hatları. CED infüzyon sitesi (kırmızı yıldız), sagital ve koronal sütür (bregma) kesiştiği belirlenmesi ve sonra bregma 2mm yanal ve 1mm arka ölçüm bulunabilir.

Şekil 3: Başarılı CED Temsilcisi Sonuçlar. Liçok kırmızı floresan boya ile işaretlenmiş posomes CED fare beyninin içine infüze ve in vivo ve ex vivo hem de görüntülü. Başarılı bir infüzyon in vivo (A) ve ex vivo (B), hem de infüzyon yerinde lokalize bir floresan sinyal gösterir. Sinyal kontralateral yarımkürenin içine kaçak olmadan infüze yarımkürede lokalize edilmelidir.

Şekil 4: Rat Beyinsapı Başarılı CED Temsilcisi Resim. Floresan etiketli lipozomlar sıçan beyin sapı içine infüze edildi. Sıçanlarda kadar 20μL infüze edilmelidir. Sıçan kafatası ve in vivo görüntüleme engellemediği enjeksiyon derinliği, ancak doğru infüzyon konumu artan kalınlığı disseke beyin ex vivo görüntüleme tarafından doğrulanmadı olabilir.

Tartışmalar

, Herhangi bir terapötik ajan etkinliği preklinik değerlendirilmesi ajan farmakolojik özellikleri ve ilgi hedef doku içine almalıdır. Sistemik uygulama yöntemleri, genel olarak daha bayağı ve hastalar tarafından iyi tolere edilirken, kan-beyin bariyerinin seçicilik, merkezi sinir sistemi hastalığı tedavi etmek için sık sık yerel tedavi teslim gerektirir. CED: Burada, beyne doğrudan teslim bir yöntem ortaya koymuştur. Beyin yerel teslimat diğer formları, beyin omurilik sıvısı, intratümöral bolus enjeksiyon, ve ventriküler enjeksiyonu doğrudan yönetim içerir. Bu yöntemler için, terapötik dağılma kötü difüzyon (Jain 1989, Bobo 1994) enjeksiyon yerinde birkaç milimetre kapsama bölge sınırlandırılması önem taşımaktadır. Buna karşılık, CED hala tedavi belirli nöroanatomik yapılar hedefleyen sağlarken, ilaç dağıtım (Bobo 1994) alanını artırmak için pozitif basınç kullanır. Laboratuvarımızda, başarıyla gerçekleştirilen beyin içine gibi kemirgenler kaudat putamen (Şekil 4) CED var.

Kemirgen modelleri CED yürütebilme, merkezi sinir sistemi hastalığı çeşitli türleri tedavi ederken tedavi etkinliğini maksimize artan bir ilgi ile birlikte giderek daha önemli hale gelmiştir. CED saflaştırılmış protein, küçük moleküllü ilaçlar, ve virüsler (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007) de dahil olmak üzere, çeşitli ajanlar sunmak için kullanılabilir. Dizi CED ile tedavi edilebilir hastalıklar, merkezi sinir sistemi kanserleri (Yamashita, 2007) gibi, Parkinson hastalığı (Gill 2003) gibi nörodejeneratif hastalıkların yanı sıra içerir. CED araştırma, CED uygulanan tedavinin in vivo görüntüleme için ihtiyaç genişletmeye devam ediyor gibi benzer şekilde artmaktadır. Floresan görüntüleme olasılıkla insan kafatası ile görünür olmayacaktır burada gösterirken, diğer yöntemlerle istihdam MR kontrast ajanlar co-infüzyon (Dickinson, 2008), merkezi sinir sistemi hastalığı olan hastalarda infusates izlenmesi için uygulanabilirliği değerlendirmek için ilgi çekicidir.

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Chlorhexidine		Fisher	NC9756995	AKA “Nolvasan”
20g Needle		Becton Dickinson	305175
28g Needle (with syringe)		Fisher	22-004-270	AKA Insulin Syringe
3% Hydrogen Peroxide		Fisher	H312P-4	Store away from light
Cotton Swabs		Fisher	23-400-100	Autoclave before use
Cyanoacrylate-based Adhesive		Fisher	NC9592632	AKA “Krazy Glue”
Disposable Scalpels		Feather	2975	No. 21
Gauze		Fisher	22028563	Autoclave before use
Heating Pad		Dunlap	HP950
I.V. Catheter		Fisher	14-841-20
Infusion Pump		BASi	MD-1000, MD-1001
Living Image Software		Caliper Life Sciences	Contact for Quote
Ophthalmic Ointment		Cardinal Health	1272830	AKA “Akwa Tears”
Plastic Syringe Adaptors		Upchurch Scientific	P-604, P-200NX, P-215X, P-630	Fits on Luer Lock Syringes
Silica Tubing		Polymicro Technologies	2000020
Skin Stapler, Staples, Remover		Stoelting	59020
Stereotaxic Frame		Stoelting	51725
Teflon Tubing		Upchurch Scientific	1520
Xenogen Lumina		Caliper Life Sciences	Contact for Quote