הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה מוכתם תסיסנית עוברים בתנוחה זקופה המאפשרת הדמיה של חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal.

Abstract

מספר ידוע הדרגתיים המוךפו"גנטי שהולך ותנועות הסלולר להתרחש לאורך הציר הגבי / הגחון של

Protocol

1. הדמיה מתודולוגיה

1. ממיסים גליצרין ג'לי בתוך אמבט 55 ° C מעלות מים 20-30 דקות עד שהוא הופך לנוזל הומוגני. מערבולת, אבל לא לנער את הבקבוק, כדי למנוע היווצרות של בועות.
2. בעוד ג'לי נמס, למרוח שכבה דקה של גליצרול באמצעות Kimwipe בשקופית זכוכית נקי (אופציונלי).
3. פיפטה 1-1.5 מ"ל של גליצרין מומסת ריבה באמצעות P1000 לחתוך קצה הפיפטה על פני השטח של השקופית כדי ליצור שכבה ראשונה דקה. פיפטה בזהירות כדי למנוע בועות.
4. בואו ג'לי לחזק 5 דקות על משטח אופקי, ואז למקם את השקופית ב -20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהמשיך יישור העובר. לחלופין, לכסות את השקופית עם בניילון נצמד ומניחים אותו על 4 ° C עד 5 ימים.
5. פיפטה טיפה קטנה של עוברי הצבעונית גליצרול 70% / PBS או אחרים מבוססי גליצרול antifade התקשורת הרכבה (למשל Slowfade או Vectashield) בצד של תשתית ג'לי.
6. בגין טרום יישור העוברים בנפרד על ידי העברת אותם מירידה לפני השטח ג'לי. העברת אותם באמצעות מחט המזרק מלוכסנות, באמצעות צד מלוכסנות כמו כפית.
7. בערך המקום עוברים לאורך 2-3 עמודים. אם העובר נתקע המחט, מערבבים אותו טיפה המכילה את העוברים אחרים כדי לשחרר אותו. אל תבזבזו זמן בזהירות יישור אותם בשלב זה. תשאיר קצת מקום בין עמודות.
8. יישר את העוברים על ידי הזזה אותם במאוזן על המדיום ג'לי בעזרת המחט של המזרק. בעוד הזזה, לכוון את הראשים והזנבות באותו כיוון. לגרום להם מקבילות זו לזו לאורך הטור. הסרה של עודפי גליצרול PBS שמאל כמו שביל עם חתיכת Kimiwipe מעוות.
   
   הערה: גליצרול עודף יגרום עוברים להיות עטוף בצורה רופפת בתוך ג'ל, והתוצאה היא הפרדה של שתי שכבות ג'לי, ולכן קשה לגזור הר. לעומת זאת, הסרת גליצרול יותר מדי יהיה יבש לשטח עוברים.
9. השתמש קצה צהוב לחתוך להפיץ שכבה דקה של ריבה על עוברי (50-150 μL, תלוי כמה היו מיושרים).
10. מקום להחליק במקפיא -20 מעלות צלזיוס 10-20 דקות או לאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא ג'לי הוא קשיח לחלוטין לפני חיתוך. אחרת, בלוק של עוברים יהיה קשה מאוד הבלו. התוצאות הטובות ביותר עבור חיתוך מתקבלים ביום המחרת.
11. תחת בהיקף לנתח, להשתמש סכין גילוח לחתוך לחלוטין דרך ג'לי בשני הצדדים של העוברים בציר. החזק את הסכין בזווית של 90 מעלות כדי לבצע חתכים ישר. הקיצוצים צריכים להיעשות קרוב מאוד הקטבים הקדמי ואת האחורי של עוברים, כדי למנוע ג'לי עודף שעלול להכשיל הדמיה.
12. הוסף 100-200 μL של קר PBT (4 ° C, PBS 0.1% Tween 20) לצד הפחתות בזהירות מגרדים את ג'לי בין העוברים באמצעות מרית.
    
    הערה: חומר ניקוי ב PBT עוזר להסיר את ג'לי משקופית מבלי לפגוע בעוברים.
13. באמצעות מחט, להעביר את גוש ג'לי עם עוברי מוטבע לשקופית נקי לחיתוך נוסף. חותכים קוביות קטנות עם עוברי 5-7. השתמש PBT להעביר בקלות סביב הבלוק ג'לי. לחלופין, במקום לחסום על משטח זכוכית יבשה לתת לזה לצרף זכוכית, אשר יוצרת יציבות יותר דווקא זמירה ג'לי, במידת הצורך.
14. פליפ זקוף העוברים מוטבע ריבה בעזרת סכין גילוח ומחט. להדמיה תחת מיקרוסקופ, להמשיך עם אחד משני הצעדים הבאים, בהתאם לסוג של מיקרוסקופ לעמוד בשימוש.
15. מיקרוסקופ הפוך: במקום סיים בלוקים העובר על coverslip רב, עם עוברים בתנוחה זקופה. ודא שהצד של העובר עם סכום של לפחות ג'לי יהיה במגע קרוב עם יעד.
16. מיקרוסקופ זקופה: לעשות שתי ערימות עם ארבעה # 1 coverslips מודבק עם דבק מגע כדי לשמש "תומך" והמקום לחסום העובר בתוך גליצרול בין "תומך". גשר ערימות באמצעות coverslip ארוך.
17. לניתוח confocal, לבדוק את מרחק העבודה של מטרות לשמש כדי לברר אם אתה יכול תמונה לאורך כל הדרך העובר או באופן חלקי בלבד. לדוגמה, ד עוברים melanogaster יש ~ 0.55 מ"מ באורך ניתן הדמיה לחלוטין באמצעות תוכנית Zeiss 20x-Apo או 40X LD ניאו פלואוריד אובייקטיבי. האתר הבא יש מידע על יעדים Zeiss זמין נותן לך את האפשרות לחפש יעדים על פי מרחקי עבודה: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php

2. נציג תוצאות

מכיוון העוברים נותרים שלמים, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לקחת מידות מדויקות של גודל העובר ואת המרחקים בין דפוסי ביטוי גנים. באיור 1, אנו מראים שלב blastoderm עוברים מוכתמות DAPI כתם גרעיני (כחול), אנטי הגב חלבון (אדום), mRNA SOG (צהוב) ו-mRNA SNA (ירוק). מורפולוגי procesSES, כגון invagination של והמזודרם (איור 2 א ', ב') הגירה של תאים mesodermal (איור 3 ו 4) יכול גם להיות דמיינו באמצעות שיטה זו. Z-עמדות שונות לאורך ציר DV ניתן להשיג על ידי שינוי מישור המוקד, כפי שמוצג איורים 2-4.

באיור 1. זקופה פרוסה אופטי של העובר תקין בשלב blastoderm. מכתים כפולה עבור ה-mRNA וחלבון. MRNAs יעד של בדיקות באתרו (SOG ו SNA) וחלבון מוכתם על ידי נוגדן ראשוני (אנטי הגבי) מסומנים בתרשים. DAPI שימש התווית גרעינים. ראוי לציין, כי הביטוי של SOG ו SNA ממוקמים apically בציטופלסמה, תוך הבעת הגבי הוא גרעיני. אותות חזקים מהתעתיק SOG המתהווה הממוקמים גרעינים ניתן לראות בהגדלה זו.

איור 2. הדמיה של העובר זקופה gastrulating ללא פגע. בדיקות ה-mRNA השתמשו בצבעים שלהם מצוינים באיור. א) שים לב כי בשלב זה, שלושה גנים מוכתם פלואוריד זהה (SNA, SOG ו DPP, בירוק), באים לידי ביטוי בתחומים מופרדים מרחבית. והמזודרם invaginating מבטא SNA, שכבת neuroblast מבטא ind ו האאקטודרם מבטא DPP, ואילו הביטוי SOG עדיין קיים באזורים הגחון של מערכת העצבים. ב) מטוס confocal עמוקה יותר של העובר אותו, נציין את בסיס והמזודרם invaginating בתוקף מבטא SNA, אבל האזור apical שלה מבטאת רמות נמוכות יותר.

איור 3. הדמיה של העובר זקופה שלם עם הלהקה המורחבת נבט SOG RNA (צהוב). חילזון, ind ו mRNAs DPP (ירוק), חלבון הגבי (אדום). גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). א) משטח הפוקוס ליד ראש העובר. ב) אחר המטוס מוקד באזור הגזע של העובר אותו. הערה גוש של תאים mesodermal לפני הגירה לרוחב (להשוות איור 4) שוכב קרוב לקו האמצע הגחון משני צידי העובר נבט-band המורחבת. Neuroblasts Delaminating מסומנים בירוק (ind ו SNA).

איור 4. הדמיה זקופה של העובר ללא פגע במהלך הארכה הלהקה נבט SOG RNA (צהוב). חילזון, ind ו mRNAs DPP (ירוק), חלבון הגבי (אדום). א) שים לב neuroblasts delaminating מן האפיתל (חץ), מוכתם הן ind ו SNA בשלב זה (ירוק). הערה גם את הביטוי מוגבל של SOG אל קו האמצע הגחון (צהוב). הביטוי של DPP בשלב זה ניתן לראות בצדדים רוחבי של העובר (כוכבית). ב) סעיף אופטי בעובר אותו מוצג לקראת סוף אורך העובר, המתאימה לאזור אמצע האחורי. התאים קו האמצע הגחון מוכתמות עבור SOG.

Discussion

לקיחת תמונות חתך של עוברים תסיסנית יכול להיות מאתגר, כיוון שהיא דורשת דיסקציה זהירה של יד ² פרוסות או שימוש בתקשורת מוטבע לעיבוד microtome, שהיא בדרך כלל מזיקה עבור stainings ניאון. לחלופין, Z-ערימות שנעשו מיקרוסקופ Confocal ניתן להשתמש כדי להפוך את שיקום 3D של חתך תמונות. עם זאת, זמן רב כדי להפוך כמה פרוסות דק Confocal לשיקום photobleaching 3D מדויק הופכת בעייתית. דאגה נוספת כאשר עוברים הדמיה כי הם רכובים longitudinally הוא פיזור אור המתרחשת כאשר מגיעים חלקים עמוקים יותר של העובר, אשר גם מסבך לקיחת מידות מדויקות של אותות ניאון לצורך כימות של רמות החלבון או ביטוי mRNA ^1. אפילו עם מיקרוסקופ שני הפוטונים confocal, פיזור אור עדיין דאגה בגלל האטימות של החומר חלמון באמצע של העובר, מה שהופך את הבחירה של התקשורת הרכבה לשקיפות אופטימלי של המדגם להיות מוגבל.

כדי לעקוף את הבעיות הללו, טכניקה חדשה בשם "סיום על" הדמיה של עוברים מיצוב אנכית פותחה לאחרונה על התמונה הן לחיות דגימות קבוע ^4. במאמר זה, פיתחנו פרוטוקול חדש עבור עוברי רכוב אנכית המאפשרת הכנה ויזואליזציה פשוטה של עוברי או רקמות קבוע בכל גודל וצורה, כי הם מוכתמים מספר בדיקות באתרו ^3. השיטה שלנו מורכבת של שימוש גובר בתקשורת עם עקביות ג'לטיני המשמש לשים בארגז עוברים מיושר בתוכו. בלוקים Cut זה כלי התקשורת הרכבה ובו עוברים מוטבע ניתן למקם זקוף לפני הדמיה בכל סוג של מיקרוסקופ Confocal.

על ידי הטבעה את העוברים לתוך ג'לי ומיקום אותם במאונך, אנו מסוגלים לקחת אופקי חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal, שבו תאים לאורך הציר הגבי-הגחון של העובר מוצגים בו זמנית. זהו שיפור משמעותי לצורך כימות מאז בעיות של פיזור אור photobleaching של צבעי ניאון המתרחשת שחזור Z-מחסנית קונבנציונאלי של עוברים רכוב longitudinally מסולקות עכשיו. לפיכך, כימות הביטוי או חלבון רמות הגן לאורך הציר הגבי-הגחון מדויק, שכן התאים הממוקם הגבי-הגחון עמדות מול הם צילמו באותו זמן ובאותו העמדה-Z אותו confocal. בנוסף, בשיטה המתוארת מאפשרת לנו לקבל תמונה מלאה 2-D על פני ציר הגבי-הגחון מעובר 3-D ללא שימוש מורכב שיטות חישוביות ופרש לדמיין תאים בנקודות שונות לאורך ציר DV ^6.

כמה שלבים קריטיים לכלול הסרת עודפי גליצרול לאחר יישור עוברים, כדי למנוע פיצול בין שתי שכבות של ג'לי. עם זאת, אם המדגם הוא מיובש מדי, התמונה המתקבלת יהיה מעוות יש מורפולוגיה שגויה. בנוסף, אם המדיום ג'לי סביב העובר נחתך בזווית ולא ישר, וכתוצאה מכך התמונה עשויה להופיע בסיבוב פחות ביצי יותר בכושר, בשל מיקום שגוי של עוברים בזווית שאינה 90 מעלות. לבסוף, אם ג'לי אינו הדוק מספיק כדי לחתוך העובר על קצות קדמית / אחורית, לא ניתן לקבל תמונה נכונה בגלל מרחק העבודה של מטרה ישמש בעיקר כדי להתמקד לתוך ג'לי ולא את העובר.

צעד חשוב נוסף אשר עשוי להיות נחוץ כאשר העובר מאוחר הדמיה gastrulating היא בזהירות למיין את שלבי עניין תחת היקף לפני ליישר אותם. בדרך כלל, עוברים הם מבוימים על פי מאפיינים מורפולוגיים, כי ניתן לזהות בקלות כאשר בעמדה האורך.

בין השינויים אלטרנטיבה שיכולה להתבצע בשיטה זו היא לכלול מגיב אנטי לדעוך (למשל p-Phenylenediamine או PPD) לתוך השכבה השנייה של ג'לי כדי לסייע בהגנה מפני photobleaching של צבעי ניאון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerin Jelly mounting media	Electron Microscopy Sciences	17998-10	Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.
Zeiss LSM 700 Confocal	Carl Zeiss, Inc.		The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)
Glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-7
Glass cover slips	Electron Microscopy Sciences	72204-02	Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work).
Glass cover slips (for making supports)	Fisher Scientific	12-544-10	Use four coverslips glued with superglue.
Dissection microscope	M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop	M420
Razor blade			Steel back single edge industrial blades
Spatula	Fisher Scientific	21-401-10
Hypodermic needles	Fisher Scientific	1482610	26 Gauge
Pipettes	Labnet International