מיקרוסקופיה confocal קרנית: שיטה חדשנית לא פולשני לכמת סיב פתולוגיה קטנים neuropathies היקפיים

Summary

מיקרוסקופיה Confocal קרנית היא טכניקה לא פולשנית קליניים אשר עשויים לשמש לכמת נזק C סיבים לאבחן לרבד חולים עם חומרת נוירופתי גוברת.

Abstract

כימות מדויק של נוירופתיה היקפית חשוב להגדיר בבית חולים בסיכון, צופים הרעה, ולהעריך טיפולים חדשים. בשיטות המקובלות להעריך גירעונות נוירולוגיות electrophysiology ובדיקה חושית כמותית מכמת שינויים פונקציונליים לזהות נוירופתיה. עם זאת, הנזק המוקדם נראה את סיבי קטן אך בדיקות אלה בעיקר להעריך את תפקוד סיבים גדולים יש יכולת מוגבלת להפגין התחדשות ותיקון. הטכניקות רק המאפשרים בדיקה ישירה של נזק סיבי עצב unmyelinated ותיקון הם עצב sural ביופסיה עם מיקרוסקופ אלקטרונים ועור-אגרוף ביופסיה. עם זאת, הן הליכים פולשניים ודורשים תהליכי מעבדה ממושכת מומחיות רבה. מיקרוסקופיה Confocal קרנית היא טכניקה לא פולשנית קליניים אשר מספק ב-vivo הדמיה של סיבי עצב הקרנית. אנחנו הוכיחו נזק עצבי מוקדם, אשר מקדים את אובדן של סיבי עצב intraepidermal ב ביופסיות עור יחד עם ריבוד חומרת נוירופתי והלבלב הבאים לתקן להשתלה בחולי סוכרת. אנחנו הוכיחו גם נזק עצבי ב נוירופתיה אידיופתית סיבים קטנים מחלת פברי.

Protocol

מבוא:

כימות מדויק של נוירופתיה היקפית חשוב להגדיר בבית חולים בסיכון, צופים הרעה, ולהעריך טיפולים חדשים. בשיטות המקובלות להעריך גירעונות נוירולוגיות electrophysiology ובדיקה חושית כמותית מכמת שינויים פונקציונליים לזהות נוירופתיה. עם זאת, הנזק המוקדם נראה את סיבי קטן אך בדיקות אלה בעיקר להעריך את תפקוד סיבים גדולים יש יכולת מוגבלת להפגין התחדשות ותיקון. הטכניקות רק המאפשרים בדיקה ישירה של נזק סיבי עצב unmyelinated ותיקון הם עצב sural ביופסיה עם מיקרוסקופ אלקטרונים ועור-אגרוף ביופסיה. עם זאת, הן הליכים פולשניים ודורשים תהליכי מעבדה ממושכת מומחיות רבה. מיקרוסקופיה Confocal קרנית היא טכניקה לא פולשנית קליניים אשר מספק ב-vivo הדמיה של סיבי עצב הקרנית.

HRT-III רוסטוק מודול קרנית (RCM)

ידני של מבצע

1. הכנת המצלמה

השלב הראשוני הוא בדיקה באמצעות HRT הכנת קצה העדשה אובייקטיבי.

1. ראשון צינור המטרה של המצלמה סריקת לייזר, להגדיר את השבירה עד 12 דיופטריות ולאחר מכן להתאים את המצלמה למצב הנמוך ביותר.
2. החל בועה גדולה הומוגנית, ללא תשלום, ירידה בגודל אפונה, של Viscotears על קצה העדשה.
3. הסרת TomoCap ממיכל סטרילי שלה לעלות אותו על קצה עדשה כזו הג'ל יוצר המניסקוס בין העדשה אובייקטיבי את הכובע. זה דחוף ככל האפשר על המחזיק. היזהר שלא לגעת במשטח הקדמי של TomoCap במהלך גובר.
   
   באיור 1. הכנת קצה העדשה אובייקטיבי (למעלה) החלת viscotear ג'ל (התחתון) יישום TomoCap.
4. העבר את המצלמה סריקת לייזר ככל לאחור ככל האפשר בהר המצלמה.
5. פני השטח הפנימיים והחיצוניים של TomoCap הן מופיעות כהשתקפות לייזר בהיר. הגלגל מוקד התאמת המטוס צריך להיות מותאם עד השתקפות בהיר הוא ציין, המציין את העדשה מתמקדת בתוך החלק הקדמי של המכסה. הערך עומק שמוצג להציג את העמדה להתמקד כעת אמור להיות בין 150 מיקרומטר ו -150 מיקרומטר.
6. איפוס את הגדרת עומק לאפס.
   
   איור 2. התאמת המטוס מוקד.

2. הכנת החולה

עיניו של נושא מורדמים באמצעות ירידה של hydrochloride benoxinate 0.4% ו Viscotears משמש על החלק הקדמי של העין עבור שימון.
הנושא הוא יושב בנוחות, עם הסנטר על שאר הסנטר וביקש ללחוץ על המצח שלהם בתקיפות נגד בר המצח.

איור 3. הכנת החולה

3. יישור מצלמה

זה עושה את הבדיקה קל יותר אם להורות המטופל כדי לתקן את האור קיבוע חיצוני בעין לא נבדקות. גודלו הקומפקטי של ראש מיקרוסקופ כלומר עין הנגדי של הנבדק אינו מוסתר, המאפשרים שימוש מטרות ממרחק.

איור 4. העדשה המטרה של המודול הקרנית.

1. מקם את המצלמה CCD כך ציר האופטי שלה פועל בניצב לציר האופטי של המצלמה סריקת לייזר. המצלמה צריכה להיות בצד ימין של המטופל כאשר הדמיה בעין ימין ולהיפך.
   במיקום זה, אתה צריך לראות את פני השטח הקדמי של TomoCap במרכז התמונה את המצלמה CCD לחיות.
2. העבר את המצלמה סריקת לייזר כלפי המטופל עד הקרנית של המטופל היא במרחק של מ"מ על 5-10 מתוך TomoCap, ואז להזיז את המצלמה סריקת לייזר למעלה / למטה שמאלה / ימינה באמצעות כפתורים שחורה בהר מצלמה עד TomoCap ממוקם במרכז הקרנית של המטופל. בשלב הזה אתה יכול לבדוק כי אור לייזר אדום במרכז הקרנית ועל התאמה בסדר, לראות את ההשתקפות של קרן לייזר של הקרנית, אשר מוצג בתמונה מצלמה CCD. השתקפות זו חייבת להתרחש בדיוק בקוטב הקדמי של הקרנית.
   
   איור 5. יישור של קרן לייזר על המוט הקדמי של הקרנית ללכוד תמונות הקרנית המרכזית.
3. שאל את המטופל כדי לפתוח עין שלו / שלה רחב ככל האפשר. העבר את המצלמה סריקת לייזר לאט קדימה כלפי המטופל עד המגעים TomoCap הקרנית של המטופל. אם נדרשכדי לתקן את המיקום של המצלמה סריקת לייזר, ולאחר מכן להעביר את המצלמה מן המטופל הראשון, לעשות את התיקון, ולאחר מכן להעביר אותו שוב קדימה כדי ליצור קשר עם קרנית.
   
   איור 6. הפגנה של הגשר ג'ל הדק שבין TomoCap לבין הקרנית.
4. מגע מינימלי בין המצלמה ואת הקרנית מספיק. ב התאמה אופטימלית, גשר ג'ל הדק שבין TomoCap לבין הקרנית גלוי על תמונת המצלמה CCD לחיות.

אם תלחץ על TomoCap או להעביר את הקרנית קרוב מדי למצלמה ואז תוכלו לראות את הלחץ על הקרנית עם מראה שטוח של הקרנית באמצעות תמונת המצלמה CCD לחיות. גם התמונות לקבל קו מראה הלחץ תופיע, ולכן אין להפעיל לחץ רב מדי על הקרנית. לאחר מגע כבר נקבעה, לא להזיז את המיקום של headrestto למנוע החלקת הקרנית על TomoCap.

איור 7 (משמאל) מראה של straie בשל הפעלת לחץ עודף על הקרנית על ידי TomoCap;. (מימין) עם תמונת מראה נורמלי בלי לחץ עודף.

4. בדיקת החולה

לאחר שדה הראיה נבחרה, המצלמה III HRT הלייזר מופעל החלון רכישת התמונה מופיעה על המסך. השתמש תמונה CCD לתפקיד TomoCap אור הלייזר על הקרנית של המטופל. בדיקה באמצעות מצב שנבחר עשוי להיות אז החלה.

איור 8. צופה מצב על צג במהלך הרכישה של תמונות.

מצב של רכישה

במצב קטע, תמונה אחת בודדת נרכש ומאוחסן בכל פעם שתלחץ על מתג רגל. אנו משתמשים במצב זה עבור לכידת תמונות משכבת ​​הקרנית כולה כולל שכבה של באומן במרכז הקרנית. ואז לאחר לכידת בכמות מספקת של תמונות, אפשר לנסות את המצבים אחרים, כולל רצף ונפח.

איור 9. Display עם הבחירה של מצבי תמונה שונים הרכישה.

עם לסרוק את רצף, ניתן לרכוש רצף של עד 100 תמונות עם שיעור מסגרת מתכווננת. ניתן לבחור בין מסגרת הדולר 30 מסגרות 1 מסגרת לשנייה (fps) ועל סמך מצב זה מאפשר לך לרכוש סרט עם משך זמן של 3 עד 100 שניות.

במצב סריקה נפח, המצלמה באופן אוטומטי רוכש סדרה של 40 תמונות על המטוסים מוקד רצופים. עומק סך של 85 מיקרומטר ניתן לסרוק עם "FOV 400 מיקרומטר" העדשה השדה ואת המרחק בין שני מוקדי תמונות רצופות יהיה כ -2.1 מיקרומטר.

לאחר סריקות כמה המטוס הפוקוס של העדשה ניתן לשנות על מנת למדוד את העומק של השכבה הקרנית תא היחסי על פני השטח של הקרנית על ידי הבאת את שכבת האפיתל התא אל המוקד ולאחר מכן לחיצה על לחצן איפוס כדי לקבוע את ערך עומק 0.

לצורך המחקר הנוכחי שלנו, אנו להשיג תמונות מן הקרנית המרכזית בעומקים שונים. לכן אנחנו לא להזיז את המצלמה סריקת לייזר סביב הקרנית אופקית או אנכית, אנחנו פשוט להעביר קדימה ואחורה ללכוד תמונות מכל מעמקי שכבה של באומן בנקודת הקרנית אותו. המרחק בין כל תמונה הוא כ 1 מיקרומטר, ולכן אם את עומק של באומן הוא 10 מיקרומטר, יהיו לנו 10 תמונות. עם זאת לניתוח הסופי, אנו בוחרים את התמונות עם מרחק של כ 2-3 מיקרומטר ביניהם.

לאחר הבדיקה תושלם תכבה את המצלמה על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה מצלמה בחלון הרכישה. הפוך את המטופל מודע לכך שהוא או היא לא צריך לשפשף את העיניים שלו או שלה עד הרדמה מקומית כבר לא משפיע. כאמצעי זהירות, מומלץ לבצע בדיקת מנורת סדק של הקרנית של המטופל לאחר הבדיקה.

הסר את TomoCap מהמצלמה ועושה אותו ולאחר מכן לנקות את עדשת מיקרוסקופ עם כותנה ספוגית טבולה במים מזוקקים.

5. ניתוח בחינת

א בחירת מסגרות

כדי לסקור ולנתח את הבדיקות הקיימות, להקליט את החולה מתאים (ים) יש לבחור בחלון מסד הנתונים. חלון הצפייה בתמונה מספק סקירה של בדיקות הקרנית הקיימים עבור המטופל שנבחר. בדיקות שבוצעו בימים שונים מאוחסנים כרטיסיות ביקור נפרד. שלושת סוגי סריקה שונים מיוצגים על ידי שלושה סמלים שונים על הכרטיסייה III HRT לבקר הקרנית של חלון הצפייה בתמונה של Heidelberg העין Explorer.

כדי לסקר את התמונה הקרנית, לחץ לחיצה כפולה על סמל התמונה מתאימה את הפונקציה "הצג" תפתח את החלון הבא:

איור 10. הצגת כל התמונות שנתפסו לאחר בדיקה.

איור 11. התצוגה של התמונה שנבחרה לפני הייצוא עם נוף מצלמת CCD של העין כדי להראות יישור נכון.

כדי לייצא את התמונות המתאימות לניתוח נוסף, לחץ על "ייצוא" בסרגל הכלים ולאחר מכן בחר את התיקיה שבה ברצונך לשמור את התמונות.

אנו להשיג ללכוד תמונות מכל שכבות הקרנית לכל מטופל, אלא כמוקד העיקרי של מחקר זה היא על שכבה של באומן העצבים הקרנית, רק תמונות מתוך שכבה זו ינותחו. אנו בוחרים 5-6 מסגרות מהשכבה של באומן לכל נושא בעומקים שונים של הקרנית.

איור 12. תצוגה של כל שכבות הקרנית מהנושא בריא.

בממוצע 5-6 מסגרות מהשכבה של באומן במרכז הקרנית בעומקים שונים שנבחרו באופן אקראי עבור מדידות כמותי וניתוח.

ב ניתוח תמונות

לניתוח תמונות שנתפסו מהשכבה של באומן של הקרנית המרכזית עם HRT III, אנו משתמשים בתוכנה מיוחדת אשר פותחה בתוך הקבוצה שלנו שנקרא "ניתוח CCM תמונה כלים v 0.6".

ארבעת הפרמטרים העיקריים לעצבים הקרנית נמדדים עם תוכנה זו:

• צפיפות סיבי עצב (NFD) אשר מוגדר כמספר העצבים המרכזית / מסגרת.
• ענף עצב צפיפות (NBD) מספר הענפים העיקריים / מסגרת.
• אורך סיב עצב (NFL), המהווה את האורך הכולל של כל העצבים / מסגרת.
• סיבי עצב tortuosity (NFT אזור) של העצבים המרכזית / מסגרת.

כדי לפתוח תמונה CCM, ללכת לקובץ> פתוח.

• ברגע שהתמונה עמוסה, גודלה וסוג מוצג בתיבה תמונה מידע בצד היד השמאלית העליונה של לוח הבקרה.
• סולם ברירת המחדל מוצג בשורה לערוך את המידע של התמונה. אם בקנה מידה שונה, לשנות את מספר בקו העריכה.
• כדי להתחיל לנתח את התמונה, בחר את פרמטר אתה רוצה למדוד מתיבת מטרי בצד הימני העליון של לוח הבקרה.
• באותה תיבת תוצאה בתחתית העמוד את מספר NFD, NBD מוצג המספר בפועל, ב-NFL מ"מ tortuosity כמו מקדם Tortuosity (TC).
• זאת לאחר לייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני של Excel, התוצאות יוצגו מ"מ / לא ² עבור NFD ו NBD ו מ"מ / מ"מ ² עבור ה-NFL.
• לצורך זה לאחר סיום המדידות לחץ על מדידות הוסף, ואז ללכת ל-File> Save as ולאחר מכן לפתוח את התוצאות נשמרות עם Excel.

איור 13. התצוגה של התמונה עצב הקרנית עם התחקות בכלי ניתוח באמצעות "ניתוח כלי CCM תמונה".

6. נציג תוצאות:

אנחנו הוכיחו פרוגרסיבי הגדלת ניוון עצבי הקרנית עם החומרה הגוברת של נוירופתיה סוכרתית ¹ ו - נזק עצבי מוקדם סוכרת אשר מקדים אובדן של סיבי עצב intraepidermal ב ביופסיות עור ² יחד עם ריבוד חומרת לתקן נוירופתי ובעקבות השתלת לבלב ³ אצל חולי סוכרת. אנחנו הוכיחו גם נזק עצבי ב נוירופתיה אידיופתית סיבים קטנים ⁴ ו - ⁵ במחלת פברי.

איור 14. קרנית תמונות מיקרוסקופיה confocal עם HRT השלישי של השכבה הקרנית של באומן (א) נושא בקרת לעומת המטופל (ב) עם נוירופתיה ו נזק עצבי חמור.

Discussion

מיקרוסקופיה confocal קרנית (CCM) היא טכניקה לא פולשנית קליניים שעשויים לשמש כדי לזהות נזק עצבי מוקדם לכמת סיבים הפתולוגיה קטן neuropathies היקפי כולל סוכרת, מחלת פברי ו אידיופטית neuropathies סיב קטן (ISFN). ההשפעה הקלינית המיידית של טכניקה זו מייצגת זינוק ענק קדימה מבחינת היכולת שלנו ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module			Heidelberg Engineering
CCM image analysis software v0.6			University of Manchester