Роговицы конфокальной микроскопии: Роман неинвазивной техники количественно Малый Fibre патологии периферической нервной системы

Резюме

Роговицы конфокальной микроскопии неинвазивного клинического техника, которая может быть использована для количественного С повреждения волокон для диагностики и стратифицировать пациентов с нейропатической увеличения степени тяжести.

Аннотация

Точную количественную оценку периферической нейропатии важно определить, риску пациентов, предвидеть ухудшение, и оценка новых методов лечения. Традиционные методы оценки неврологического дефицита и электрофизиологии и количественного сенсорного тестирования количественно функциональных изменений для выявления нейропатии. Тем не менее, ранние повреждения, как представляется, для небольших волокна и тем не менее эти тесты в первую очередь оценивать большие дисфункции волокна и имеют ограниченные возможности, чтобы продемонстрировать восстановление и ремонт. Только методы, которые позволяют прямое изучение немиелинизированных повреждения нервных волокон и ремонта икроножных нервов биопсия с электронной микроскопии и кожно-биопсии. Однако, оба являются инвазивными процедурами и требуют длительных процедур лабораторных и значительный опыт. Роговицы конфокальной микроскопии неинвазивного клинического технику, которая обеспечивает в естественных изображений роговицы нервных волокон. Мы показали ранние повреждения нерва, который предшествует потере intraepidermal нервных волокон в коже биопсия вместе с стратификация нейропатической тяжести и ремонт после трансплантации поджелудочной железы у больных сахарным диабетом. Мы также продемонстрировали, повреждение нервов в идиопатическая невропатия небольшие волокна и болезни Фабри.

протокол

Введение:

Точную количественную оценку периферической нейропатии важно определить, риску пациентов, предвидеть ухудшение, и оценка новых методов лечения. Традиционные методы оценки неврологического дефицита и электрофизиологии и количественного сенсорного тестирования количественно функциональных изменений для выявления нейропатии. Тем не менее, ранние повреждения, как представляется, для небольших волокна и тем не менее эти тесты в первую очередь оценивать большие дисфункции волокна и имеют ограниченные возможности, чтобы продемонстрировать восстановление и ремонт. Только методы, которые позволяют прямое изучение немиелинизированных повреждения нервных волокон и ремонта икроножных нервов биопсия с электронной микроскопии и кожно-биопсии. Однако, оба являются инвазивными процедурами и требуют длительных процедур лабораторных и значительный опыт. Роговицы конфокальной микроскопии неинвазивного клинического технику, которая обеспечивает в естественных изображений роговицы нервных волокон.

HRT III-Росток роговицы Module (RCM)

Руководство по эксплуатации

1. Подготовка камеры

Первым шагом в рассмотрении использовании ЗГТ является подготовка цель кончике линзы.

1. Первой на цель трубку лазерного сканирования камера, набор преломления до +12 диоптрий, а затем настроить камеру нижнее положение.
2. Применяют большие однородные, пузырь бесплатно, горошину, падение Viscotears на объективе чаевые.
3. Удалить TomoCap от стерильный контейнер и смонтировать его на объектив так, что кончик гелем формы мениска между объективом и крышкой. Нажмите на нее как можно дальше на держатель. Будьте осторожны, не прикасайтесь к передней поверхности TomoCap во время монтажа.
   
   Рисунок 1. Подготовка цель кончике линзы (верхний) применение геля viscotear (внизу) Применение TomoCap.
4. Перемещение лазерного сканирования камеры, как далеко назад, как можно на камеру монтирования.
5. Внутренней и внешней поверхности TomoCap оба выглядят как яркое отражение лазера. Координационным руль самолет должен быть скорректирован до яркое отражение наблюдается, что свидетельствует объектив сфокусирован в передней крышкой. Значение глубины на дисплее позицию внимание должно теперь быть в пределах от -150 до +150 мкм мкм.
6. Сброс настройки глубины до нуля.
   
   Рисунок 2. Регулировка фокальной плоскости.

2. Подготовка пациента

Глаза субъекта анестезируют использованием капли 0,4% benoxinate гидрохлорид, и Viscotears используется на передней части глаза для смазки.
Предмет сидит удобно, с подбородка на подбородке отдыха и просят нажать лбу категорически против лоб бар.

Рисунок 3. Подготовка пациента

3. Выравнивание камеры

Это делает исследование проще, если поручить пациенту закрепить на внешней световой фиксации глаз не рассматривается. Компактный размер микроскоп голову означает, что контралатеральных глаз испытуемого не затемняется, позволяя использование дистанционного целей.

Рисунок 4. Объектив роговицы модуля.

1. Установите камеру CCD такая, что ее оптической оси перпендикулярно оптической оси камеры лазерного сканирования. Камера должна быть на правой стороне пациента, когда изображение правого глаза и наоборот.
   В этой позиции, вы должны увидеть переднюю поверхность TomoCap в центре ПЗС-камерой живого изображения.
2. Перемещение лазерного сканирования камеры к пациенту, пока роговицы пациента на расстоянии от 5 до 10 мм от TomoCap, затем переместите камеру лазерного сканирования вверх / вниз и влево / вправо с помощью черной ручки на узле крепления видеокамеры до TomoCap расположен в центре роговицы пациента. На этом этапе вы можете проверить, что красный свет лазера в центре роговицы и для тонкой настройки, наблюдать отражение лазерного луча от роговицы, которая видна в изображении ПЗС-камерой. Это отражение должно происходить именно на переднем полюсе роговицы.
   
   Рисунок 5. Выравнивание лазерного пучка на переднем полюсе роговицы, чтобы захватить роговицы изображений.
3. Спросите пациента, чтобы открыть его / ее глаза как можно шире. Перемещение камеры лазерного сканирования медленно вперед по отношению к пациенту, пока контакты TomoCap роговицы пациента. Если требуетсячтобы исправить положение камеры лазерного сканирования, затем переместите камеру от пациента во-первых, делать коррекцию, а затем переместите его вперед снова связаться с роговицей.
   
   Рисунок 6. Демонстрация тонкой перемычкой между гелем TomoCap и роговицы.
4. Минимальный контакт между камерой и роговицы достаточно. В оптимальные настройки, тонким мостиком между гелем TomoCap и роговицу видна на ПЗС-камерой живого изображения.

Если вы нажмете TomoCap или переместить роговица слишком близко к камере, то вы увидите, давление на роговицу с уплощенным появление в роговице с помощью ПЗС-камеры, живой образ. Кроме того, в изображениях, полученных линия, показывающая давление появится, поэтому не прилагайте чрезмерных усилий к роговице. Как только контакт был установлен, не изменяет положения headrestto избежать скольжение роговицы на TomoCap.

Рисунок 7 (слева) Появление straie за счет применения избыточного давления на роговицы TomoCap;. (Справа) изображение с нормальный вид без избыточного давления.

4. Изучение пациентов

После поля зрения был выбран, HRT III лазерной камера включена и окна захвата изображения на экране. Использование изображения CCD позиционировать TomoCap и лазерного света на роговице пациента. Экспертиза использованием выбранного режима может быть начато.

Рисунок 8. Режим просмотра на мониторе во время съемки изображений.

Режим приобретения

В разделе режиме одного изображения приобретается и сохраняется при каждом нажатии на педаль. Мы используем этот режим для захвата изображений из всего рогового слоя, включая слой Боумена в центре роговицы. А потом, после захвата достаточного количества изображений, можно попробовать другие режимы, включая последовательность и объем.

Рисунок 9. Дисплей с выбором для различных режимов захвата изображений.

С Последовательность сканирования, можно приобрести последовательность до 100 изображений с регулируемой частотой кадров. Вы можете выбрать частоту кадров 30 кадров между и 1 кадр в секунду (FPS) и на основе этого режима он позволяет приобретать фильм с продолжительностью от 3 до 100 секунд.

В объемном режиме сканирования камера автоматически получает серию из 40 последовательных изображений в фокальных плоскостях. Общей глубиной 85 мкм могут быть отсканированы с "FOV 400 мкм" объектив поле и фокусное расстояние между двумя последовательными изображения будут примерно 2,1 мкм.

После нескольких сканирований фокальной плоскости объектива может быть изменен для измерения глубины рогового слоя ячейки относительно поверхности роговицы, принося эпителиального слоя клеток в фокусе, а затем нажать кнопку сброса, чтобы установить глубину значение 0.

Для целей нашего исследования, мы получаем изображения с центральной роговицы на разных глубинах. Поэтому мы не двигаемся лазерного сканирования камеры вокруг роговицы по горизонтали или вертикали, мы просто двигаться назад и вперед и захват изображений из всех глубинах слоя Боумена в то же роговицы точки. Расстояние между каждого изображения составляет примерно 1 мкм, поэтому если глубина Боумена составляет 10 мкм, у нас будет 10 изображений. Однако для окончательного анализа, мы выбрать изображения с расстояния около 2-3 мкм между ними.

После завершения экспертизы выключите камеру, нажав на кнопку питания камеры в приобретении окна. Сделать пациент знает, что он или она не должны тереться своим глазам, пока местная анестезия стерлась. В качестве меры предосторожности, вы можете выполнить обследование щелевой лампы роговицы пациента после осмотра.

Удалить TomoCap из камеры и распоряжаться его, а затем чистой микроскоп объективом с ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой.

5. Анализ экспертиза

a. Выбор кадров

Обзор и анализ существующих экзаменов, соответствующая запись пациента (ы) должны быть выбраны в окне базы данных. Окно просмотра изображения обеспечивает обзор существующих экзаменов роговицы для выбранного пациента. Экзамены проводились на разные дни хранятся в отдельных вкладках визита. Три различных типа сканирования представлены тремя различными иконками в роговице ЗГТ вкладку посетить III части окна просмотра изображений от Heidelberg глаз Explorer.

Для обследования роговицы изображение, дважды щелкните соответствующий значок изображения и "Показать" функция открывает следующее окно:

Рисунок 10. Отображение всех отснятых изображений после экспертизы.

Рисунок 11. Отображение выбранного изображения до экспорта с ПЗС камеры глаза, чтобы показать правильное выравнивание.

Для экспорта подходящие образы для дальнейшего анализа, нажмите кнопку "Экспорт" на панели инструментов и затем выберите папку, которую необходимо сохранить изображения.

Получена и захвата изображений из всех слоев роговицы для каждого пациента, но и как основное внимание в этом исследовании на слое Боумена и роговицы нервы, только изображения из этого слоя будут проанализированы. Мы выбираем 5-6 кадры из слоя Боумена по каждому предмету на разных глубинах роговицы.

Рисунок 12. Отображение всех слоев роговицы из здорового человека.

В среднем 5-6 кадры из слоя Боумена в центре роговицы на разных глубинах выбираются случайно для количественных измерений и анализа.

b. Анализ изображений

Для анализа изображений, полученных от слоя Боумена центральной роговицы с HRT III, мы используем специализированное программное обеспечение, которое было разработано в рамках нашей группы под названием "СКК изображения Инструменты анализа V 0.6".

Четыре основные параметры роговицы нервы измеряются с этим программным обеспечением:

• Нервные волокна плотностью (NFD), который определяется как число основных нервов / кадр.
• Нервные ветви плотности (NBD) число основных отраслей / кадр.
• Длина Нервные волокна (NFL), который является общая длина всех нервы / кадр.
• Нервные волокна извилистости (NFT) основных нервов / кадр.

Чтобы открыть изображение СКК, перейдите в меню File> Open.

• После загрузки изображения, его размер и тип отображается в коробке Информация об изображении в верхней левой стороны панели управления.
• По умолчанию масштаб отображается в строке редактирования изображения информации. Если масштаб разный, изменить число в строку ввода.
• Чтобы начать анализировать изображение, выберите параметр, который вы хотите измерить с метрической Box в верхней правой части панели управления.
• В результате поле в нижней части страницы, количество NFD, НБД представлена ​​в реальное число, NFL, в мм и извилистости как Извилистость коэффициент (ТК).
• Однако после экспорта результатов в лист Excel, результаты будут представлены в коем / мм ² для NFD и НБД-и мм / мм ² для NFL.
• Для этого после окончания измерений нажмите кнопку Добавить измерений, а затем перейдите в меню Файл> Сохранить как, а затем открыть сохраненные результаты с Excel.

Рисунок 13. Отображение изображения роговицы нерва с трассировку в инструмент анализа использования "СКК Image Analysis Tool".

6. Представитель Результаты:

Мы показали прогрессивного увеличения в роговицы дегенерации нерва с увеличением тяжести диабетической невропатии ¹ и в начале повреждение нервов при диабете, который предшествует потере intraepidermal нервных волокон в коже биопсии ² вместе с стратификация нейропатической тяжести и ремонт следующих трансплантации поджелудочной железы ³ у больных сахарным диабетом. Мы также продемонстрировали, повреждение нервов в идиопатическая невропатия небольшие волокна ⁴ и болезнь Фабри ^5.

Рисунок 14. Роговицы конфокальной микроскопии с изображениями HRT III слоя роговицы Боумена () Контроль предмет по сравнению с (б) пациентов с нейропатией и серьезного ущерба нерва.

Обсуждение

Роговицы конфокальной микроскопии (СКК) является неинвазивным клинических техника, которая может быть использована для выявления ранних повреждений нервов и количественно небольшие волокна патологии периферической нервной системы, включая диабет, болезни Фабри и идиопатический не?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module			Heidelberg Engineering
CCM image analysis software v0.6			University of Manchester