Microscopia corneale confocale: A Novel tecnica non invasiva per quantificare Piccole Fibre Patologia neuropatie periferiche

Riepilogo

Microscopia corneale confocale è una tecnica non invasiva clinici che possono essere utilizzati per quantificare i danni delle fibre C di diagnosticare e stratificare i pazienti con l'aumentare della gravità neuropatico.

Abstract

La quantificazione precisa di neuropatia periferica è importante definire i pazienti a rischio, anticipare il deterioramento, e valutare nuove terapie. I metodi convenzionali di valutare i deficit neurologici e elettrofisiologia e quantitativa test sensoriali quantifica le alterazioni funzionali a rilevare la neuropatia. Tuttavia, i primi danni sembra essere alle fibre piccolo ma questi test in primo luogo valutare la disfunzione grandi fibre e hanno una limitata capacità di dimostrare la rigenerazione e la riparazione. Le tecniche che permettono solo un esame diretto del danno amieliniche fibre nervose e di riparazione sono biopsia del nervo surale con il microscopio elettronico e la pelle-biopsia. Tuttavia, entrambi sono procedure invasive e richiedono lunghe procedure di laboratorio e di una notevole esperienza. Microscopia corneale confocale è una tecnica non invasiva clinico che fornisce in vivo immagini di fibre nervose corneali. Abbiamo dimostrato danno precoce del nervo, che precede la perdita di fibre nervose intraepidermiche nelle biopsie cutanee con stratificazione di gravità neuropatico e del trapianto di pancreas riparazione seguito nei pazienti diabetici. Abbiamo anche dimostrato danni al sistema nervoso in idiopatica neuropatia delle piccole fibre e la malattia di Fabry.

Protocollo

Introduzione:

La quantificazione precisa di neuropatia periferica è importante definire i pazienti a rischio, anticipare il deterioramento, e valutare nuove terapie. I metodi convenzionali di valutare i deficit neurologici e elettrofisiologia e quantitativa test sensoriali quantifica le alterazioni funzionali a rilevare la neuropatia. Tuttavia, i primi danni sembra essere alle fibre piccolo ma questi test in primo luogo valutare la disfunzione grandi fibre e hanno una limitata capacità di dimostrare la rigenerazione e la riparazione. Le tecniche che permettono solo un esame diretto del danno amieliniche fibre nervose e di riparazione sono biopsia del nervo surale con il microscopio elettronico e la pelle-biopsia. Tuttavia, entrambi sono procedure invasive e richiedono lunghe procedure di laboratorio e di una notevole esperienza. Microscopia corneale confocale è una tecnica non invasiva clinico che fornisce in vivo immagini di fibre nervose corneali.

HRT-III Modulo Rostock Cornea (RCM)

Manuale di funzionamento

1. Preparazione della fotocamera

Il primo passo in esame con HRT è la preparazione della punta della lente obiettiva.

1. Prima il tubo obiettivo della macchina fotografica laser a scansione, impostare la rifrazione a +12 diottrie e quindi regolare la telecamera nella posizione più bassa.
2. Applicare una grande omogenea, bolla libero, goccia dentifricio, di Viscotears sulla punta lente.
3. Rimuovere un TomoCap dal suo contenitore sterile e montarlo sulla punta lenti in modo che il gel forma un menisco tra le lenti dell'obiettivo e il tappo. Spingere il più lontano possibile, oltre al titolare. Fare attenzione a non toccare la superficie anteriore del TomoCap durante il montaggio.
   
   Figura 1. Preparazione della punta lente dell'obiettivo (in alto) applicando viscotear gel (in basso) Applicazione del TomoCap.
4. Spostare la telecamera laser a scansione il più indietro possibile, sul monte fotocamera.
5. La superficie interna ed esterna del TomoCap entrambi appaiono come un riflesso laser luminoso. La rotella di regolazione focale aereo deve essere regolato fino a un riflesso luminoso è osservato, indicando che l'obiettivo è focalizzato nella parte anteriore del coperchio. Il valore di profondità visualizzato sul display posizione opportuno concentrarsi ora tra -150 micron e 150 micron.
6. Ripristina l'impostazione della profondità a zero.
   
   Figura 2. Regolazione del piano focale.

2. Preparazione del paziente

Gli occhi del soggetto sono anestetizzati con un calo del 0,4% cloridrato benoxinate, e Viscotears è utilizzato sulla parte anteriore dell'occhio per la lubrificazione.
Il soggetto è seduto comodamente, con il mento sulla mentoniera e ha chiesto di premere il fronte con fermezza contro il bar fronte.

Figura 3. Preparazione del paziente

3. Allineamento della Camera

Rende l'esame più facile se si istruire il paziente a fissare la luce fissazione esterna con l'occhio non è in corso di esame. Le dimensioni compatte della testa microscopio significa che l'occhio controlaterale del soggetto non è oscurata, consentendo l'uso di obiettivi a distanza.

Figura 4. Lente Obiettivo del modulo corneale.

1. Posizionare la fotocamera CCD tale che il suo asse ottico è perpendicolare all'asse ottico della camera di scansione laser. La fotocamera dovrebbe essere sul lato destro del paziente quando l'imaging l'occhio destro e viceversa.
   In questa posizione, si dovrebbe vedere la superficie anteriore del TomoCap al centro dell'immagine camera CCD dal vivo.
2. Spostare la telecamera a scansione laser verso il paziente fino cornea del paziente si trova ad una distanza di circa 5 a 10 mm dal TomoCap, quindi spostare la telecamera scansione laser su / giù e sinistra / destra con le manopole nere sul monte fotocamera fino a quando il TomoCap è posizionato al centro della cornea del paziente. In questa fase è possibile verificare che la luce laser rosso si trova nel centro della cornea e per la regolazione fine, osservare il riflesso del raggio laser dalla cornea, che è visibile nell'immagine camera CCD. Questa riflessione deve avvenire esattamente al polo anteriore della cornea.
   
   Figura 5. Allineamento del fascio laser sul polo anteriore della cornea per catturare immagini corneale centrale.
3. Chiedere al paziente di aprire gli occhi suoi / sue più ampio possibile. Spostare la telecamera scansione laser lentamente in avanti verso il paziente fino a quando i contatti TomoCap cornea del paziente. Se è necessarioper correggere la posizione della telecamera di scansione laser, quindi spostare la telecamera dal primo paziente, fare la correzione, poi andare avanti di nuovo a contatto con la cornea.
   
   Figura 6. Dimostrazione del ponte gel sottile tra la TomoCap e la cornea.
4. Minimo contatto tra la fotocamera e la cornea è sufficiente. In una regolazione ottimale, un ponte sottile tra il gel TomoCap e la cornea è visibile l'immagine della telecamera CCD dal vivo.

Se si preme il TomoCap o spostare la cornea troppo vicino alla fotocamera poi si vedrà pressione sulla cornea con un aspetto appiattito nella cornea attraverso l'immagine della telecamera CCD dal vivo. Anche nelle immagini ottenute una linea che mostra la pressione appare, pertanto, non applicare troppa pressione alla cornea. Una volta che il contatto è stato stabilito, non spostare la posizione del headrestto evitare di scivolare la cornea sul TomoCap.

Figura 7 (a sinistra) aspetto di un straie a causa di applicazione di una pressione eccessiva sulla cornea dalla TomoCap;. (A destra) Un'immagine con aspetto normale, senza eccesso di pressione.

4. Esaminando il paziente

Dopo il campo di vista è stato selezionato, la HRT III fotocamera laser è acceso e la finestra di acquisizione immagine viene visualizzata sullo schermo. Utilizzare l'immagine CCD per posizionare il TomoCap e la luce laser sulla cornea del paziente. Esame con la modalità selezionata può quindi essere avviato.

Figura 8. Modalità di visualizzazione sul monitor durante l'acquisizione di immagini.

La modalità di acquisizione

Nella modalità di sezione, una singola immagine viene acquisita e memorizzati ogni volta che si preme il pedale. Noi utilizziamo questa modalità per catturare le immagini dallo strato corneo tutto compreso strato di Bowman nel centro della cornea. E poi, dopo aver catturato un numero sufficiente di immagini, si possono provare le altre modalità tra cui la sequenza e il volume.

Figura 9. Display con scelta di diverse modalità di acquisizione delle immagini.

Con la scansione di sequenza, si può acquisire una sequenza fino a 100 immagini con un frame rate regolabile. È possibile scegliere un frame rate tra i 30 frame e 1 frame al secondo (fps) e sulla base di questa modalità permette di acquisire un film con una durata da 3 a 100 secondi.

In modalità di scansione del volume, la fotocamera acquisisce automaticamente una serie di 40 immagini consecutive a piani focali. Una profondità totale di 85 micron possono essere acquisiti con il "FOV 400 micron" lente di campo e la distanza focale tra due immagini consecutive saranno circa 2,1 micron.

Dopo un paio di scansioni il piano di messa a fuoco dell'obiettivo può essere modificata per misurare la profondità di uno strato di cellule della cornea rispetto alla superficie della cornea portando lo strato delle cellule epiteliali a fuoco e quindi facendo clic sul pulsante Ripristina per impostare il valore della profondità a 0.

Ai fini del presente studio, si ottengono immagini dalla cornea centrale a diverse profondità. Perciò non muovere la telecamera a scansione laser attorno alla cornea orizzontalmente o verticalmente, dobbiamo solo spostare avanti e indietro e catturare le immagini da tutte le profondità dello strato di Bowman nello stesso punto della cornea. La distanza tra ogni immagine è di circa 1 micron, quindi se la profondità del Bowman è di 10 micron, avremo 10 immagini. Tuttavia per l'analisi finale, selezioniamo le immagini con una distanza di circa 2-3 micron tra di loro.

Dopo l'esame è completa spegnere la fotocamera premendo il pulsante di alimentazione della fotocamera nella finestra di acquisizione. Rendere il paziente consapevole che lui o lei non deve strofinare gli occhi la sua fino a quando l'anestesia locale ha portato fuori. Per precauzione, si consiglia di eseguire un esame lampada a fessura della cornea del paziente dopo l'esame.

Rimuovere il TomoCap dalla fotocamera e smaltire e poi pulire la lente del microscopio con un bastoncino di cotone inumidito con acqua distillata.

5. Analisi di un esame

a. Selezione del frame

Per rivedere ed analizzare gli esami esistenti, la cartella clinica appropriata (s) deve essere selezionata nella finestra del database. La finestra di visualizzazione delle immagini offre una panoramica degli esami cornea esistenti per il paziente selezionato. Esami eseguiti in giorni diversi sono memorizzati in schede differenti visite. I tre tipi diversi di scansione sono rappresentate da tre icone differenti nella scheda cornea visita HRT III della finestra di visualizzazione dell'immagine della Heidelberg Eye Explorer.

Per controllare l'immagine della cornea, fare doppio clic sull'icona desiderata immagine e la funzione "Visualizza" si apre la seguente finestra:

Figura 10. Visualizzazione di tutte le immagini acquisite dopo l'esame.

Figura 11. Visualizzazione di immagini selezionate prima dell'esportazione con telecamera CCD dell'occhio per mostrare il corretto allineamento.

Per esportare le immagini appropriate per ulteriori analisi, fare clic su "Esporta" nella barra degli strumenti e quindi selezionare la cartella che si desidera salvare le immagini.

Otteniamo e catturare le immagini da tutti gli strati della cornea per ogni paziente, ma come l'obiettivo principale di questa ricerca è sullo strato di Bowman e dei nervi corneali, solo le immagini di questo strato saranno analizzati. Selezioniamo 5-6 fotogrammi da strato di Bowman per ogni soggetto a diverse profondità della cornea.

Figura 12. Visualizzazione di tutti gli strati corneali da un soggetto sano.

In media 5-6 fotogrammi da strato di Bowman nel centro della cornea a diverse profondità sono selezionati in modo casuale per misure quantitative e di analisi.

b. Analizzando le immagini

Per analizzare le immagini catturate dallo strato di Bowman della cornea centrale con HRT III, utilizziamo software specializzato che è stato sviluppato all'interno del nostro gruppo chiamato "CCM Image Analysis Tools v 0.6".

Quattro i principali parametri per i nervi corneali sono misurati con questo software:

• Densità delle fibre nervose (NFD) che è definita come il numero di nervi principali / telaio.
• Nervo ramo densità (NBD) il numero degli sportelli principali / telaio.
• Lunghezza delle fibre nervose (NFL), che è la lunghezza totale di tutti i nervi / frame.
• Tortuosità delle fibre nervose (NFT) dei principali nervi / telaio.

Per aprire l'immagine CCM, passare al file> aperto.

• Una volta che l'immagine viene caricata, le sue dimensioni e il tipo viene visualizzato nella finestra Informazioni immagine in alto a sinistra mano-lato del pannello di controllo.
• La scala di default viene visualizzato nella riga di modifica delle informazioni immagine. Se la scala è diversa, modificare il numero nella riga di modifica.
• Per iniziare l'analisi dell'immagine, selezionare il parametro che si vuole misurare dal Box metriche in alto a destra del pannello di controllo.
• Nella finestra di risultato in fondo alla pagina il numero di NFD, NBD è presentata in numero effettivo, NFL in mm e tortuosità come un coefficiente Tortuosity (TC).
• Tuttavia dopo l'esportazione i risultati in un foglio excel, i risultati saranno presentati in nessun / mm ² per NFD e NBD e mm / mm ² per la NFL.
• A tale scopo dopo aver terminato le misurazioni cliccare su misurazioni Aggiungi, poi andare su File> Salva con nome e quindi aprire i risultati salvati con Excel.

Figura 13. Visualizzazione di immagini nervose corneali con l'analisi in strumento di analisi l'utilizzo di "Image Tool CCM Analysis".

6. Rappresentante dei risultati:

Abbiamo dimostrato un progressivo aumento nella degenerazione dei nervi corneali con gravità crescente della neuropatia diabetica ¹ e danni al sistema nervoso nelle prime diabete che precede la perdita di fibre nervose intraepidermiche nelle biopsie cutanee ² assieme ad stratificazione di gravità neuropatico e riparazione di pancreas trapianto ³ in pazienti diabetici. Abbiamo anche dimostrato danni al sistema nervoso in idiopatica neuropatia delle piccole fibre malattia di Fabry ⁴ e ^5.

Figura 14. Corneale immagini di microscopia confocale con HRT III strato della cornea Bowman (a) soggetti di controllo rispetto a (b) Paziente con neuropatia e gravi danni ai nervi.

Discussione

Microscopia corneale confocale (CCM) è una tecnica non invasiva clinici che possono essere utilizzati per rilevare i danni primi nervi e quantificare piccole fibre patologia in neuropatie periferiche tra cui il diabete, malattia di Fabry e idiopatica neuropatie delle piccole fibre (ISFN). L'impatto immediato clinico di questa tecnica rappresenta un enorme passo in avanti in termini di capacità di diagnosticare, seguire la progressione e valutare la risposta terapeutica nei pazienti con neuropatia diabetica e di al...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module			Heidelberg Engineering
CCM image analysis software v0.6			University of Manchester