Microscopia Confocal de córnea: uma técnica não-invasiva Novel para Quantificar Pequenas Fibre Patologia em neuropatias periféricas

Resumo

A microscopia confocal de córnea é uma técnica não-invasiva clínicos que podem ser utilizados para quantificar os danos da fibra C para diagnosticar e estratificar pacientes com maior gravidade neuropática.

Resumo

A quantificação precisa de neuropatia periférica é importante definir em pacientes de risco, antecipar deterioração, e avaliar novas terapias. Métodos convencionais avaliar os déficits neurológicos e eletrofisiologia e testes sensoriais quantitativos quantifica as alterações funcionais para detectar a neuropatia. No entanto, os primeiros danos parece ser a de que as fibras pequenas e ainda esses testes principalmente avaliar a disfunção das fibras grandes e têm uma capacidade limitada para demonstrar regeneração e reparo. As técnicas que permitem que apenas um exame direto dos danos unmyelinated de fibras nervosas e de reparação são nervo sural com microscopia eletrônica de biópsia e pele-biópsia. No entanto, ambos são procedimentos invasivos e necessitam de procedimentos de laboratório longo e uma experiência considerável. A microscopia confocal de córnea é uma técnica não-invasiva clínicos que fornece in-vivo de imagens de fibras nervosas da córnea. Demonstramos lesão do nervo precoce, o que precede a perda de fibras nervosas intraepidérmicas em biópsias de pele, juntamente com a estratificação de gravidade neuropática e transplante de pâncreas após reparo em pacientes diabéticos. Temos também demonstrou lesão do nervo na neuropatia fibra idiopática pequenas e doença de Fabry.

Protocolo

Introdução:

A quantificação precisa de neuropatia periférica é importante definir em pacientes de risco, antecipar deterioração, e avaliar novas terapias. Métodos convencionais avaliar os déficits neurológicos e eletrofisiologia e testes sensoriais quantitativos quantifica as alterações funcionais para detectar a neuropatia. No entanto, os primeiros danos parece ser a de que as fibras pequenas e ainda esses testes principalmente avaliar a disfunção das fibras grandes e têm uma capacidade limitada para demonstrar regeneração e reparo. As técnicas que permitem que apenas um exame direto dos danos unmyelinated de fibras nervosas e de reparação são nervo sural com microscopia eletrônica de biópsia e pele-biópsia. No entanto, ambos são procedimentos invasivos e necessitam de procedimentos de laboratório longo e uma experiência considerável. A microscopia confocal de córnea é uma técnica não-invasiva clínicos que fornece in-vivo de imagens de fibras nervosas da córnea.

HRT Módulo III-Rostock córnea (RCM)

Manual de Operação

1. Preparação da Câmara

O passo inicial no exame usando HRT é a preparação da ponta da lente objetiva.

1. Primeiro objetivo no tubo da câmera de varredura a laser, defina a refração de 12 dioptrias e, em seguida, ajustar a câmera para a posição mais baixa.
2. Aplicar uma grande bolha, homogênea livre, queda de ervilha de tamanho, de Viscotears na ponta da lente.
3. Remover um TomoCap de seu recipiente estéril e montá-lo sobre a ponta da lente de modo que o gel forma um menisco entre a lente objetiva ea tampa. Empurrá-lo, tanto quanto possível sobre o titular. Tenha cuidado para não tocar a superfície frontal de TomoCap durante a montagem.
   
   Figura 1. Preparação da ponta lente objetiva (em cima) aplicando viscotear gel (baixo) Aplicando a TomoCap.
4. Mover a câmera de varredura a laser, tanto para trás quanto possível sobre a montagem da câmera.
5. A superfície interna e externa do TomoCap ambos aparecem como uma reflexão do laser brilhante. A roda de ajuste de plano focal deve ser ajustado até que um reflexo luminoso é observado, indicando que a lente está focada na parte da frente do boné. O valor da profundidade mostrada no visor posição do foco agora deve estar entre -150 mm e 150 mM.
6. Redefinir a configuração de profundidade de zero.
   
   Figura 2. Ajuste do plano focal.

2. Preparar o paciente

Os olhos do sujeito estão anestesiados com uma queda de 0,4% de cloridrato de benoxinate e Viscotears é usado na parte da frente do olho para a lubrificação.
O assunto está sentado confortavelmente, com o queixo no queixo e no resto solicitado a pressionar sua testa com firmeza contra o bar testa.

Figura 3. Preparar o paciente

3. Alinhando a Câmara

Isso torna o exame mais fácil se você instruir o paciente para corrigir a luz de fixação externa com o olho não examinado. O tamanho compacto da cabeça microscópio significa que o olho contralateral do sujeito não é obscurecida, possibilitando o uso de alvos à distância.

Figura 4. Lente objetiva do módulo de córnea.

1. A posição da câmera CCD de tal forma que seu eixo óptico é perpendicular ao eixo óptico da câmera de varredura a laser. A câmera deve estar no lado direito do paciente quando imagem do olho direito e vice-versa.
   Nesta posição, você deve ver a superfície frontal do TomoCap no centro da imagem da câmera CCD ao vivo.
2. Mover a câmera de varredura a laser em direção ao paciente até que a córnea do paciente é a uma distância de cerca de 5 a 10 mm da TomoCap, em seguida, mover a câmera de varredura a laser para cima / baixo e esquerda / direita usando os botões preto no suporte de câmera até o TomoCap está posicionado no centro da córnea do paciente. Nesta fase você pode verificar que a luz laser vermelho está no centro da córnea e para o ajuste fino, observe o reflexo do feixe de laser da córnea, que é visível na imagem da câmera CCD. Esta reflexão deve ocorrer exatamente no pólo anterior da córnea.
   
   Figura 5. Alinhamento do feixe de laser no pólo anterior da córnea para capturar imagens centrais da córnea.
3. Peça ao paciente para abrir os olhos dele / dela o mais amplo possível. Mover a câmera de varredura a laser lentamente para a frente em relação ao paciente até que os contatos TomoCap córnea do paciente. Se for necessáriopara corrigir a posição da câmera de varredura a laser, em seguida, mover a câmera longe do primeiro paciente, fazer a correção, em seguida, movê-lo para a frente novamente entrar em contato com a córnea.
   
   Figura 6. Demonstração da ponte gel fina entre o TomoCap ea córnea.
4. Contato mínimo entre a câmara ea córnea é suficiente. Em um ajuste ideal, uma ponte entre o gel fino TomoCap ea córnea é visível na imagem da câmara CCD ao vivo.

Se você pressionar o TomoCap ou mover a córnea demasiado perto da câmera, então você vai ver a pressão sobre a córnea com uma aparência achatada na córnea através da imagem da câmera CCD ao vivo. Também nas imagens obtidas de uma linha mostrando a pressão vai aparecer, portanto, não aplique muita pressão para a córnea. Depois que o contato tenha sido estabelecido, não mova a posição do headrestto evitar deslizamento da córnea na TomoCap.

Figura 7 (à esquerda) Aparecimento de uma straie devido à aplicação de excesso de pressão sobre a córnea pela TomoCap;. (Direita) Uma imagem com aparência normal, sem excesso de pressão.

4. Examinar o paciente

Após o campo de visão foi selecionado, o HRT III câmera laser é ligado ea janela de aquisição de imagem aparece na tela. Use a imagem CCD para posicionar o TomoCap e luz laser na córnea do paciente. Exame usando o modo selecionado pode então ser iniciado.

Figura 8. Vendo modo no monitor durante a aquisição das imagens.

O modo de aquisição

No modo de seção, uma única imagem é adquirido e armazenado cada vez que você pressionar o pedal. Usamos este modo para capturar imagens de toda a camada córnea, incluindo camada de Bowman no centro da córnea. E, em seguida, depois de capturar um número suficiente de imagens, pode-se tentar outros modos incluindo seqüência e volume.

Figura 9. Display com escolha para diferentes modos de aquisição de imagem.

Com a verificação de seqüência, pode-se adquirir uma seqüência de até 100 imagens com uma taxa de frame ajustável. Você pode escolher uma taxa de quadros entre 30 e 1 frame frames por segundo (fps) e com base neste modo permite-lhe adquirir um filme com uma duração de 3 a 100 segundos.

No modo de varredura volume, a câmera automaticamente adquire uma série de 40 imagens em planos consecutivos focal. A profundidade total de 85 mM podem ser digitalizados com a "400 m FOV" lente de campo ea distância focal entre duas imagens consecutivas será de aproximadamente 2,1 mM.

Depois de um alguns scans do plano de focagem da lente pode ser alterado para medir a profundidade de uma camada de células da córnea em relação à superfície da córnea, trazendo a camada de células epiteliais em foco e, em seguida, clicar no botão Redefinir para definir o valor de profundidade a 0.

Para efeitos de nosso estudo, obter imagens a partir da córnea central em diferentes profundidades. Portanto, não mover a câmera de varredura a laser ao redor da córnea horizontalmente ou verticalmente, basta mover para trás e para frente e capturar imagens de todas as profundidades da camada de Bowman no mesmo ponto da córnea. A distância entre cada imagem é de aproximadamente 1 mm; portanto, se a profundidade de Bowman é 10 mM, teremos 10 imagens. No entanto, para análise final, vamos selecionar as imagens a uma distância de cerca de 2-3 mM entre eles.

Após o exame completo é desligar a câmera clicando no botão de energia da câmera na janela de aquisição. Tornar o paciente consciente de que ele ou ela não deve esfregar seus olhos até que a anestesia local tem desgastado fora. Como precaução, você pode desejar realizar um exame na lâmpada de fenda da córnea do paciente após o exame.

Remover o TomoCap da câmera e eliminá-lo e depois limpar a lente do microscópio com um cotonete umedecido com água destilada.

5. Análise de um exame

a. Selecionando os quadros

Para rever e analisar os exames existentes, o registro do paciente apropriado (s) deve ser selecionado na janela banco de dados. A janela de visualização de imagem fornece uma visão geral de exames existentes córnea para o paciente selecionado. Exames realizados em dias diferentes são armazenadas em abas separadas visita. Os três tipos de scan diferentes são representadas por três diferentes ícones na guia visita HRT III córnea da janela de visualização de imagem do HeiDelberg Eye Explorer.

Para o levantamento da imagem córnea, clique duas vezes no ícone de imagem adequada ea "Show" função abre a seguinte janela:

Figura 10. Exibição de todas as imagens capturadas após o exame.

Figura 11. Exibição de imagem selecionada antes da exportação, com visão da câmera CCD do olho para mostrar alinhamento correto.

Para exportar as imagens apropriadas para posterior análise, clique em "Export" na barra de ferramentas e selecione a pasta que você deseja salvar as imagens para.

Obtemos e capturar imagens de todas as camadas da córnea de cada paciente, mas como o foco principal desta pesquisa é na camada de Bowman e os nervos da córnea, apenas as imagens desta camada será analisado. Nós selecionamos 5-6 frames da camada de Bowman para cada indivíduo em diferentes profundidades da córnea.

Figura 12. Exibição de todas as camadas da córnea de um indivíduo saudável.

Em média 5-6 frames da camada de Bowman no centro da córnea em diferentes profundidades são selecionados aleatoriamente para medições quantitativas e análise.

b. Análise de imagens

Para analisar as imagens captadas a partir da camada de Bowman da córnea central com HRT III, usamos um software especializado que tem sido desenvolvido dentro do nosso grupo chamado "Image Analysis Tools CCM v 0.6".

Quatro parâmetros principais para os nervos da córnea são medidos com este software:

• Densidade de fibras nervosas (NFD), que é definido como o número de nervos main / frame.
• Nervo ramo densidade numérica (NBD) de ramos principais / frame.
• Comprimento da fibra nervosa (NFL), que é o comprimento total de todos os nervos / frame.
• Tortuosidade de fibras nervosas (NFT) dos principais nervos / frame.

Para abrir imagem CCM, vá para o arquivo> abrir.

• Uma vez que a imagem é carregada, o seu tamanho e tipo é exibido no Box de Informações da imagem no topo do lado esquerdo do Painel de Controle.
• A escala padrão é exibido na linha de edição de imagem da Informação. Se a escala é diferente, modifique o número na linha de edição.
• Para começar a analisar a imagem, selecione o parâmetro que você quer medir a Caixa Metric no lado direito superior do painel de controle.
• Na caixa de resultado na parte inferior da página o número de NFD, NBD é apresentado em número real, NFL em mm e tortuosidade como um Coeficiente de tortuosidade (TC).
• No entanto depois de exportar os resultados para uma folha excel, os resultados serão apresentados em nenhum mm / ² para NFD e NBD e mm / mm ² para NFL.
• Para este efeito, depois de terminar as medições clique em Adicionar medições, então vá ao menu Arquivo> Salvar como e abra os resultados salvos com Excel.

Figura 13. Exibição da imagem nervosas da córnea com o rastreamento na ferramenta de análise usando "CCM Ferramenta de Análise de Imagem".

6. Resultados representativos:

Temos demonstrado um progressivo aumento na degeneração dos nervos da córnea com a gravidade da neuropatia diabética ¹ e danos nos nervos no início de diabetes, que precede a perda de fibras nervosas intraepidérmicas em biópsias de pele ^2, juntamente com a estratificação de gravidade neuropática e reparação após o transplante do pâncreas em pacientes diabéticos ^3. Temos também demonstrou lesão do nervo na neuropatia fibra idiopática pequenos ⁴ e doença de Fabry ^5.

Figura 14. Córnea imagens de microscopia confocal com HRT III da camada de Bowman corneana do (a) sujeito em relação ao controle (b) Paciente com neuropatia e lesões nervosas graves.

Discussão

Microscopia confocal da córnea (CCM) é uma técnica não-invasiva clínica que pode ser usado para detectar danos nos nervos cedo e quantificar pequenas fibras de patologia em neuropatias periféricas, incluindo diabetes, doença de Fabry e idiopática neuropatias de fibras pequenas (ISFN). O impacto imediato clínica desta técnica representa um grande salto em termos de nossa capacidade de diagnosticar, acompanhar a evolução e avaliar a resposta terapêutica em pacientes com neuropatia diabética e outras neuropat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module			Heidelberg Engineering
CCM image analysis software v0.6			University of Manchester