צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

Summary

התפתחות מוקדמת של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מאופיינת במספר שינויים בצורת התא כי הם גם מתאים גישות הדמיה. מאמר זה יתאר כלים בסיסיים ושיטות הדרושים הדמיה confocal חיים של עוברים תסיסנית, יתמקד בשינוי צורת התא הנקרא cellularization.

Abstract

העובר המתפתח תסיסנית melanogaster עובר מספר שינויים בצורת התא כי הם נוחים מאוד לחיות הדמיה confocal. צורת התא שינויים לטוס מקבילים לאלה של יצורים עילאיים, והם כונן המורפוגנזה רקמות. לכן, במקרים רבים, המחקר שלהם יש השלכות ישירות להבנת מחלות אנושיות (טבלה 1) ^1-5. בסולם המשנה הסלולר, אלה שינויים בצורת התא הם תוצר של פעילויות, החל ביטוי גנים על התמרה האות, קוטביות התא, שיפוץ cytoskeletal וסחר הממברנה. לכן, את העובר תסיסנית מספק לא רק את ההקשר כדי להעריך שינויים בצורת התא ככל שהם מתייחסים המורפוגנזה רקמות, אלא גם מציע סביבת פיזיולוגיים לחלוטין ללמוד את המשנה הסלולר פעילות תאים לעצב.

הפרוטוקול המתואר כאן נועד תמונה תאים מסוים לשנות צורה נקרא cellularization. Cellularization הוא תהליך של צמיחה פלזמה דרמטי קרום, וזה בסופו של דבר ממיר את העובר סינסיציאלי לתוך blastoderm הסלולר. כלומר, בכל שלבי הביניים של מחזור mitotic 14, הממברנה הפלסמטית בו זמנית invaginates סביב זה של גרעינים 6000 ~ מעוגן cortically ליצור גיליון של תאים אפיתל העיקרי. בניגוד להצעות קודמות, cellularization אינו מונע על ידי contractility שרירן-2 ^6, אבל היא מונעת בעיקר על ידי במקום exocytosis של קרום מחנויות פנימי ^7. לפיכך, cellularization היא מערכת מצוינת ללימוד סחר קרום במהלך שינויים בצורת התא הדורשים הממברנה הפלסמטית invagination או הרחבה, כגון cytokinesis או רוחבי, אבובית (T-אבובית) המורפוגנזה בשריר.

שים לב שזה פרוטוקול מוחל בקלות הדמיה של אחרים שינויים בצורת התא בעובר לעוף, רק דורש הסתגלות קלה כגון שינוי בשלב של איסוף העובר, או באמצעות "דבק העובר" על מנת לטעון את העובר בכיוון טבלה ספציפיים ( 1) ^8-19. בכל מקרה, זרימת העבודה הוא בעצם אותו דבר (איור 1). שיטות תקן שיבוט תסיסנית transgenesis משמשים להכנת מניות לעוף יציב המבטאים חלבון של עניין, התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או על גירסאותיה, וזבובים אלה מהווים מקור מתחדש של עוברים. לחלופין, חלבוני ניאון / בדיקות מוצגים ישירות באמצעות הזרקת מיקרו פשוט טכניקות ^9-10 לעוברי לעוף. ואז, תלוי במקרה התפתחותיים שינוי צורת התא להיות צילמו, עוברים נאספים מבוים על ידי המורפולוגיה על מיקרוסקופ לנתח, ואת מיקומו ולבסוף ועלה הדמיה זמן לשגות על מיקרוסקופ confocal.

Protocol

1. להרכיב אוסף כוסות עובריים

1. חותכים את החלק התחתון של כוס 100 מ"ל Tri-תירס עם סכין, מה שהופך את קצה כפי חלקה ככל האפשר. כוסות קל יותר להתמודד אם גם לקצץ את שלוש פינות הנחה של העליון, אם כי זה לא הכרחי.
2. חותכים ריבוע של רשת תיל (6 ס"מ X 6 ס"מ). על צלחת מראש חימם חם, בתוך שכבת עשן מכסה המנוע, הכיכר של רשת התיל על גבי פיסת נייר אלומיניום עבות. לחצו על תחתית לחתוך בתחתית הספל בחוזקה על רשת החם. חכו כמה שניות, להרים את הכוס עם רשת המצורפת עכשיו. אם לסכל את גם מקלות, פשוט לקלף אותה.
3. מצננים את הכוס למשך הלילה. הסר רשת העודפים עם מספריים, וחול את כל קצוות חדים עם נייר זכוכית עדין תבואה.

2. הפוך את צלחות אגר אפל מיץ

1. בכל בקבוקון 6L, לשלב 100 גרם BD אגר Bacto ומים מזוקקים 3L. החיטוי אגר במשך 30 דקות על הגדרת פליטה איטית.
2. בבקבוק 2L עם בר ומערבבים, סוכרוז לשלב 100 גרם, 1 ליטר מיץ תפוחים, 6 גרם p-Hydroxybenzoic חומצה. מחממים את הפתרון רתיחה תוך כדי ערבוב על פלטה חשמלית. לא להרתיח במשך יותר מ 2 דקות. אפשר את תערובת מיץ תפוחים להתקרר, ולאחר מכן להוסיף עם בר ומערבבים עד אגר. מערבבים לחלוטין.
3. אפשר פתרון משולב קריר אמבטיה 60 מעלות צלזיוס מים שזרמו לפני המנות 60x15 מ"מ פטרי. לחלופין, משאבה peristaltic ניתן לוותר אגר. אפשר הצלחות כדי להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 4 שעות לפחות. Stack ב Rubbermaid מכולות עם שכבה של מגבות נייר רטוב חנות ב 4 ° C.

הערות:

• בסתיו או בחורף, ייתכן שיהיה צורך להוסיף 100 מ"ל נוספים של מים אגר.
• המותג של בצלחות פטרי חשוב! רק פלקון מנות BD להתאים את Tri-כוסות תירס. הזמנת מידע ספציפי ניתן למצוא בטבלה שלהלן חומרים.

3. הוסף זבובים GFP את אוסף כוסות עובריים

1. Expand מניות ה-GFP על פי הצרכים שלך על ידי הגדרת אוסף בקבוקים של זבובים כשבועיים לפני הדמיה. אחת בקבוק של זבובים הוא בדרך כלל יותר מאשר מספיק כדי למלא את אחד אוסף כוס עובר עם מינימום של 50 נשים ו -30 גברים. הנחת הטובה ביותר, זבובים צריכים להיות eclosed החדש (כלומר פחות מ -5 ימים לאחר הבקיעה).
2. הפוך שמרים להדביק ידי מילוי כוס קטנה עם שמרים בחלקים שווים בערך הכוכב האדום יבש פעיל מים מזוקקים, ומערבבים עד שמרים הוא מומס. הדבק צריך עקביות משוער של חמאת בוטנים רטובים. עוד שמרים או מים ניתן להוסיף לשנות את עקביות. להדביק שמרים יכולים לשמש במשך כמה ימים, ו צריך להיות מאוחסן, מכוסה, על 4 ° C.
3. לאחר להדביק שמרים מוכן, להסיר צלחות מיץ תפוחים מן 4 ° C אחסון. Streak את מיץ התפוחים עם צלחות להדביק את השמרים, ולאפשר להם חם 22-25 מעלות צלזיוס, אשר יעודד ההטלה.
4. מקפלים נייר סינון עגול וחצי, ואז במחצית שוב. Trim כדי בקוטר 8-9 ס"מ, ולעשות קפלי אקורדיון במעגל ברבעון. Unfold את המעגל, להפוך אותו, להכניס אותו בכוס אוסף עד נוגע רשת. ודא שהנייר הוא מאובטח בגביע כך שזה לא ליפול ולרסק את הזבובים. העיתון מסנן הוא אופציונלי, אך מספק סביבה מסבירת פנים עבור הזדווגות, ושומרת על לחות בגביע.
5. לייבל כוס עם שם המניה ותאריך. העברת הזבובים מהבקבוק לכוס את האוסף על ידי רועדות בעדינות את הבקבוק הפוך על כוס, ומיד לכסות את הכוס עם צלחת תפוח מוכן מיץ. אבטח את צלחת כוס עם גומייה. סט כוסות בצד את רשת באזור עם אור ישיר. ודא כי הצללים לא ליפול על הכוס, כמו זבובים לא יניח גם בחושך.
6. שנה את צלחת מיץ תפוחים לפי הצורך. שעתיים אוספים, בטמפרטורת החדר, פועלות היטב עבור cellularization הדמיה.

4. הכן לשכת הרכבה

1. כדי להכין את חדר גובר על העוברים, לחתוך נייר דבק דו צדדית 2-3 ס"מ ומניחים אותו בשקופית, יישור ציר זמן של הקלטת והחלק. גזור שנייה 2-3 ס"מ חתיכה ארוכה של קלטת דו צדדית שכבת זה על גבי פיסת השני של הקלטת, כדי לוודא הקצוות שלהם מיושרים.
2. באמצעות סכין גילוח, בשני חתכים כ 3 מ"מ בנפרד במרכז קלטת ו בניצב לציר הארוך של השקופית. הסר את הסרט בין הקיצוצים לעשות ערוץ. טיפה של שמן Pipet Halocarbon 27 לתוך התעלה. ערוץ זה המקום שבו עוברים יהיה רכוב.

הערות:

• רק סנטימטר וחצי סקוטש דו צדדית הקלטת היא העובי הנכון כדי להכיל את העוברים.
• 27 שמן Halocarbon הוא חמצן חדיר, כך מאפשר חילופי חמצן, תוך מניעת התייבשות העובר. בשל מקדם השבירה שלה, 27 שמן Halocarbon היא גם אידיאלי עבור stagingהדמיה עוברים.

5. Dechorionate עוברים

1. כדי לאסוף עוברים dechorionate, מספיק לשפוך אקונומיקה 50% על צלחת אגר מיץ תפוחים לצלול באופן מלא את כל פני השטח. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, כגון גילוי Zeiss V8 עם האור המועבר, לצפות בעוברים כדי לשחרר מן סיסית שלהם. ברגע סיסית מרפה ומשחרר מתוך העוברים כמה (3-60 שניות), לשפוך אקונומיקה ועוברים לתוך מסננת התא.
2. לשטוף עוברים מסננת מיד ובמרץ עם מים מזוקקים מבקבוק להשפריץ. תמרחי מסננת על מגבות נייר. אם כל ורוד נתפסת על המגבת אחרי מספיגה, להמשיך לשטוף את העוברים עם מים.
3. השתמש מכחול לח להעביר 10-50 עוברים על צלחת נקייה מיץ תפוחים (עם משחה ללא שמרים). וויק ממנו מים עם קצה קרוע של מגבת נייר, ומיד לכסות את העוברים עם כמות קטנה של שמן Halocarbon 27.

הערות:

• אין להשתמש אקונומיקה מלבין. במקום זאת, השתמש המותג כגון אקונומיקה של אוסטין A-1 מסחרי, אשר
• יתר הלבנת או שטיפה לא מספקת תגרום עוברים רגשני עם cellularization סדיר.

6. שלב והר עוברים

1. באמצעות מיקרוסקופ לנתח עם האור המועבר, פעל בהתאם להנחיות המורפולוגי של ²⁰ Bownes לשלב עוברים על הצלחת. בעזרת מלקחיים, העברת 5 מחזור mitotic 11 או 12 עוברים, המתאים Bownes שלב 4, לערוץ של החדר גובר. סדר העוברים בקו, עם הצד הצדדים הגבי ו הגחון גלוי לרוחב למטה. עוברים מסודרים בקלות בכיוון הזה בשמן לבד. אל קהל העוברים יחד הם יוכלו לשלול שכניהם של חמצן פעם לחמוק לכסות מוחל להלן. (השאר כמחצית אורך העובר ביניהם).
2. הניחו קצה אחד של כיסוי 25x25 מ"מ להחליק על קלטת דו צדדית בצד אחד של הערוץ. זרוק את הפתק לכסות לכסות את הערוץ. אם האוויר נתפס מתחת, להחיל כמות קטנה של שמן Halocarbon 27 בקצה להחליק את המכסה. פעולה נימי ימשוך את השמן לתוך התעלה ולדחוף החוצה את האוויר.

הערות:

• עוד משאב מצוין עבור עוברי הזמני הוא: קמפוס, אורטגה, JA ו Hartenstein, V. (1985). ההתפתחות העוברית של תסיסנית melanogaster. Springer-Verlag, ברלין. בעוד ספר זה יוצא לאור כבר לא, עותקים בשימוש זמינים באופן קבוע על Amazon.com.
• השתמש תמיד שמן 27 Halocarbon במשורה. זה יהפוך את הרכבה קלה יותר. זה יהיה גם למנוע מקרי נוטף שמן על המטרה מיקרוסקופ הדמיה בשלבים הבאים.

7. תמונה לעוברים

1. איך להמשיך כאן תהיה כמובן להיות מוכתבת על ידי שינוי התא הצורה שאתה הדמיה, והשאלה שאתה פונה. עבור כל שינוי צורה, מקום קאמרית גובר על מיקרוסקופ או זקוף או הפוך, למצוא עוברי שלך על ידי האור המועבר, ולאחר מכן לעבור הדמיה confocal להתמקד באזור של עניין. ציית שיטות עבודה מומלצות עבור מיקרוסקופיה confocal, כגון אלה שנדונו בבית MicroscopyU של ניקון ( http://www.microscopyu.com/articles/confocal ). להיות קפדני במיוחד בחשיפת עוברים החיים שלך לשלטון כמו לייזר קטנה ככל האפשר, כדי למנוע photobleaching ו phototoxicity.
2. עבור cellularization, אנו התמונה על 710 מיקרוסקופ לייזר Zeiss סריקה confocal, באמצעות C-Apochromat 40x/1.2 אובייקטיבי W קור. מיקרוסקופ זה שוכנו בחדר בקרת טמפרטורה, עם טמפרטורות הנעות 18-20 ° C. בעוד בקרת טמפרטורה לא הכרחי, עדיף המיקרוסקופ ועושה הדמיה עקבית יותר. אנחנו בקביעות התמונה מטוס בודד, קרוב לאמצע של העובר, לעקוב אחר הממברנה הפלסמטית invaginations בחתך (איור 2). במשך פשוט הבאים הדינמיקה invagination, 30-60 במרווחים השנייה הם מספיק זמן לשגות הדמיה, ועוברים צריך לעמוד הדמיה עבור> 90 דקות ללא סימנים ברורים של מחסור בחמצן.
3. לאחר שרכשה את התמונות, הם יכולים להיות מנותח באמצעות מספר כלשהו של ניתוח תמונה חבילות, כולל freeware מן המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, המכונה ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij ). הנתונים אז יכול להיות כפי שהוצגו בסרטים (סרט 1), רצפים (איור 2), או kymographs ^21.

הערה:

• טבילה במים C-Apochromat 40x/1.2 אובייקטיבי W קור הוא מתאים היטב הדמיה ליד העובר באמצע קטע בגלל הצמצם הגבוה שלה, אשר מגביל סטיות הדמיה רקמות עמוק בדגימות מימית, ומעניק רזולוציה גבוהה אות ניאון גבוהה. בנוסף, מטרה זויש מרחק עבודה ארוך מאוד (220 מיקרומטר). עם זאת, אחרים מים או גליצרין מטרות טבילה יבצע היטב, במיוחד אם את צורת התא שינוי הריבית ניתן הדמיה קרוב לפני השטח העובר.

8. שיטה חלופית: הר עוברים עם "דבק העובר"

1. כדי לשנות את התדמית צורת התא מלבד cellularization, ייתכן שיהיה צורך לעגן עוברים בכיוון מסוים שלא נשמר בקלות בשמן לבד. כדי לעשות זאת, להשתמש בשיטת הרכבה חלופי לזה שתואר לעיל. התחל על ידי ביצוע "העובר דבק" על ידי שילוב של 20 ס"מ של סרט דו צדדית עם μL 250 של heptane ב בקבוקון הנצנץ. מניחים את הצנצנת על הנצנץ nutator או פלטפורמה מסתובבת, ומערבבים לילה.
2. טובלים קצה פיפטה צהוב לדבק את העובר, ולאחר מכן לעקוב אחר קצה לאורך שקופית, ומשאיר שובל של דבק. בעוד heptane הוא מתאדים, ליישר שלך מבוים עוברים בכיוון הנדרש על גוש של אגר. (יש לזכור כי השטח עובר להיות צילמו צריך להיות מול אגר. לדוגמה, כדי לשנות את צורת התא תמונה במהלך היווצרות תלם הגחון, הר עוברים עם הצד הגחון שלהם מול אגר).
3. הפוך את השקופית עם דבק, ולחץ בעדינות את השביל של דבק נגד העוברים על לחסום את אגר. עכשיו להפוך את השקופיות שוב. עוברים יהיה תקוע בכיוון המתאים. הוסף שתי שכבות של סרט דו צדדית בכל צד של העוברים, לכסות אותם עם שמן Halocarbon 27, ולהחיל coverslip. המשך הדמיה כמתואר לעיל.

9. נציג תוצאות:

אם העוברים הם בריאים הדמיה הוא אופטימלי, אז cellularization צריך לקחת 50-60 דקות, ואת invaginations הממברנה הפלסמטית צריך חדירת כמעט 40 מיקרון. עם זאת, אם הם עוברים מעל מולבן, חמצן מקופח או נפגע על ידי phototoxicity, אז invagination יהיה גם להאט או לעצור, במיוחד בתחום הדמיה. הידרדרות כזו של בריאות העובר לעתים קרובות תוצאות הפיתוח שהשתנו ולאחר כישלון לבקוע כמו זחלים. כך, בדיקה קפדנית לבריאות העובר assay לאחר הדמיה, לשמור על השקופיות בתא humidified ולצפות עבור הבקיעה למחרת.

באיור 1. זרימת מאוסף העובר על הדמיה. זרימת העבודה של פרוטוקול יכול להיות מחולקים לארבעה שלבים עיקריים. בשלב הראשון, כל ספקי לפרט מרכיבים מוכנים, ואז הזבובים כוס אוסף העובר, אגר מיץ תפוחים הצלחת ה-GFP הם ביחד כדי ליצור את סביבת העובר הנחת. בשלב השני, הביצים עוברים כי הם הניחו על צלחות אגר מיץ תפוחים נאספים. בשלב השלישי, עוברים יוסרו מן הצלחת, מבוים והועבר לחדר גובר. בשלב הרביעי, העוברים רכוב הם צילמו על מיקרוסקופ confocal.

איור 2. נתונים נציגת הדמיה זמן לשגות של cellularization. לעוברים מורכבים עם הגב (ד) ו הגחוני (V) הצדדים לעין, הם צילמו ליד באמצע שלהם לבצע את קרום invaginations פלזמה בחתך. העובר המוצג כאן מבטא GFP-שרירן-2 בדיקה ^6, אשר מתרכז בקצות invaginations הממברנה הפלסמטית. לכן, מעקב אחר ingression של חזית זו לאורך זמן נותן את הקצב שבו הממברנה הפלסמטית invaginates. נקודת הזמן 0:00 דקות מתאים תחילת cellularization. זמן קצר לאחר נקודת זמן 56:00 דקות, gastrulation מתחיל בצד הגחוני של העובר. בר הוא 40 מיקרון.

סרט 1. הסרט נציגת הדמיה זמן לשגות של cellularization. הסרט הזה מתאים באיור 2. כדי להקליט את כל התהליך של cellularization, החלה הדמיה במחזור mitotic לפני 13, לכידת תלם רגרסיה pseudocleavage, ונמשכה עד תנועות gastrulation נראו בצד הגחוני של העובר. תמונות שנאספו באחד המרווחים דקה. עוצמות הוגדלו שלאחר הרכישה כדי להקל לראות את תנועות gastrulation.
לחץ כאן לסרט

האירוע התפתחותית * עיתוי	צורת התא שינויים הקשורים	קישור מחלה או בריאות האדם	הפניות אחרונים עם הדמיה חיה
פסיאודו מחשוף תלם היווצרות (4, 90 דקות PF)	Cytokinesis	Polyploidy התקדמות סרטן 1	Mavrakis et al. 2009 8 קאו et al. 2010 9
Cellularization (5, PF 130 דקות)	Cytokinesis	Polyploidy התקדמות סרטן 1	קאו et al. 2008 10 Sokac & Wieschaus, 2008 11
תלם היווצרות הגחון; invagination והמזודרם (6, 180 דקות PF)	התכווצות Apical; אפיתל-mesenchymal המעבר	סרטן גרורות 2	פוקס Peifer, 2007 12 מרטין et al. 2009 13
Germband הארכה (7, PF 195 דקות)	מתכנס הארכה	צינור פגמים עצבית 3	Bertet et al. 2004 14 בלנקנשיפ et al. 2006 15
Tracheogenesis (11, 320 PF דקות)	היווצרות צינור אפיתל הסתעפות	אנגיוגנזה 4	Caussinus et al. 2008 16 Gervais & קזנובה, 2010 17
הגב סגירה (14, 620 דקות PF)	Apical התכווצות	ריפוי פצע 5	Gorfinkiel et al. 2009 18 סולון et al. 2009 19

טבלה 1. דוגמאות משנה את צורתו תא צילמו עוברי זבוב חי
* מספר הבמה Bownes הזמן שלאחר ההפריה (PF), כאשר כל אירוע מתחילה, מפורטים על פי קמפוס, אורטגה, 1985.

טוס מניות	תוויות	מקור התייחסות
Spider-GFP (95-1)	פלזמה קרום	מורין et al. 2001 22
Resille-GFP (117-2)	פלזמה קרום	מורין et al. 2001 22
GAP43-Venus	פלזמה קרום	Mavrakis et al. 2009 8
ספגטי סקווש-GFP (Sqh-GFP)	שרירן-2	Royou et al. 2002 6
E-cadherin-GFP (Ecad-GFP)	Cell-cell junctions	אודה et al. 2001 23
GFP-Moesin	F-אקטין	Kiehart et al. 2000 24
Utrophin-נוגה (ונוס Utro-)	F-אקטין	Sokac et al. התוצאות לא פורסם

טבלה 2. המניות שימושי לשינוי צורה הדמיה תא עוברי זבוב

Discussion

פרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר הדמיה לחיות, confocal של מספר שינויים בצורת התא בעובר המתפתח לעוף. מניות ה-GFP הדמיה יכול להיות מוכן על ידי מעבדה הפרט (טבלה 2), אך מניות רבות כאלה זמינים גם בפומבי ממרכזי כגון Bloomington תסיסנית במלאי מרכז באוניברסיטת אינדיאנה (

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
Cover slips 25x25	Fisher Scientific	1 2-524C
Squirt bottles (H2O)	Fisher Scientific	02-897-11
50 ml Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Bulbs for small pipets, 1 mL	Fisher Scientific	03-448-21
Scintillation vials with caps	VWR international	66021-533
Tri-Corn Beakers, 100 mL	Electron Microscopy Sciences	60970
BD Falcon Petri dish 60x15mm	Fisher Scientific	08757 100B
BD Falcon Cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Yellow pipet tips	Rainin	L200
Stainless steel mesh, 304, 12x24	Small Parts, Inc.	CX-0150-F-01
Glass 5¾ inch Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20B
P4 Filter paper	Fisher Scientific	09-803-6F
Rubber bands	Office Max	A620645
Scotch double-sided tape, ½ inch	Office Max	A8137DM-2
Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2	Jerry’s Artarama	56460
Dumont #5 Forceps High Precision Inox	Electron Microscopy Sciences	72701-DZ
Razor blades	VWR international	55411-050
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	H 8773
Heptane	Fisher Scientific	H360-1
BD Bacto Agar	VWR international	90000-760
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
p-Hydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	H5501
Red Star Active Dry Yeast	LeSaffre	15700
Paper towels, C-fold	Kleenex
Heavy duty aluminum foil	Reynolds Wrap
Bleach	Austin’s A-1 Commercial
100% Apple juice	Ocean Spray or Tree Top