Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

Резюме

Раннее развитие плодовой мушки, дрозофилы, характеризуется количеством клеточных изменения формы, которые хорошо подходят для работы с изображениями подходов. В данной статье описываются основные инструменты и методы, необходимые для живых конфокальной микроскопии эмбрионов дрозофилы, и сосредоточится на изменение формы клеток называется cellularization.

Аннотация

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)^1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.

The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility⁶, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores⁷. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.

Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)^8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques^9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

протокол

1. Соберите Кубка эмбрионов коллекции

1. Отрежьте нижнюю офф 100 мл Tri-кукурузы стакан с бритвой, делая края как можно более гладко. Чашки легче обращаться, если вы также отделка трех углах офф топ, хотя это не является абсолютно необходимым.
2. Отрежьте квадратный из проволочной сетки (6 см х 6 см). На подогретого плитке, внутри вытяжного шкафа, слой квадрата сетки в верхней части тяжелой алюминиевой фольги. Нажмите края вырезать дно чашки твердо на горячую сетку. Подождите несколько секунд, и поднять чашку с сеткой теперь прилагается. Если фольга также палки, только кожура его.
3. Прохладный чашки на ночь. Удалите излишки сетки с ножницами и песка от острых краев с мелкозернистой наждачной бумагой.

2. Сделать Яблока Плиты Сок Агар

1. В 6L колбу, объединить 100 г BD Бакто агар и 3 л дистиллированной воды. Автоклав агара в течение 30 минут на медленном настройка выхлопа.
2. В 2L колбе с мешалкой, объединить 100 г сахарозы, 1 л яблочного сока и 6 г р-гидроксибензойной кислоты. Тепло решение до кипения при помешивании на горячей плите. Не кипятите в течение более 2 минут. Разрешить смесь яблочного сока, чтобы охладиться, а затем добавить с мешалкой, чтобы агар. Смешайте полностью.
3. Разрешить комбинированное решение для охлаждения в 60 ° С водяной бане перед заливкой в ​​60x15 мм чашках Петри. Кроме того, перистальтического насоса могут быть использованы для обойтись агара. Разрешить пластины для охлаждения до комнатной температуры в течение не менее 4 часов. Стек в Rubbermaid контейнеров со слоем мокрой салфеткой и хранят при температуре 4 ° C.

Примечания:

• Осенью или зимой, это может быть необходимо добавить еще 100 мл воды в агар.
• Марки чашках Петри важно! Только BD Сокол блюда подходят Tri-кукурузы стаканы. Конкретные информации о заказе можно найти в таблице ниже материалы.

3. Добавить GFP летит в Кубках эмбрионов коллекции

1. Развернуть GFP запасов в соответствии с вашими потребностями коллекции, создав бутылки мух примерно за две недели до визуализации. Одна бутылка мухи, как правило, более чем достаточно, чтобы заполнить один эмбрион коллекции чашку с минимум 50 женщин и 30 мужчин. Для лучшей укладки, мухи должны быть вновь eclosed (то есть меньше чем за 5 дней после вылупления).
2. Сделать дрожжей пасты, заполнив небольшую чашку с примерно равными частями Красной Звезды активных сухих дрожжей и дистиллированной воды, и движение, пока дрожжи не растворится. Паста должна приблизительный согласованность мокрой арахисового масла. Более дрожжей или воды могут быть добавлены для изменения консистенции. Дрожжи пасты могут быть использованы в течение нескольких дней, и должны быть сохранены, накрытый, при 4 ° C.
3. Как только дрожжи паста готова, снимите пластины яблочный сок от 4 ° C хранения. Подряд яблочного сока пластин с дрожжами пасты, и дать им прогреться до 22-25 ° С, что будет способствовать откладки яиц.
4. Сложите круговой фильтровальной бумаги в два раза, то в полтора раза. Обрезать до 8-9 см в диаметре, и сделать аккордеон складки в четверть круга. Открываются круг, инвертировать, и вставить его в коллекцию чашку до касания сетки. Убедитесь, что бумага является безопасным в чашку так, чтобы он не упал и сокрушить мух. Фильтровальная бумага не является обязательным, но предоставляет благоприятные условия для спаривания, и поддерживает влажность в чашке.
5. Этикетка чашку с названием акции и дату. Передача мух от бутылки для сбора пены, осторожно встряхивая бутылку перевернутой чашки, крышки и сразу же чашку с подготовленный фундамент яблочного сока. Закрепите пластину чашку с резинкой. Установите чашки сетку стороной вверх в районе с прямой свет. Убедитесь в том, что ни тени падают на чашку, как мухи не трону, а в темное время суток.
6. Изменение пластины яблочный сок по мере необходимости. Двухчасовая коллекций, при комнатной температуре, хорошо работают для визуализации cellularization.

4. Подготовка Монтаж палаты

1. Для подготовки установки камеры для эмбрионов, вырезать кусок двухсторонней ленты 2-3 см длиной и поместить его на слайд, выравнивая длинной оси ленты и слайдов. Отрежьте второй 2-3 см длиной кусок двухсторонней ленты и слой его поверх другой кусок ленты, убедившись, что их края выровнены.
2. Использование лезвие бритвы, делают два разреза примерно на 3 мм друг от друга в центре ленты и перпендикулярно длинной оси слайда. Удалите ленту между разрезами, чтобы сделать канал. Внесите каплю Хладон 27 Масло в канал. Этот канал, где эмбрионы будут смонтированы.

Примечания:

• Только скотч ½ дюйма двусторонней ленты толщиной право для размещения эмбрионов.
• Хладон 27 Масло кислорода проницаемой, и так позволяет кислородный обмен, предотвращая обезвоживание эмбрионов. Из-за его преломления, хладон 27 Масло также идеально подходит для постановкии изображения эмбрионов.

5. Dechorionate Эмбрионы

1. Для сбора и dechorionate эмбрионов, залить достаточно 50% отбеливателя на агар яблочный сок пластины, чтобы полностью погрузиться всей поверхности. Использование рассекает микроскоп, такие как Zeiss Discovery V8 в проходящем свете, следите за эмбрионы для освобождения от хориона. Как только хориона разрыхляет и освобождает от нескольких эмбрионов (30-60 секунд), залить отбеливателем и эмбрионов в ячейку фильтра.
2. Вымойте эмбрионов в фильтр немедленно и энергично с дистиллированной водой из шприца бутылку. Dab фильтр на бумажных полотенцах. Если какой-либо розовые видно на полотенце после вытирая, продолжают мытье эмбрионов с водой.
3. Используйте влажную кисть для передачи 10-50 эмбрионов чистый яблочный сок пластиной (без дрожжей вставить). Вика от воды с разорванной края бумажным полотенцем и сразу же покрытие эмбрионов с небольшим количеством Хладон 27 Нефть.

Примечания:

• Не используйте отбеливатель Clorox. Вместо этого используйте бренда, такие как A-1 Остина Коммерческая Bleach, которая <6% гипохлорита натрия.
• Чрезмерное отбеливание или недостаточное полоскание приведет к мягким эмбрионов с нерегулярными cellularization.

6. Этап и горы Эмбрионы

1. Использование рассекает микроскопом в проходящем свете, следуйте морфологического направления Bownes ²⁰ до стадии эмбриона на тарелку. Использование щипцов, передача 5 митотического цикла 11 или 12 эмбрионов, соответствующие Bownes 4-й стадии, на канале монтажа камеры. Упорядочить эмбрионов в линию, с дорсальной и вентральной сторон видимой и боковой стороной вниз. Эмбрионы легко организовать в этой ориентации на нефть в одиночку. Не толпы эмбрионы вместе, как они будут лишать своих соседей кислорода раз покровное стекло наносят ниже. (Оставить примерно половина эмбрионов длиной между ними).
2. Положите один край крышки 25x25 мм поскользнуться на двухсторонней ленты на одной стороне канала. Оставьте покрытие скольжения для покрытия канала. Если воздух под поймали, нанесите небольшое количество Хладон 27 Нефть на краю крышки скольжения. Капиллярное действие будет тянуть масла в канал и вытолкнуть воздух.

Примечания:

• Другим отличным ресурсом для постановки эмбрионов заключается в следующем: Кампос-Ортеги, JA и Хартенштайн, В. (1985). Эмбриональное развитие дрозофилы. Springer-Verlag, Berlin. Хотя эта книга больше не опубликованы, используемых копий регулярно доступна на Amazon.com.
• Всегда используйте Хладон 27 Масло экономно. Это позволит сделать монтаж проще. Это также поможет избежать случайных просачивание нефти на микрообъектив в следующих шагах обработки изображений.

7. Изображение Эмбрионы

1. Как вы продолжите здесь, конечно, будет продиктовано изменением формы клеток, что вы с изображениями, и вопрос, который вы обращаетесь. Для любого изменения формы, разместить монтаже камеры на любой прямой или инвертированный микроскоп, найти своего эмбрионов в проходящем свете, а затем переключиться на конфокальной микроскопии, чтобы сосредоточиться на интересующей нас области. Придерживаться наилучшей практики для конфокальной микроскопии, таких, как те, которые обсуждались на MicroscopyU Никона ( http://www.microscopyu.com/articles/confocal ). Будьте особенно строгим в разоблачении вашей жизни эмбрионов до всего лишь мощность лазера насколько это возможно, чтобы предотвратить фотообесцвечивания и фототоксичности.
2. Для cellularization, мы изображение на 710 Zeiss лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, используя C-Apochromat 40x/1.2 W Corr цели. Этот микроскоп расположен в контролируемой температурой комнаты, с температурой от 18-20 ° С. Хотя контроль температуры не является абсолютно необходимым, то лучше для микроскопа и делает изображение более последовательными. Мы регулярно изображение в одной плоскости, около середины эмбриона, следовать впячивания плазматической мембраны в поперечном сечении (рис. 2). Для просто следуют динамике инвагинации, 30-60 секундными интервалами являются достаточными для покадровой обработки изображений, и эмбрионы должны выдерживать визуализации для> 90 минут без каких-либо явных признаков недостатка кислорода.
3. После получения изображения, они могут быть проанализированы с использованием любого количества пакетов для анализа изображений, в том числе бесплатных от Национального института здоровья, называемый ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij ). Затем данные могут быть представлены в виде фильмов (Movie 1), последовательности (рис. 2), или kymographs ^21.

Примечание:

• Погружения в воду С-Apochromat 40x/1.2 W Corr цели хорошо подходит для работы с изображениями возле эмбриона средней части из-за его высокой светосилой, что ограничивает аберраций для глубоких изображений тканей в водных образцов, и дает высокое разрешение и высокая флуоресцентный сигнал. Кроме того, эта цельимеет очень большое рабочее расстояние (220 мкм). Однако другие погружением в воду или глицерин цели будет хорошо, особенно если изменение формы клеток интересов могут быть отображены рядом эмбриона поверхности.

8. Альтернативный метод: Гора Эмбрионы с "эмбрион-клей"

1. Чтобы создать образ, изменение формы клеток, кроме cellularization, это может быть необходимо смонтировать эмбрионов в определенной ориентации, которые не легко поддерживать на нефть в одиночку. Для этого, используйте альтернативный метод монтажа на описанную ранее. Начните с создания "эмбрион-клей", объединив 20 см двухсторонней ленты с 250 мкл гептана в сцинтилляционный флакон. Место сцинтилляционный флакон на nutator или вращающейся платформе, и соединение в одночасье.
2. Dip желтый наконечник пипетки в эмбрион клей, а затем проследить за кончик по слайду, оставляя следы клея. В то время как гептан испаряется, выровнять поставил эмбрионов в требуемом положении на блоке агар. (Помните, что эмбрион поверхности для включения в образ должен быть обращен агара. Например, для изображения формы клеток изменяются в процессе образования вентральной борозды, смонтировать эмбрионов с вентральной стороне, обращенной агара.)
3. Обратить слайд с клеем, и слегка нажмите следы клея от эмбрионов на агар блока. Теперь инвертируйте слайд снова. Эмбрионы будут застрял в соответствующей ориентации. Добавить два слоя двухсторонней ленты по обе стороны от эмбрионов, покройте их Хладон 27 Нефть и применять покровное. Приступить к визуализации, как описано выше.

9. Представитель Результаты:

Если эмбрионы были здоровыми и изображений является оптимальным, то cellularization должны 50-60 минут, и впячивания плазматической мембраны должны попадание почти 40 микрон. Однако, если эмбрионы более отбеленной, кислорода лишен или повреждены фототоксичности, то инвагинации либо замедлить или остановить, особенно в отображаемой области. Такое ухудшение здоровья эмбриона часто приводит к развитию изменен, и неспособность люк, как личинки. Таким образом, для строгий тест для анализа здоровья эмбриона после съемки, сохранить слайды в увлажненной камере и наблюдать за штриховкой на следующий день.

Рисунок 1. Workflow из эмбриона коллекцию изображений. Документооборота протокол может быть разбита на четыре основных этапа. В первой фазе все отдельные материалы и компоненты готовы, а затем чашку эмбриона сбора, яблочный сок пластины агара и GFP мух положить вместе, чтобы создать эмбрион прокладке окружающей среды. На втором этапе, яйца и эмбрионы, которые заложены на пластинках агара яблочный сок собирают. На третьем этапе, эмбрионы снимают с пластинки, постановка и переданы в монтаже камеры. На четвертом этапе, установленный эмбрионы отображается на конфокальной микроскопии.

Рисунок 2. Представитель данные из замедленная съемка cellularization. Эмбрионы с установленными на спинной (D) и вентральной (V) стороны хорошо видно, и в образ будут включены около их среднего следовать впячивания плазматической мембраны в поперечном сечении. Эмбриона показано здесь выражает GFP-миозина-2 датчика ^6, который концентрируется на концах впячивания плазматической мембраны. Таким образом, отслеживая проникновению этого фронта в течение долгого времени дает скорость, с которой плазматической мембраны впячивается. 0:00 минутный точка соответствует cellularization начала. Вскоре после 56:00 момент времени минуте, гаструляции начинается на брюшной стороне зародыша. Бар находится в 40 микрон.

Фильм 1. Представитель фильма с покадровой визуализации cellularization. Этот фильм соответствует Рисунок 2. Чтобы записать весь процесс cellularization, работы с изображениями начали в предыдущем цикле митотические 13, захватив регрессии pseudocleavage борозду, и продолжалась до гаструляции движения были замечены на брюшной стороне зародыша. Изображения были собраны интервалом в одну минуту. Интенсивности были увеличены после приобретения, чтобы сделать его легче увидеть гаструляции движений.
Щелкните здесь для кино

Развития событий и времени *	Сотовые формы изменений, связанных с	Ссылаются на болезни или здоровья человека	Последние ссылки с живыми изображениями
Псевдо-расщепления борозды образование (4; 90 минут PF)	Цитокинез	Полиплоидия и прогрессии рака 1	Мавракис и соавт., 2009 8 Цао и соавт., 2010 9
Cellularization (5, 130 минут в ПФ)	Цитокинез	Полиплоидия и прогрессии рака 1	Цао и соавт., 2008 10 Sokac & Wieschaus, 2008 11
Брюшной формирование борозды; мезодермы инвагинации (6, 180 минут в ПФ)	Апикального сужения; эпителиально-мезенхимальных перехода	Рак метастазы 2	Fox & Peifer, 2007 12 Мартин и соавт., 2009 13
Germband расширение (7; 195 минут в ПФ)	Конвергентная расширение	Дефекты нервной трубки 3	Bertet и соавт., 2004 14 Бланкеншип и соавт., 2006 15
Tracheogenesis (11; 320 минут в ПФ)	Эпителиальные формирование трубки и ветвление	Ангиогенез 4	Caussinus и соавт., 2008 16 Жерве и Казанова, 2010 17
Спинной закрытия (14; 620 минут в ПФ)	Апикального сужения	Заживление ран 5	Gorfinkiel и соавт., 2009 18 Солон и соавт., 2009 19

Таблица 1. Примеры изменения формы клеток отображаемого в живых эмбрионов летать
* Количество Bownes сцене и время после оплодотворения (р), когда каждое событие запускается, перечислены в соответствии с Кампос-Ортеги, 1985.

Fly акции	Этикетки	Ссылка на первоисточник
Spider-GFP (95-1)	Плазменная мембрана	Морин и соавт., 2001 22
Resille-GFP (117-2)	Плазменная мембрана	Морин и соавт., 2001 22
GAP43-Венера	Плазменная мембрана	Мавракис и соавт., 2009 8
Спагетти Сквош-GFP (Sqh-GFP)	Миозина-2	Royou и соавт., 2002 6
E-кадгерина-GFP (ECAD-GFP)	Межклеточных контактов	Ода и соавт., 2001 23
GFP-Moesin	F-актин	Kiehart и соавт., 2000 24
Атрофин-Венера (Утро-Венера)	F-актин	Sokac и соавт., Неопубликованные результаты

Таблица 2. Полезное запасов для работы с изображениями формы клеток изменение летать эмбрионов

Обсуждение

Протокол, описанный здесь позволю жить, конфокальной микроскопии ряда изменений формы клеток в развивающемся эмбрионе летать. GFP запасов для работы с изображениями могут быть получены отдельные лаборатории (табл. 2), но многие из таких запасов также публично доступных из центров, таких ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
Cover slips 25x25	Fisher Scientific	1 2-524C
Squirt bottles (H2O)	Fisher Scientific	02-897-11
50 ml Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Bulbs for small pipets, 1 mL	Fisher Scientific	03-448-21
Scintillation vials with caps	VWR international	66021-533
Tri-Corn Beakers, 100 mL	Electron Microscopy Sciences	60970
BD Falcon Petri dish 60x15mm	Fisher Scientific	08757 100B
BD Falcon Cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Yellow pipet tips	Rainin	L200
Stainless steel mesh, 304, 12x24	Small Parts, Inc.	CX-0150-F-01
Glass 5¾ inch Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20B
P4 Filter paper	Fisher Scientific	09-803-6F
Rubber bands	Office Max	A620645
Scotch double-sided tape, ½ inch	Office Max	A8137DM-2
Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2	Jerry’s Artarama	56460
Dumont #5 Forceps High Precision Inox	Electron Microscopy Sciences	72701-DZ
Razor blades	VWR international	55411-050
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	H 8773
Heptane	Fisher Scientific	H360-1
BD Bacto Agar	VWR international	90000-760
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
p-Hydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	H5501
Red Star Active Dry Yeast	LeSaffre	15700
Paper towels, C-fold	Kleenex
Heavy duty aluminum foil	Reynolds Wrap
Bleach	Austin’s A-1 Commercial
100% Apple juice	Ocean Spray or Tree Top