Microfluidic מבוססי הידרודינמית מלכודת חלקיקים יחיד

Summary

במאמר זה, אנו מציגים שיטה microfluidic מבוסס על הכליאה החלקיקים מבוסס על זרימה הידרודינמית. אנו מדגימים לכידה חלקיק יציב בנקודה נוזל הקיפאון באמצעות מנגנון בקרה ומשוב, ובכך מאפשרים כליאה ו המיקרומניפולציה של חלקיקים שרירותי microdevice משולבת.

Abstract

היכולת להגביל ולטפל חלקיקים יחיד פתרון חופשית היא טכנולוגיה המאפשרת מפתח עבור המדע הבסיסי והיישומי. שיטות לכידה של חלקיקים המבוססת על טכניקות אופטי, מגנטי, electrokinetic, ואקוסטי הובילו התקדמות מרכזי פיזיקה וביולוגיה מולקולרית החל ברמה התאית. במאמר זה, אנו מציגים שיטה חדשה microfluidic מבוסס על השמנה החלקיקים מניפולציה מבוססת אך ורק על זרימת הנוזל הידרודינמית. באמצעות שיטה זו, אנו מדגימים לכידה של חלקיקים מיקרו בקנה מידה ננו תמיסות מימיות של קשקשים זמן רב. מלכודת הידרודינמית מורכב מכשיר microfluidic משולב עם גאומטריה צולבות חריץ ערוץ שבו שני זרמים מנוגדים להתכנס למינרית, ובכך לייצר זרימת extensional מישוריים עם נקודת קיפאון נוזל (מהירות אפס נקודה). במכשיר זה, חלקיקים כלואים במרכז מלכודת בשלט פעיל של שדה הזרימה לשמור על המיקום החלקיק בנקודת קיפאון הנוזל. באופן זה, חלקיקים לכודים ביעילות פתרון חינם באמצעות בקרת משוב האלגוריתם מיושם עם קוד LabVIEW שהותקן. אלגוריתם הבקרה כוללת רכישת התמונה חלקיק במכשיר microfluidic, ואחריו מעקב החלקיקים, קביעת מיקום החלקיקים centroid, והתאמת הפעילות של זרימת הנוזל על ידי ויסות הלחץ המופעל על שבב שסתום פנאומטי באמצעות ווסת לחץ. בדרך זו, על שבב דינמי שסתום פונקציות מדידה להסדיר את ספיקות יחסית ערוצי לשקע, ובכך לאפשר קנס בהיקף של משרה מלאה קיפאון נקודת לכידה החלקיקים. מלכודת microfluidic מבוססי הידרודינמית מוצגים מספר יתרונות כשיטה השמנה החלקיקים. השמנה הידרודינמית אפשרי עבור כל חלקיק שרירותי ללא דרישות ספציפיות על המאפיינים פיזי או כימי של האובייקט לכודים. בנוסף, השמנה הידרודינמית מאפשרת הכליאה של אובייקט "יחיד" היעד השעיות חלקיק מרוכז או צפוף, וזה קשה באמצעות כוח חלופי בתחום מבוססי שיטות לכידה. מלכודת הידרודינמית הוא ידידותי למשתמש, פשוט ליישם ניתן להוסיף מכשירים microfluidic הקיימים כדי להקל על ניתוח השמנה זמן רב של חלקיקים. בסך הכל, מלכודת הידרודינמית היא פלטפורמה חדשה הכליאה, המיקרומניפולציה, ותצפית של חלקיקי ללא immobilization השטח מבטלת את הצורך שדות אופטיים, מגנטיים, חשמליים perturbative פוטנציאל השמנה פתרון חופשי של חלקיקים קטנים.

Protocol

מלכודת הידרודינמית מורכב מכשיר דו שכבתי (polydimethylsiloxane (PDMS) / זכוכית) היברידית microfluidic עבור הכליאה החלקיקים. שלבים 1-2 מתארים ייצור של מכשירים microfluidic, ואת הצעדים 3-4 עיצוב לדון המכשיר המבצע.

1. SU-8 ייצור עובש (לא מוצג וידאו)

1. נקה two פרוסות סיליקון (3 "קוטר) עם אצטון איזופרופיל אלכוהול (IPA).
2. ופלים יבש עם N ₂ ולמקם אותם על פלטה חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך דקה 1 להסיר לחות שיורית.
3. ספין רקיק מעיל # 1 עם photoresist SU 8-2050 (PR) במשך 30 שניות בסל"ד 4000 כדי ליצור עובש ~ 40 מיקרומטר עבה של שכבת fluidic. ספין רקיק מעיל # 2 עם יחסי ציבור במשך 30 שניות בסל"ד 1500 כדי ליצור עובש עבה ~ 150 מיקרומטר עבור שכבת שליטה.
4. Soft רקיק לאפות מס '1 של 65 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. Soft רקיק לאפות # 2 ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
5. כדי לחשוף ופלים UV עם מסכות שלהם (רקיק # 1: יציאות וערוצי fluidic, רקיק # 2: יציאת שכבת שליטה) ואת עוצמת החשיפה המתאימה (~ 150 mJ / ² ס"מ, ~ 260 mJ / ² ס"מ בהתאמה).
6. הודעה רקיק לאפות מס '1 של 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. הודעה # 2 פרוסות לאפות ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
7. פיתוח ופלים עם פרופילן גליקול אצטט אתר מתיל (PGMEA) עד דפוקה יחסי ציבור מוסר. לשטוף ופלים עם IPA ויבש עם N _2.

2. המכשיר microfluidic ייצור

1. Silanize את פני השטח של SU-8 תבניות ידי הנחת פרוסות על ייבוש תחת ואקום עבור 10 דקות ~ עם צלחת זכוכית ובה כמה טיפות של trichlorosilane. Silanization משטח מסייע קילוף (PDMS) העתקים מן SU-8 תבניות.
2. מערבבים דגה PDMS בבסיס: crosslinker יחס של 15:01 ו - 05:01 עבור fluidic שכבות לשלוט בהתאמה.
3. ספין מעיל את התערובת 15:01 PDMS על התבנית שכבה fluidic (רקיק # 1) למשך 30 שניות בסל"ד 750 ולאחר מכן למקם את פרוסות לתוך צלחת פטרי. מניחים את התבנית בשכבה מלאה לתוך צלחת פטרי ויוצקים 05:01 PDMS התערובת על התבנית בעובי של 4 מ"מ ~.
4. ופלים אופים / PDMS למשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס באופן חלקי לרפא את שכבות PDMS.
5. לאחר הרגעות ופלים / PDMS לטמפרטורת החדר, לחתוך את העתק PDMS, אשר יהוו את השכבה מלאה (רקיק # 2), מתוך צלחת פטרי עם אזמל לקלף אותו עובש SU-8. ניקוב חורים יציאת גישה microchannel כי תפעל כשסתום על שבב הממברנה עם מחט מד 21.
6. מניחים את העתק PDMS עם שכבת שליטה על גבי פרוסות סיליקון # 1 (שבו יש את הספין מצופה שכבת PDMS fluidic). בזהירות ליישר לאטום את שכבת שליטה שכבת fluidic באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. הקפד להסיר את כל כיסי אוויר בין השכבות ואופים בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לרפא לחלוטין בשתי שכבות. זה צעד אפיה תגרום גוש מונוליטי PDMS עם שתי שכבות.
7. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, לחתוך הקליפה העתק PDMS המכיל הן את השליטה שכבות fluidic את עובש SU-8 באמצעות אזמל. הסר PDMS עודף נפרד כל יחידה מכשיר בסכין גילוח. ניקוב חורים יציאות גישה microchannels בשכבת fluidic עם מחט מד 21.
8. בונד לוח PDMS coverslip כדי לקבל מכשיר שלם. ראשית, לנקות coverslip (לא: 1.5, 24 x 45 מ"מ) עם אצטון IPA. לאחר מכן, לטפל גם coverslip ואת העתק משטחים PDMS עם פלזמה חמצן תחת mTorr 500 למשך 30 שניות, ומיד להביא את שני משטחים במגע להקים חותם בלתי הפיך.
9. אופים את התקנים בין לילה כדי להגדיל את מליטה בין שכבות PDMS ואת coverslip.

שלבים 3-4 מתארים יישום מלכודת הידרודינמית באמצעות מכשיר microfluidic שתוארו לעיל.

3. מלכודת ההתקנה הידרודינמית ניסויית

1. מניחים את המכשיר microfluidic לבמה של מיקרוסקופ הפוכה לאבטח אותו עם קליפים הבמה.
2. למלא שני גז הדוק מזרקים בנפרד עם תמיסות בופר מדגם ומניחים אותם על משאבת מזרק Apparatus הרווארד (PHD 2000 לתכנות). המאגר ואת הפתרונות מדגם מועברים למכשיר דרך microfluidic 1 מ"ל ומזרק 250 μl, בהתאמה. בדרך כלל, 50 מ"מ טריס / טריס פתרון HCl חיץ (pH 8.0) המכיל 0.02% v / v טריטון X-100 משמש כפתרון חיץ. הפתרון מורכב מדגם של השעיה חלקיק (למשל חרוזי פוליסטירן ניאון) בפתרון חיץ.
3. להקים את חיבורי fluidic בין מזרקים (מתן הדגימה החיץ) ואת המכשיר microfluidic. חבר את המזרקים על 1 / 16 בקוטר "קוטר חיצוני (OD) x 0.020" הפנימי (ID) perfluoroalkoxy (PFA) באמצעות צינורות luer נעילת מתאמי. חבר את הקצה השני של הצינור PFA ליציאות מפרצון של המכשיר microfluidic עם מטא 24 מדאני צינור. T-השסתום ניתן למקם בין המזרק מדגם הנמל מדגם במכשיר microfluidic לשלוט אספקה ​​מדגם.
4. להקים את חיבורי fluidic עבור ערוצי לשקע במכשיר microfluidic. חבר את שני ערוצי מוצא אל צינורות PFA (1 / 16 "x 0.020 OD" ID) באמצעות 24 צינורות מתכת מד. צינורות PFA עבור שקעים צריכים להיות שווים באורכם. גם לצלול לתוך צינור מוצא צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל מלאים פתרון חיץ, המשמש כדי לשמור על ירידה בלחץ מתמיד בין מזרקים ערוצי לשקע.
5. מלאו את שסתום על שבב עם שמן נשא fluorinated באמצעות 3 מ"ל luer נעילת מזרק פלסטיק כדי למנוע דליפת אוויר אל תוך שכבת fluidic במהלך המבצע. האוויר בחדר השסתום נדחף דרך הממברנה PDMS לתוך microchannel בשכבת fluidic והוסרו מאוחר יותר מהמכשיר עם זרימת הנוזל דרך יציאות לשקע.
6. חיבור גז בלחץ אינרטי (חנקן) לספק לנמל בשכבה מלאה לתפעול על שבב שסתום. לשם כך, אנו משתמשים מיכל חנקן (2,200 psi) וכן וסת לחץ אלקטרוניים לספק 0-30 psi עד שסתום על שבב בתוך המכשיר microfluidic. הטנק חנקן מחובר וסת הלחץ באמצעות ¼ "OD x 0.170" צינורות מזהה. וסת הלחץ הוא מחובר למכשיר דרך microfluidic 1 / 16 "x 0.020 OD" צינורות PFA מזהה עם צינורות 24 מד המתכת בתחנה הסופית שלו.
7. יש לשטוף את חיבורי fluidic ואת מכשיר microfluidic עם 0.5 מ"ל של תמיסת חיץ על מנת להבטיח כי כל בועות האוויר מוסרים מהמערכת כולל ערוצי לשקע. תזרים שיעורי אופיינית המשמש סליקה מגוון בועות בין μL 2000-5000 / hr. אחרי בועות האוויר ושטפה של ערוצי microfluidic, להפחית את שיעור זרימת μL 50-100 / hr, שהוא אופייני נפח זרימת שיעור ההשמנה החלקיקים.
8. בשלב זה, החיבורים fluidic מבוססים, המדגם ואת הפתרונות חיץ מועברים למכשיר microfluidic בקצב זרימה קבועה (5-10 μL / שעה), ואת המכשיר מוכן השמנה הידרודינמית.

4. השמנה הידרודינמית נוהל

1. הפעל את קוד שהותקן LabVIEW, אשר ממכן השמנה החלקיקים (ראה באור שימוש עבור LabVIEW הקוד להלן).
2. באמצעות מיקרוסקופ xy תרגום הבמה, מיקום באזור השמנה (cross-חריץ) במרכז להציג את המצלמה. מביאים את השמנת לתוך אזור הפוקוס של העדשה המטרה ולהתאים את הגדרות המצלמה כדי לייעל את התנאים הדמיה.
3. בחר אזור מלבני של עניין (ROI) בתוך שדה של המצלמה של נוף כזה שמרכז את ההחזר על ההשקעה יהיה המיקום של מרכז מלכודת.
4. לאתחל את הלחץ לקזז להחיל שסתום על השבב. באחד הערוצים לשקע, התכווצות 100-200 מיקרומטר רחב הוא הציג לספק לקזז עבור שסתום הלחץ על השבב. הלחץ המתמיד קיזוז מאפשרת שסתום על שבב כדי להתאים את נקודת הקיפאון עמדה בקרבת מרכז של ערוץ צולבות חריץ. ברוב הניסויים, הלחץ לקזז מוגדר בין 0-12 psi בהתאם לממדי ערוץ (גובה ורוחב), רוחב התכווצות, לבין המפרט של שסתום על שבב (גודל השסתום, עובי הקרום, וכו ').
5. ליזום את בקר משוב ולהתאים את הרווח היחסי כדי לייעל את התגובה מלכודת. בקר משוב יהיה להתאים את הלחץ המופעל על השסתום על השבב, על מנת להזיז את נקודת הקיפאון עמדה, אשר ממזער את השגיאה או את המרחק בין מיקום החלקיקים לבין נקודת להגדיר (מרכז מלכודת). בהתאם לשיעור הזרימה ואת המיקום על שבב שסתום, קיים ערך אופטימלי לזכות מידתית, אשר מגדילה את יציבות ומונע תנודות מלכודת חלקיקים לא רצויים.
6. מלכודת חלקיקים. קוד LabVIEW באופן אוטומטי מלכודת אחד החלקיקים נכנסים לאזור השמנה. לאחר חלקיק הרצוי הוא לכוד, אפשר לכבות את זרימת מדגם ולבודד את חלקיק לכוד פתרון חיץ, אם תרצה בכך.
7. צג החלקיקים הלכודים ולשמור על המיקוד החלקיקים בתוך המטוס התמונה באמצעות פוקוס ידני או אוטומטי ההתקנה מיקרוסקופ להתמקד. זה עשוי להיות נחוץ כדי להתאים את מעט לזכות ביחס של הבקר משוב על מנת להבטיח יציבות מלכודת במהלך אירוע בקנה מידה זמן ארוך השמנה (דקות עד שעות).

קוד LabVIEW: שימוש הערה עבור בקר משוב

השמנה החלקיקים אוטומטי מושגת באמצעות משוב ליניארי אלגוריתם בקרה מיושם באמצעות קוד מותאם אישית LabVIEW. קוד LabVIEW לוכדת תמונות ממצלמה CCD ומעביר פוטנציאל חשמלי (מתח) אל וסת הלחץ, אשר פעיל מודולציה את המיקום (מדינה פתוחה חלקית / סגור) של השסתום על שבב פנאומטי דינמי. כאשר עמדה שסתום משתנה, קצב הזרימה הידרודינמית בשורה אחת אני מוצאזה מותאם, ובכך מיצוב מחדש את נקודת קיפאון ולאפשר השמנה הידרודינמית. השלבים לולאת משוב הם ברצף והוצא להורג iteratively בשיעור של לכידת תמונה (10-60 הרץ). קוד LabVIEW מבצעת את הפעולות הבאות במהלך כל מחזור לולאת המשוב:

• . ללכוד תמונה נרכש עבור חלקיק "יעד" באזור לכידה של המכשיר microfluidic באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם עדשה אובייקטיבי 10x (NA: 0.4) ומצלמת CCD.
• מעקב אחר החלקיקים. החלקיקים עמדת centroid נקבע, ואת אלגוריתם מעקב החלקיקים היא יזמה. הם חלקיקים נקודתיים על ידי התאמת עוצמת פליטת פרופיל של החלקיקים לתפקד נקודת התפשטות (כוחות הביטחון הפלסטינים), שממנו עמדה centroid נקבע.
• בתחום בקרת זרימה. הלחץ מעודכן מיועד שסתום על שבב הדינמי מחושב באמצעות אלגוריתם בקרה משוב עם בקר פרופורציונלי. בדרך זו, את הפעולה של שסתום הוא מחדש מקם את נקודת הקיפאון, אשר מפעיל כוח על חלקיק הידרודינמית, על מנת לנווט את החלקיקים לכיוון מרכז מלכודת.

קוד LabVIEW רשומות את הנתונים הבאים עבור כל תמונה שנתפסו במהלך החלקיקים השמנה: 1) הזמן שחלף, 2) centroid (x, y) מקומו של חלקיק הלכוד, 3) המיקום של מרכז מלכודת, 4) המרחק של החלקיקים מן לחץ מלכודת מרכז, 5) להחיל שסתום על השבב. בנוסף, הקוד גם רשומות סרט של החלקיקים הלכודים פורמט קובץ AVI.

5. נציג תוצאות

אנחנו לכודים חרוזי פוליסטירן פלורסנט בגדלים שונים (100, 540, 830 ננומטר, בקוטר 2.2 מיקרומטר) באמצעות מלכודת הידרודינמית. איור 1 (א) מראה תמונה של חלקיק לכודים בצומת צולבות חריץ במכשיר microfluidic. מסלולו של חלקיק לכוד ניתן לקבוע ישירות את הנתונים עמדה centroid נרשמו על ידי קוד LabVIEW במהלך אירוע השמנה או על ידי מעקב לאיתור חלקיקים לכודים מתוך קובץ הסרט מוקלט. איור 1 (ב) מראה את מסלולו של חלקיק לכוד (2.2 מיקרומטר פוליסטירן חרוז ניאון) יחד לכיוון ערוץ לשקע. חרוז הוא לכוד בתחילה (ריבועים) במשך 3 דקות, והוא שוחרר לאחר מכן ממלכודת ובורח לאורך אחד הערוצים לשקע (עיגולים). מסלולי החלקיקים לאורך ציר הזרימה compressional (כיוון ערוץ כניסת; מידע לא מוצג) דומים מסלולי החלקיקים לאורך ציר הזרימה extensional (כיוון יצוא) כפי שמוצג באיור 1 (ב). היסטוגרמה של עקירה החלקיקים ממרכז מלכודת חרוז לכוד (בקוטר 2.2 מיקרומטר) לאורך כיוונים ערוץ לשקע מוצג באיור 1 (ג). שימוש בשלט משוב האלגוריתם המתואר בעבודה זו, חלקיקים לכודים כלואים בתוך ± 1 מיקרומטר המרכז מלכודת יחד כניסת ערוץ כיוונים לשקע.

סכמטי של המכשיר microfluidic להשתמש בהם ללכידה הידרודינמית מוצג באיור 2. המכשיר microfluidic משולב מורכב fluidic שכבה ושכבה מלאה הוא מפוברק באמצעות תקן ליתוגרפיה רך multilayer כמתואר במאמר זה. שכבת fluidic מכיל את המאגר ואת מדגם ערוצים, כמו גם את הגיאומטריה חוצה ערוץ חריץ כדי להקל על השמנה הידרודינמית. שכבת בקרת מורכב שסתום פנאומטי ממוצבת מעל אחד הערוצים לשקע בשכבת fluidic, ואת השליטה שכבות fluidic מופרדים באמצעות קרום דק אלסטומרי. במהלך המבצע המכשיר, שסתום בשכבת שליטה בלחץ עם גז חנקן, דבר המאלץ את קרום דק לתוך שכבת fluidic, ובכך גרימת התכווצות בערוץ לשקע. שסתום פנאומטי דינמי מכווץ את הערוץ לשקע ידי כמויות משתנות על ידי שינוי הלחץ המופעל על השכבה שליטה, אשר מתאים את ספיקות יחסית ערוצי לשקע ומאפשר קנס בהיקף השליטה של ​​נקודת הקיפאון.

איור 1: השמנה החלקיקים. (א) מקדימה של חרוז אחד כלוא בתוך מלכודת הידרודינמית. בנוסף חרוז במרכז מלכודת, חרוזים untrapped מספר מוצגים באזור השמנה. (ב) מסלול של חלקיק לכוד לאורך תעלות מוצא (ריבועים). כאשר חלקיק הוא שוחרר מן המלכודת (חץ), הוא בורח לאורך אחד הערוצים לשקע (עיגולים). (ג) היסטוגרמה של התקות של חרוז לכוד (בקוטר 2.2 מיקרומטר) ממרכז המלכודת לאורך ערוצי לשקע.

איור 2:. סכמטי של המכשיר microfluidic עבור השמנה הידרודינמית המלכודת הידרודינמית נבנה באמצעות מכשיר שני שכבת microfluidic. שכבת fluidic מורכב כניסת מדגם, fפתחי הכניסה למאגר שלנו, ושני שקעים פסולת. שכבת בקרת מורכב שסתום פנאומטי קרום הנמצא על גבי אחד הערוצים לשקע בשכבת fluidic. התכווצות בערוץ מוצא מנוגדות מספק לחץ לקזז עבור שסתום פנאומטי. ממדים ערוץ אופיינית נע בין 100-500 מיקרומטר. באזור (A), כניסת המדגם הוא זרם ממוקד על ידי שני פתחי הכניסה למאגר. באזור (ב), זרמים מנוגדים להתכנס כניסת בצומת צולבות חריץ שבו השמנה מתרחשת. שסתום פנאומטי (C) ממוקם על גבי אחד הערוצים לשקע. העמדה נקודת הקיפאון היא מווסתת על ידי ויסות לחץ שסתום זה.

Discussion

שיטות microfluidic נוכחי מניפולציה החלקיקים מבוסס על זרימה הידרודינמית ניתן לאפיין שיטות מגע מבוסס או ללא מגע. צור בשיטות מבוססות להשתמש זרימת הנוזל פיזית להגביל ו לשתק חלקיקים בקירות microfabricated ערוץ ^9, ואילו ללא מגע שיטות להסתמך על מחזורי זרימה או microeddies ^10. בעבוד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 gauge blunt needle	Zephyrtronics	ZT-5-021-1-L	For punching port holes in PDMS
3 ml plastic syringe	BD Biosciences	309585	For filling valve with oil
Si wafers	University Wafer		3” P(100) single side polished 380 μm test grade
Cover glass	VWR international	48404-428	24 x 40 mm #1.5
DAQ card	National Instruments	PCI 6229
Fluorescent beads	Spherotech, Inc.	FP-2056-2	2.2 μm Nile red
Fluorinert	3M	FC 40	Fluorinated carrier oil
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71
LabVIEW	National Instruments	Version 9.0f3 (32bit)
Stereo Microscope	Leica Microsystems	MZ6	For aligning PDMS control layer to fluidic layer.
Mechanical Convection Oven	VWR international	1300U	For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers.
Microfluidic tubing and connectors	Upchurch Scientific		1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings
PDMS	GE Healthcare	RTV 615 A&B
Plasma Chamber	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Pressure Transducer	Proportion Air	DQPV1
Spin Coater	Specialty Coating Systems	G3P-8 Spin Coat
Photoresist	MicroChem Corp.	SU 8 2050
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD 2000 Programmable
Terminal Block	National Instruments	BNC 2110	For analog output to pressure regulator and read out.
UV Collimated Light Source and Exposure System	OAI	Model 30 Enhanced Light Source