Tek Parçacıklar için mikroakışkan tabanlı Hidrodinamik Tuzak

Özet

Bu makalede, hidrodinamik akış dayalı parçacık hapsi mikroakışkan tabanlı bir yöntem mevcut. Biz böylece entegre bir microdevice keyfi parçacıkların hapsi ve mikromanipülasyon sağlayan bir geribildirim kontrol mekanizması kullanılarak bir sıvı durgunluk noktasında kararlı parçacık yakalama göstermektedir.

Özet

Ücretsiz çözüm tek parçacıklar sınırlandırmak ve manipüle etme yeteneği, temel ve uygulamalı bilim için bir anahtar sağlayan bir teknolojidir. , Optik, manyetik, elektrokinetik ve akustik teknikler dayalı parçacık yakalama yöntemleri, fizik ve biyoloji, moleküler hücre düzeyine kadar uzanan büyük gelişmelere yol açmıştır. Bu makalede, biz sadece hidrodinamik akış dayalı parçacık yakalama ve manipülasyon için yeni bir mikroakışkan tabanlı tekniği tanıtmak. Bu yöntemi kullanarak, uzun süre ölçekler için sulu çözeltileri, mikro ve nano ölçekli parçacıkların yakalama göstermektedir. Hidrodinamik tuzak iki karşıt laminer akışları, yakınsama böylece bir sıvı durgunluk noktası (zero-hız point) ile düzlemsel gerilme akım üreten bir çapraz-slot kanallı geometri ile entegre bir mikroakışkan cihaz oluşur. Bu cihazın, parçacıklar sıvı durgunluk noktada parçacık konumunu korumak için, akış alanının aktif kontrol tuzak merkezinde sınırlı. Bu şekilde, parçacıklar etkili özel bir dahili LabVIEW kodu ile uygulanan bir geri besleme kontrol algoritması kullanılarak ücretsiz çözüm sıkışıp kalırlar. Kontrol algoritması, bir parçacık, parçacık izleme, parçacık ağırlık merkezi konumunun belirlenmesi ve basınç regülatörü kullanarak bir çip üzerinde pnömatik valf uygulanan basıncı düzenleyen sıvı akışının aktif ayar mikroakışkan cihaz görüntü elde oluşur. Bu şekilde, on-chip dinamik ölçüm kapak fonksiyonları, böylece durgunluk noktası konumunu ve parçacık yakalama ince çaplı kontrolü sağlayan göreceli debilerde çıkış kanalları düzenlemektir. Mikroakışkan tabanlı hidrodinamik tuzak parçacık yakalama için bir yöntem gibi çeşitli avantajlar sergiliyor. Hidrodinamik yakalama, kapana kısılmış bir nesnenin fiziksel ve kimyasal özellikleri üzerine özel gereksinimleri olmadan herhangi bir keyfi parçacık için mümkündür. Buna ek olarak, alternatif kuvvet alan tabanlı yakalama yöntemleri kullanarak zor konsantre veya kalabalık parçacık süspansiyonlar bir "tek" hedef nesne, doğumdan hidrodinamik yakalama sağlar. Hidrodinamik tuzak uygulamak için, kullanıcı dostu, kolay ve parçacıkların yakalama ve uzun süre analizi kolaylaştırmak için mevcut mikroakışkan cihazlar eklenebilir. Genel olarak, hidrodinamik tuzak hapsi, mikromanipülasyon ve yüzey immobilizasyon olmaksızın parçacıkların gözlem için yeni bir platform ve ücretsiz çözüm yakalama küçük parçacıkların potansiyel pertürbatif, optik, manyetik ve elektrik alanları için ihtiyacını ortadan kaldırır.

Protokol

Hidrodinamik tuzak parçacık hapsi için iki katmanlı hibrid (polidimetilsiloksan (PDMS) / cam) mikroakışkan cihaz oluşur. Adımlar 1-2 mikroakışkan cihazları imalatı tanımlamak ve 3-4 tartışmak cihaz tasarımı ve işletilmesi Adımları.

1. SU-8 Kalıp İmalat (video gösterilmez)

1. Aseton ve izopropil alkol (IPA) ile iki silikon gofret (3 "çapı) temizleyin.
2. N ₂ ve 65 ° C 'de 1 dakika süreyle kalan nem kaldırmak için bir ocak üzerine koyun Kuru gofret.
3. Akışkan katman için bir ~ 40 mikron kalınlığında kalıp oluşturmak için 4000 rpm'de 30 sn SU-8 2050 fotorezist (PR) ile kat gofret # 1 Spin. Kontrol katmanı için ~ 150 mikron kalınlığında bir kalıp oluşturmak için 1500 rpm'de 30 sn PR kat gofret # 2 spin.
4. Yumuşak fırında gofret # 1 - 65 ° C, 3 dakika sonra 95 ° C 6 dk. 65 Yumuşak fırında gofret # 2 ° C sonra 5 dakika 95 ° C'de 20 dk.
5. Ve uygun pozlama yoğunluğu (~ 150 mJ / cm ^2, ~ 260 mJ / cm ² sırasıyla) kendi maskeleri (: limanlar ve akışkan kanalları, gofret # 2 portu ve kontrol katmanı gofret # 1) UV gofret Açığa.
6. 65 Post fırında gofret # 1 ° C 1 dakika sonra 95 ° C 6 dk. 65 Post fırında gofret # 2 ° C daha sonra 95 ve 5 dakika ° C de 10 dakika süreyle.
7. Sertleşmemiş PR çıkarılana kadar, propilen glikol, metil eter asetat (PGMEA) ile gofret geliştirin. IPA ve N ₂ kuru gofret durulayın.

2. Mikroakışkan Cihaz imalat

1. Trichlorosilane bir birkaç damla içeren bir cam tabak ~ 10 dk vakum altında desikatöre gofret koyarak SU-8 kalıp yüzey Silanize. Yüzey silanization SU-8 kalıpları kapalı (PDMS) kopyaları soyma yardımcı olur.
2. Baz karıştırın ve gazını PDMS: akışkan ve kontrol katmanları sırasıyla 15:01 ve 05:01 çapraz bağlayıcı oranları.
3. 750 rpm'de 30 sn için akışkan bir tabaka kalıp (gofret # 1) üzerine kat Spin 15:01 PDMS karışımı ve gofret sonra bir Petri kabı içine yerleştirin. Petri kabı içine yerleştirin ve denetim katmanı kalıp ~ 4 mm kalınlığa kadar kalıp üzerine 05:01 PDMS karışımı dökün.
4. Bake gofret / PDMS az 30 dakika süreyle 70 ° C PDMS katmanları kısmen tedavi etmek.
5. Oda sıcaklığına kadar gofret / PDMS Soğuduktan sonra, SU-8 kalıp kapalı bir neşter ve kabuğu ile Petri kabı, kontrol katmanı (gofret # 2) oluşturacak PDMS çoğaltma, kesti. Delik delme için bir erişim portu, 21 gauge iğne ile on-chip membran kapak gibi hareket edeceğini Mikrokanallı.
6. Gofret # 1 (spin kaplı PDMS akışkan katman) üzerine kontrol katmanı ile PDMS çoğaltma yerleştirin. Dikkatlice hizalayın ve stereo mikroskop kullanılarak akışkan katman kontrol katmanı mühür. 70 katmanları ve fırında arasındaki hava boşlukları kaldırmak için emin olun ° C iki katmanı tamamen tedavi etmek için bir gecede. Bu pişirme adım, iki kat monolitik bir PDMS levha yol açacaktır.
7. Bir neşter kullanılarak kontrol ve SU-8 kalıp kapalı akışkan katmanları içeren oda sıcaklığında, kesme ve soyma PDMS çoğaltma Soğuduktan sonra. Aşırı PDMS çıkarın ve bir jilet ile her bir cihaz ünitesi ayrı. 21 gauge iğne ile akışkan katmanında mikro delikli zımba erişim portları.
8. Bir lamel Bond PDMS levha tam bir aygıt elde etmek için. Aseton ve IPA: İlk olarak, temiz bir lamel (1,5, 24 x 45 mm). Daha sonra, 30 saniye için 500 mTorr altında lamel ve oksijen plazma ile PDMS çoğaltma yüzeyleri tedavi, ve hemen geri dönüşü olmayan bir mühür formu iki yüzey temas getirmek.
9. PDMS katmanları ve lamel arasında yapıştırma artırmak için bir gecede cihazlar pişirin.

Adımlar 3-4 hidrodinamik tuzak uygulanması yukarıda açıklanan mikroakışkan cihaz kullanarak açıklar.

3. Hidrodinamik Tuzak Deneysel Kurulum

1. Mikroakışkan cihaz ters bir mikroskop sahneye yerleştirin ve sahne klipler ile sabitleyin.
2. Tampon ve örnek çözümleri ile ayrı ayrı iki gaz sıkı şırınga doldurun ve Harvard Apparatus Şırınga pompası (PHD 2000 Programlanabilir) üzerine koyun. Tampon ve örnek çözümler sırasıyla, 1 ml ve 250 ul şırınga aracılığıyla mikroakışkan cihaz teslim edilir. Tipik olarak, 50 mM Tris / Tris HCl tampon çözeltisi (pH 8.0) v / v Triton X-100 tampon çözelti olarak kullanılan% 0.02 içeren. Örnek çözeltisi, tampon çözelti içinde bir parçacık süspansiyon (örneğin flüoresan polistiren boncuklar) oluşur.
3. Şırınga (Örnek ve tampon teslim) ve mikroakışkan bir cihaz arasındaki akışkan bağlantıları kurmak. Luer-lock adaptör kullanılarak (ID) perfluoroalkoxy (PFA) boru 1 / 16 "dış çapı (OD) x 0.020" iç çapı şırınga bağlayın. 24 gauge meta mikroakışkan cihazın giriş limanlarına PFA hortumun diğer ucunul boru. Bir T-valf kontrolü için numune teslim mikroakışkan cihaz üzerinde örnek şırınga ve örnek bağlantı noktası arasına yerleştirilir.
4. Mikroakışkan cihaz çıkış kanalları için akışkan bağlantıları kurmak. 24 gauge metal boru kullanılarak iki çıkış kanalı PFA boru (1 / 16 "OD x 0.020" ID) bağlayın. PFA boru çıkışları için eşit uzunlukta olmalıdır. Batmak çıkış tüpleri, şırınga ve çıkış kanalları arasında sabit bir basınç düşüşü sağlamak için hizmet veren tampon çözelti ile dolu bir 1.5 mL santrifüj tüpü içine hem de.
5. 3 ml'lik bir Luer-lock plastik şırınga ile hava operasyon sırasında akışkan tabakası içine sızmasını önlemek için florlu taşıyıcı yağ ile on-chip kapak doldurun. Vana odası hava akışkan katman Mikrokanallı PDMS zarından itti ve daha sonra çıkış bağlantı noktaları üzerinden sıvı akışı ile cihaz kaldırıldı.
6. Çip üzerinde kapak çalışması için kontrol katmanı liman basınçlı bir asal gaz (azot) kaynağı bağlayın. Bu amaçla, biz bir nitrojen tankı (2200 psi) ve 0-30 psi mikroakışkan cihaz on-chip kapak ihtiyacını karşılamak için bir elektronik basınç regülatörü kullanın. Nitrojen tankı ¼ "OD x 0.170" ID boru ile basınç regülatörü bağlanır. Basınç regülatörü, terminus az 24 gauge metal boru ile 1 / 16 "OD x 0.020" ID PFA tüp aracılığıyla mikroakışkan cihaza bağlı.
7. Akışkan bağlantıları ve mikroakışkan cihaz, tüm hava kabarcığı çıkış kanalları dahil sistemi kaldırılmış olduğundan emin olmak için 0,5 mL tampon çözelti ile durulayın. 2000-5000 mcL / saat arasında kabarcıkları aralık temizleme için kullanılan tipik akış hızları. Hava kabarcıkları mikroakışkan kanalları durulanır sonra, tipik bir parçacık yakalama debili 50-100 mcL / saat akış hızını azaltır.
8. Bu noktada, akışkan bağlantıları, örnek kurulan ve tampon çözeltiler, sabit bir akış hızı (50-100 mcL / saat) mikroakışkan cihaz teslim edilir ve cihaz hidrodinamik yakalama için hazırdır.

4. Hidrodinamik Yakalama Prosedürü

1. Parçacık yakalama otomatikleştiren özel inşa LabVIEW kodu (aşağıdaki LabVIEW kodu için Kullanım Not) çalıştırın.
2. Kamera görüntüsü merkezinde mikroskop xy çeviri aşamasında, pozisyon yakalama bölgesi (çapraz yuvası). Bindirme bölgede objektif lens odak noktası haline getirin ve görüntüleme koşulları optimize etmek için kamera ayarlarını.
3. Kameranın ROI merkezi tuzak merkezi konumda olacak şekilde görüş alanı içinde, dikdörtgen bir ilgi bölge (ROI) seçin.
4. Çip üzerinde kapak uygulanan ofset baskılı başlatılamıyor. Çıkış kanallarının birinde, 100-200 mikron genişliğinde daralma çip üzerinde kapak için bir ofset baskı sağlamak için tanıtıldı. Sabit off-set baskı kanal çapraz yuvası merkezinin çevresinde durgunluk noktası konumunu ayarlamak için çip üzerinde vana sağlar. En deneyler için, ofset baskı kanal boyutları (yükseklik ve genişlik), daralma genişliği ve on-chip kapak (kapak boyutu, membran kalınlığı, vb.) Özelliklerine bağlı olarak 0-12 psi arasında yer alır.
5. Geri besleme denetleyicisi başlatın ve tuzak tepki optimize etmek için oransal kazanç ayarlayabilirsiniz. Geribildirim denetleyicisi hata veya parçacık konumu ve set noktası (tuzak merkezi) arasındaki mesafe en aza indirir durgunluk noktası konumu, hareket edebilmek için çip üzerinde vana uygulanan basıncı ayarlar. Akış hızı ve çip üzerinde vana pozisyonu bağlı olarak, tuzak istikrar artar ve istenmeyen partikül salınımlar ortadan kaldırır optimal bir oransal kazanç değeri yoktur.
6. Bir parçacık Tuzak. LabVIEW kod otomatik olarak bindirme bölgeye giren parçacıkların bir tuzak. Istenilen tane tuzak sonra, istenirse, numune akışı kapanır ve tampon çözelti içinde sıkışıp parçacık izole mümkündür.
7. Kapana kısılmış bir parçacık Monitör ve manuel netleme veya otomatik bir odak mikroskop kurulum kullanarak görüntü düzlemi içinde parçacık odak korumak. Bu biraz uzun bir zaman ölçeği yakalama olay (saat dakika) ders sırasında tuzak istikrarı sağlamak amacıyla geri besleme kontrolörü oransal kazancı ayarlamak için gerekli olabilir.

LabVIEW Kodu: Feedback Denetleyicisi için Kullanım Not

Otomatik parçacık yakalama özel bir LabVIEW kodu kullanılarak uygulanan bir doğrusal geri beslemeli kontrol algoritması kullanılarak elde edilir. LabVIEW kod bir CCD kamera görüntüleri yakalar ve aktif bir çip üzerinde dinamik pnömatik vana pozisyonlar (kısmen açık / kapalı durumu) modüle bir basınç regülatörü, bir elektrik potansiyeli (gerilim) iletir. Olarak vana pozisyon değişiklikleri, tek bir çıkış hattına hidrodinamik akış hızı iböylece durgunluk noktası yeniden konumlandırma ve hidrodinamik yakalama sağlayan ayarlanabilir. Geri besleme döngüsü adımları sırayla ve bu yüzden birçok görüntü yakalama hızı (10-60 Hz) yürütür. LabVIEW kod her bir geri besleme döngüsü döngüsü sırasında aşağıdaki adımları çalıştırır:

• Ve bir CCD kamera görüntü yakalama mikroakışkan cihazın 10x objektif lens ile floresan mikroskobu kullanarak bindirme bölgede bir "hedef" parçacık (0.4 NA) için bir görüntü elde edilir.
• Parçacık izleme Parçacık ağırlık merkezi konumu belirlenir, ve partikül izleme algoritması başlattı. Parçacıklar ağırlık merkezi konumu belirlenen bir noktaya yayılma fonksiyonu (PSF), partikül emisyonu yoğunluğu profiline uyan lokalize.
• Akış alanında kontrolü. Çip üzerinde dinamik kapak yönelik güncellenmiş basıncı oransal denetleyici bir geri besleme kontrol algoritması kullanılarak hesaplanmıştır. Bu şekilde, vana eylem parçacık parçacık tuzak merkezine doğru yönlendirmek amacıyla bir hidrodinamik kuvvet uygular durgunluk noktası, yeniden konumlandırmak için.

LabVIEW kod yakalama parçacık sırasında çekilen her resim için aşağıdaki verileri kaydeder: 1) Zaman) ağırlık merkezi (sıkışıp parçacık, 3 x, y) pozisyonu) tuzak merkezi konumu, 4, 2 geçen) parçacık mesafe çip üzerinde vana tuzak merkezi, 5) basınç uygulanır. Buna ek olarak, kod aynı zamanda AVI dosyası formatı içinde sıkışıp parçacığın bir film kaydeder.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Biz hidrodinamik bir tuzağı kullanarak çeşitli boyut (100, 540, 830 nm ve 2.2 mikron çapında) floresan polistiren boncuklar tuzağa düşmüştür. Şekil 1 (a), mikroakışkan bir cihaz çapraz yuvası kavşakta sıkışıp bir parçacık bir görüntü gösterir. Hapsolmuş bir parçacığın yörüngesi bir yakalama olayı sırasında ya da kaydedilen film dosyası sıkışıp parçacık izleme ve lokalize LabVIEW kod tarafından kaydedilen ağırlık merkezi konum verileri doğrudan belirlenebilir. Şekil 1 (b), çıkış kanalı yönünde bir tuzağa parçacık (2.2 mikron floresan polistren boncuk) yörüngesini gösteriyor. Boncuk ilk 3 dakika (kareler) tuzağına düşer ve daha sonra bir çıkış kanalları (daireler) boyunca tuzak ve kaçar serbest. Sıkışma akış ekseni boyunca (giriş kanalı yönünde veriler gösterilmemiştir) Parçacık yörüngeleri Şekil 1 (b) 'de gösterildiği gibi genişlemeli akış ekseni boyunca (çıkış yönde) parçacık yörüngeleri benzer. Çıkış kanalı doğrultuda bir tuzağa boncuk (2.2 mikron çapında) için tuzak merkezine parçacık deplasman histogram Şekil 1 (c) 'de gösterilmiştir. Bu çalışmada açıklanan geri besleme kontrol algoritması kullanarak, ± 1 mikron giriş ve çıkış kanalı yönde boyunca tuzak merkezinin içinde sıkışıp parçacıklar sınırlı.

Hidrodinamik yakalama için kullanılan mikroakışkan cihaz şematik Şekil 2'de gösterilmiştir. Entegre mikroakışkan cihaz, akışkan bir tabaka ve bir kontrol katmanı oluşur ve bu makalede açıklanan standart olarak çok katlı yumuşak litografi kullanarak imal edilir. Akışkan katman tampon ve örnek kanal, yanı sıra hidrodinamik yakalama kolaylaştırmak için çapraz yuvası kanal geometri içerir. Akışkan katman çıkış kanalları biri üzerine yerleştirilmiş bir pnömatik valf kontrol katmanı oluşur ve kontrol ve akışkan tabakaları, ince bir elastomerik zar ile ayrılır. Aygıtı çalışma sırasında, denetim katmanı valf, akışkan tabakası içine ince bir zar güçleri azot gazı, basınçlı böylece çıkış kanalda bir daralma inducing. Dinamik pnömatik valf, değişken miktarlarda çıkış kanalları bağıl akış oranları ayarlar ve durgunluk noktasına ince ölçekli kontrol sağlayan kontrol katmanı, uygulanan basınç değiştirerek çıkış kanalı daraltır.

Şekil 1: Partikül Yakalama. (A) tek bir boncuk Resim hidrodinamik tuzak sınırlı. Birkaç untrapped boncuk boncuk tuzak merkezine ek olarak, yakalama bölgede gösterilmiştir. (B) çıkış kanalları (kareler) birlikte kapana kısılmış bir parçacık Yörünge. Tuzak (ok) parçacık serbest bırakıldığında, çıkış kanalları (daireler) birlikte kaçar. (C) Histogram çıkış kanalları boyunca tuzak merkezi bir tuzak boncuk (2.2 mikron çapında) deplasmanları.

Şekil 2: hidrodinamik yakalama mikroakışkan cihaz şematik hidrodinamik tuzak iki katmanlı mikroakışkan cihazı kullanılarak inşa edilmiştir. Örnek bir giriş, f akışkan katman oluşurtampon girişleri, iki adet atık çıkışları. Akışkan katman çıkış kanallarının birinin üstünde bulunan pnömatik membran vana kontrol katmanı oluşur. Karşı çıkış kanalda bir daralma, pnömatik valf için bir ofset basınç sağlar. Tipik kanal boyutları 100-500 mikron arasında değişir. (A), bölgede numune girişi akışı iki tampon girişleri ile duruldu. Bölgede (B), karşıt giriş akışları çapraz yuvası kavşakta hapsi gerçekleşir yakınsama. Pnömatik valf (C) çıkış kanallarından biri üstüne konumlandırılmış. Durgunluk noktası konumunu bu valf basıncının düzenlenmesinde tarafından modüle.

Tartışmalar

Şu mikroakışkan hidrodinamik akış dayalı parçacık manipülasyon için yöntemler, iletişim tabanlı veya temassız yöntemler olarak karakterize edilebilir. Temassız yöntemleri, akış veya ^microeddies 10 dolaşımdaki güveniyor ise İletişim-tabanlı yöntemler, fiziksel sınırlandırmak ve microfabricated kanal ^duvarları 9 karşı parçacıklar hareketsiz sıvı akışını kullanın . Bu çalışmada, sıvı akışı tek eylemini kullanarak ücretsiz çözüm parçacık yakalama i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 gauge blunt needle	Zephyrtronics	ZT-5-021-1-L	For punching port holes in PDMS
3 ml plastic syringe	BD Biosciences	309585	For filling valve with oil
Si wafers	University Wafer		3” P(100) single side polished 380 μm test grade
Cover glass	VWR international	48404-428	24 x 40 mm #1.5
DAQ card	National Instruments	PCI 6229
Fluorescent beads	Spherotech, Inc.	FP-2056-2	2.2 μm Nile red
Fluorinert	3M	FC 40	Fluorinated carrier oil
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71
LabVIEW	National Instruments	Version 9.0f3 (32bit)
Stereo Microscope	Leica Microsystems	MZ6	For aligning PDMS control layer to fluidic layer.
Mechanical Convection Oven	VWR international	1300U	For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers.
Microfluidic tubing and connectors	Upchurch Scientific		1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings
PDMS	GE Healthcare	RTV 615 A&B
Plasma Chamber	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Pressure Transducer	Proportion Air	DQPV1
Spin Coater	Specialty Coating Systems	G3P-8 Spin Coat
Photoresist	MicroChem Corp.	SU 8 2050
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD 2000 Programmable
Terminal Block	National Instruments	BNC 2110	For analog output to pressure regulator and read out.
UV Collimated Light Source and Exposure System	OAI	Model 30 Enhanced Light Source