Un piège hydrodynamique microfluidique à base de particules uniques

Résumé

Dans cet article, nous présentons une méthode basée microfluidique pour le confinement des particules repose sur l'écoulement hydrodynamique. Nous démontrons le piégeage des particules stables à un point de stagnation du liquide en utilisant un mécanisme de contrôle de rétroaction, permettant ainsi à l'isolement et la micromanipulation de particules arbitraires dans un microdispositif intégré.

Résumé

La capacité de confiner et de manipuler des particules uniques en solution libre est une technologie clé pour la science fondamentale et appliquée. Méthodes de piégeage des particules basé sur des techniques optiques, magnétiques, électrocinétique, et acoustique ont conduit à des avancées majeures en physique et en biologie moléculaire, allant de la au niveau cellulaire. Dans cet article, nous introduisons une nouvelle technique basée sur microfluidique pour le piégeage des particules et la manipulation basée uniquement sur l'écoulement du fluide hydrodynamique. En utilisant cette méthode, nous démontrons le piégeage des particules micro-et nano-échelle dans des solutions aqueuses pour des échelles de temps longues. Le piège est constitué d'un hydrodynamiques dispositif intégré microfluidique avec une géométrie du canal inter-fente où deux flux laminaire opposés convergent, générant ainsi un flux planaire extensionnel avec un point de stagnation du fluide (zéro-vitesse point). Dans ce dispositif, les particules sont confinées au centre piège par contrôle actif du champ d'écoulement de maintenir la position des particules au point de stagnation du liquide. De cette manière, les particules sont effectivement piégés dans une solution libre utilisant un algorithme de commande de rétroaction en œuvre avec un code personnalisé construit LabVIEW. L'algorithme de contrôle est constitué d'acquisition d'image pour une particule dans le dispositif microfluidique, suivie par suivi de particules, la détermination de la position des particules centroïde, et l'ajustement actif de l'écoulement du fluide en régulant la pression appliquée à une valve pneumatique sur puce utilisant un régulateur de pression. De cette façon, le sur-puce dynamiques fonctions vanne de dosage pour réguler les débits relatifs à des canaux de sortie, permettant ainsi à échelle fine de contrôle de la position de point de stagnation et de piégeage des particules. Le piège hydrodynamiques microfluidique à base présente plusieurs avantages comme une méthode pour piéger des particules. Piégeage hydrodynamique est possible pour toute particule arbitraire sans exigences spécifiques sur les propriétés physiques ou chimiques de l'objet piégé. En outre, le piégeage hydrodynamique permet confinement d'un objet cible "unique" dans les suspensions de particules concentrées ou surpeuplés, ce qui est difficile avec force alternative des méthodes de piégeage sur le terrain. Le piège hydrodynamique est convivial, simple à mettre en œuvre et peut être ajoutée aux dispositifs existants pour faciliter l'analyse microfluidique piégeage et de longue date de particules. Globalement, le piège hydrodynamique est une nouvelle plateforme pour le confinement, la micromanipulation, et l'observation des particules sans immobilisation de surface et élimine le besoin de potentiellement perturbative des champs optiques, magnétiques et électriques dans le piégeage sans solution de petites particules.

Protocole

Le piège est constitué d'un hydrodynamiques à deux couches hybrides (polydiméthylsiloxane (PDMS) / verre) dispositif microfluidique pour le confinement des particules. Étapes 1-2 décrivent la fabrication de dispositifs microfluidiques, et étapes 3-4 conception du dispositif de discuter et d'exploitation.

1. SU-8 de fabrication de moule (non représenté dans la vidéo)

1. Nettoyer deux plaquettes de silicium (3 "de diamètre) avec de l'acétone et d'alcool isopropylique (IPA).
2. Gaufrettes à sec avec du N ₂ et placez-les sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 1 min pour éliminer l'humidité résiduelle.
3. Spin # 1 plaquette manteau avec SU-8 2050 photosensible (PR) pendant 30 sec à 4000 rpm pour créer un moule ~ 40 um d'épaisseur de la couche fluidiques. Spin plaquette coat # 2 avec PR pendant 30 sec à 1500 rpm pour créer un moule ~ 150 um d'épaisseur de la couche de contrôle.
4. Doux plaquette cuire n ° 1 à 65 ° C pendant 3 min, puis à 95 ° C pendant 6 min. Doux plaquette pâtisseries # 2 à 65 ° C pendant 5 min, puis à 95 ° C pendant 20 min.
5. Exposer gaufrettes aux UV avec leurs masques respectifs (wafer # 1: ports et canaux fluidiques, plaquette n ° 2: le port et la couche de contrôle) et l'intensité d'exposition appropriées (~ 150 mJ / cm ^2, ~ 260 mJ / cm ^2, respectivement).
6. Message # 1 plaquette cuire à 65 ° C pendant 1 min, puis à 95 ° C pendant 6 min. Message cuire plaquette n ° 2 à 65 ° C pendant 5 min, puis à 95 ° C pendant 10 min.
7. Développer des plaquettes avec du propylène glycol méthyl éther acétate (PGMEA) jusqu'au PR non durci est enlevé. Rincez plaquettes avec l'IPA et sec avec N _2.

2. Fabrication de dispositifs microfluidiques

1. Silaniser la surface de la SU-8 moules en plaçant les tranches dans un dessiccateur sous vide pendant environ 10 min avec un plat en verre contenant quelques gouttes de trichlorosilane. Silanisation Surface aide à éplucher les répliques (PDMS) au large des moules SU-8.
2. Mélanger et dégazer PDMS dans la base: les ratios de 15:1 réticulant et 5:1 pour la fluidique et de contrôle des couches respectivement.
3. Spin enduire le mélange PDMS 15h01 sur le moule couche fluidiques (wafer # 1) pendant 30 secondes à 750 tours et ensuite placer la galette dans un plat de Pétri. Placer le moule couche de contrôle dans une boîte de Pétri et versez le mélange PDMS 05h01 sur le moule sur une épaisseur de ~ 4 mm.
4. Cuire plaquettes / PDMS pendant 30 min à 70 ° C à durcir partiellement les couches de PDMS.
5. Après refroidissement les plaquettes / PDMS à température ambiante, coupé la réplique PDMS, qui va former la couche de contrôle (wafer # 2), à partir de la boîte de Pétri avec un scalpel et le retirer le moule SU-8. Perforation d'un port d'accès à l'microcanaux qui agira comme la vanne à membrane sur-puce avec une aiguille de calibre 21.
6. Placez la réplique PDMS avec la couche de contrôle sur la tranche n ° 1 (qui a le spin-revêtement PDMS fluidiques couche). Alignez soigneusement et sceller la couche de contrôle de la couche fluidiques aide d'un microscope stéréo. Veillez à supprimer toutes les poches d'air entre les couches et faire cuire à 70 ° C pendant une nuit pour durcir complètement les deux couches. Cette étape de cuisson se traduira par une dalle monolithique PDMS avec deux couches.
7. Après refroidissement à température ambiante, couper et éplucher les répliques PDMS contenant à la fois le contrôle et les couches fluides hors du SU-8 moules à l'aide d'un scalpel. Enlever l'excès de PDMS et séparer chaque unité appareil avec une lame de rasoir. Ports trou d'accès du punch à microcanaux fluidiques dans la couche avec une aiguille de calibre 21.
8. Bond de la dalle de PDMS à une lamelle d'obtenir un dispositif complet. D'abord, nettoyer une lamelle (Non: 1,5, 24 x 45 mm) avec de l'acétone et de l'IAP. Ensuite, traiter à la fois la lamelle et les surfaces de PDMS réplique avec un plasma d'oxygène de moins de 500 mTorr pendant 30 sec, et immédiatement mettre les deux surfaces en contact pour former un joint irréversible.
9. Cuire les appareils pendant la nuit pour accroître les liens entre les couches PDMS et la lamelle.

Étapes 3-4 décrivent la mise en œuvre en utilisant le piège hydrodynamiques le dispositif microfluidique décrit ci-dessus.

3. Installation Piège hydrodynamique expérimentale

1. Placez le dispositif microfluidique sur la scène d'un microscope inversé et le fixer avec des clips scène.
2. Remplir deux seringues étanches aux gaz séparément, avec des solutions tampon et des échantillons et les placer sur une pompe seringue Harvard Appareillage (PHD 2000 programmable). Les tampons et les solutions échantillons sont livrés à l'dispositif microfluidique à travers un 1 ml et une seringue 250 pi, respectivement. Typiquement, une Tris 50 mM / Tris solution tampon HCl (pH 8,0) contenant 0,02% v / v de Triton X-100 est utilisé comme la solution tampon. La solution de l'échantillon est constitué d'une suspension de particules (par exemple des billes de polystyrène fluorescentes) dans la solution tampon.
3. Etablir les connexions fluidiques entre les seringues (la prestation de l'échantillon et le tampon) et le dispositif microfluidique. Connectez les seringues à 1 / 16 "de diamètre extérieur (OD) x 0,020" de diamètre interne (ID) perfluoroalkoxy (PFA) tube en utilisant des adaptateurs luer-lock. Branchez l'autre extrémité du tube en PFA aux ports d'entrée du dispositif microfluidique avec 24 méta manomètreL tuyau. Un T-vanne peut être placée entre la seringue et le port de l'échantillon de l'échantillon sur le dispositif microfluidique pour contrôler la livraison d'échantillons.
4. Etablir les connexions fluidiques pour les canaux de sortie dans le dispositif microfluidique. Connectez les deux canaux de sortie à tube en PFA (1 / 16 "OD x 0,020" ID) en utilisant 24 tubes de métal jauge. Le tube en PFA pour les prises de courant doivent être d'égale longueur. Immerger les tubes de sortie tous les deux dans un tube à centrifuger de 1,5 ml remplie avec une solution tampon, qui sert à maintenir une chute de pression constante entre les seringues et les canaux de sortie.
5. Remplissez la vanne sur la puce à l'huile porteuse fluorés en utilisant une seringue de 3 ml en plastique luer-lock pour éviter les fuites d'air dans la couche fluidique pendant le fonctionnement. L'air dans la chambre de vanne est poussé à travers la membrane de PDMS dans le microcanal dans la couche fluidique et plus tard, retiré de l'appareil avec l'écoulement du fluide à travers les orifices de sortie.
6. Connecter une pression de gaz inerte (azote) l'alimentation du port dans la couche de contrôle de fonctionnement de la vanne sur la puce. Pour ce faire, nous utilisons un réservoir d'azote (2200 psi) et un régulateur de pression électronique pour fournir 00 à 30 psi à la vanne sur la puce dans le dispositif microfluidique. Le réservoir d'azote est relié au régulateur de pression à l'aide de ¼ "OD x 0,170" tube ID. Le régulateur de pression est connecté à l'appareil microfluidique à 1 / 16 "OD x 0,020" ID tube en PFA avec 24 tubes de métal jauge à son terminus.
7. Rincez les connexions fluidiques et le dispositif microfluidique avec 0,5 ml de solution tampon pour s'assurer que toutes les bulles d'air sont retirés du système, y compris les canaux de sortie. Les débits typiques utilisés pour la compensation gamme de bulles entre 2000-5000 ul / hr. Après les bulles d'air sont rincés des canaux microfluidiques, de réduire le débit de 50-100 ul / h, qui est un taux volumétrique typiques de débit pour le piégeage des particules.
8. À ce stade, les connexions fluidiques sont établis, l'échantillon et les solutions tampons sont livrés à l'dispositif microfluidique à un débit fixe (50-100 ul / h), et l'appareil est prêt pour le piégeage hydrodynamique.

4. Procédure de piégeage hydrodynamique

1. Exécutez le code sur mesure LabVIEW, qui automatise le piégeage des particules (voir Note d'utilisation pour LabVIEW code ci-dessous).
2. Utilisation du microscope à la traduction xy stade, la position de la région de piégeage (cruciforme) au centre de la vue caméra. Apportez la région piégeage en lumière de l'objectif et d'ajuster les réglages pour optimiser les conditions d'imagerie.
3. Choisissez une région rectangulaire d'intérêt (ROI) dans le champ de la caméra de vue tels que le centre de la ROI sera la position du centre de piège.
4. Initialiser la pression offset appliqué à la vanne sur la puce. Dans l'un des canaux de sortie, une constriction 100-200 pm de large est introduit pour fournir une pression de décalage pour la vanne sur la puce. La constante off-set de pression permet à la valve sur puce pour ajuster la position du point de stagnation dans le voisinage du centre du canal inter-slot. Pour la plupart des expériences, la pression est compensée entre 0-12 psi en fonction des dimensions de canal (largeur et hauteur), la largeur de constriction, et les spécifications de la vanne sur puce (taille de la vanne, épaisseur de la membrane, etc.)
5. Initier le contrôleur feedback et ajuster le gain proportionnel à optimiser la réponse piège. Le contrôleur de retour sera d'ajuster la pression appliquée à la vanne sur la puce, afin de déplacer la position du point de stagnation, ce qui minimise l'erreur ou la distance entre la position de la particule et le point de consigne (centre du piège). Selon le débit et la position de la vanne sur la puce, il ya une valeur de gain optimal proportionnelle, ce qui augmente la stabilité piège et élimine les oscillations des particules indésirables.
6. Piège une particule. Le code LabVIEW automatiquement piège l'une des particules entrant dans la région de piégeage. Une fois qu'une particule souhaitée est piégé, il est possible de couper le flux d'échantillon et d'isoler les particules piégées dans une solution tampon, si désiré.
7. Surveiller les particules piégées et maintenir l'attention des particules dans le plan de l'image en utilisant au point manuelle ou à une configuration automatisée concentrer microscope. Il peut être nécessaire d'ajuster légèrement le gain proportionnel du régulateur de rétroaction afin d'assurer la stabilité piège au cours d'un événement de piégeage échelle de temps longue (minutes à plusieurs heures).

Code LabVIEW: Note d'utilisation pour le contrôleur Commentaires

Piégeage des particules automatisé est réalisé en utilisant un algorithme de rétroaction linéaire contrôle mis en œuvre en utilisant un code personnalisé LabVIEW. Le code LabVIEW capture des images d'une caméra CCD et transmet un potentiel électrique (tension) d'un régulateur de pression, qui module la position active (état partiellement ouvert / fermé) d'une vanne sur puce pneumatiques dynamiques. Comme les changements de position de vanne, le taux d'écoulement hydrodynamique dans une ligne de sortie is ajusté, ce qui re-positionnement du point de stagnation et de permettre le piégeage hydrodynamique. Les étapes de la boucle de rétroaction sont séquentiellement et itérativement exécuté à la vitesse de capture d'image (10-60 Hz). Le code LabVIEW exécute les étapes suivantes lors de chaque cycle boucle de rétroaction:

• . Capture d'image Une image est acquise pour une «cible» de particules dans la région de piégeage du dispositif microfluidique en utilisant la microscopie à fluorescence avec un objectif 10x (NA: 0,4) et une caméra CCD.
• Suivi de position des particules centroïde. Particule est déterminé, et l'algorithme de suivi de particules est initiée. Les particules sont localisées en ajustant le profil d'intensité d'émission de la particule à une fonction de diffusion de point (PSF), à partir de laquelle la position est déterminée centroïde.
• Contrôle de champ d'écoulement. La pression à jour destinée à la soupape de sur-puce dynamique est calculée en utilisant un algorithme de contrôle de rétroaction avec un régulateur proportionnel. De cette façon, l'action de la vanne est à nouveau la position du point de stagnation, qui exerce une force hydrodynamique sur la particule afin d'orienter les particules vers le centre piège.

Le code LabVIEW enregistre les données suivantes pour chaque image capturée lors de particules de piégeage: 1) le temps écoulé, 2) centroïde (x, y) la position de la particule piégée, 3) la position du centre de piège, 4) la distance de la particule de la la pression piège centre, 5) appliquée à la vanne sur la puce. En outre, le code enregistre également un film de la particule piégée dans le format de fichier AVI.

5. Les résultats représentatifs

Nous piégés billes de polystyrène fluorescentes de différentes tailles (100, 540, 830 nm, et de 2,2 um de diamètre) en utilisant un piège hydrodynamique. La figure 1 (a) montre une image d'une particule piégée à la jonction de la Croix-fente dans un dispositif microfluidique. La trajectoire d'une particule piégée peut être déterminée directement à partir des données de position centroïde enregistrées par le code LabVIEW lors d'un événement de piégeage ou par le suivi et la localisation de la particule piégée dans le fichier vidéo enregistré. La figure 1 (b) montre la trajectoire d'une particule piégée (2,2 um de perles fluorescentes) le long de la direction de canal de sortie. La perle est d'abord pris au piège (carrés) pendant 3 min puis est libéré de la trappe et s'échappe le long d'un des canaux de sortie (cercles). Trajectoires de particules dans l'axe d'écoulement de compression (sens canal d'amenée; données non présentées) sont similaires à des trajectoires de particules dans l'axe d'écoulement extensionnel (direction d'écoulement), comme illustré dans la figure 1 (b). Un histogramme de déplacement des particules du centre piège pour un piégés billes (2,2 um de diamètre) le long des directions de canal de sortie est montré dans la figure 1 (c). En utilisant l'algorithme de contrôle rétroaction décrites dans ce travail, les particules piégées sont confinés à ± 1 um du centre piège le long de l'entrée et les orientations canal de sortie.

Un schéma du dispositif microfluidique utilisé pour le piégeage hydrodynamique est montré dans la figure 2. Le dispositif intégré microfluidique constitué d'une couche fluidique et une couche de contrôle et est fabriqué en utilisant la norme de lithographie molle multicouches comme décrit dans cet article. La couche contient les canaux fluidiques tampon et des échantillons, ainsi que la géométrie du canal de la Croix-slot pour faciliter le piégeage hydrodynamique. La couche de contrôle est constitué d'une vanne pneumatique positionné au-dessus l'un des canaux de sortie dans la couche fluidique, et le contrôle et les couches fluides sont séparés par une membrane élastomère mince. Pendant le fonctionnement du dispositif, la soupape dans la couche de contrôle est pressurisée avec de l'azote gazeux, ce qui oblige la fine membrane dans la couche fluidique, induisant ainsi une constriction dans le canal de sortie. La valve pneumatique dynamiques resserre le canal de sortie par des quantités variables en changeant la pression appliquée à la couche de contrôle, qui ajuste les débits relatifs dans les canaux de sortie et permet à échelle fine de contrôle du point de stagnation.

Figure 1: Le piégeage des particules. (A) Image d'une seule bille confiné dans le piège hydrodynamique. En plus de la perle au centre piège, plusieurs billes non capturé sont présentés dans la région de piégeage. (B) Trajectoire d'une particule piégée le long des canaux de sortie (carrés). Lorsque la particule est libéré du piège (flèche), il s'échappe le long d'un des canaux de sortie (cercles). (C) Histogramme des déplacements d'une bille piégée (2,2 um de diamètre) à partir du centre le long du piège de canaux de sortie.

Figure 2:. Schéma du dispositif microfluidique pour le piégeage hydrodynamique Le piège hydrodynamiques est construit en utilisant un dispositif bi-couche microfluidique. La couche fluidique constitué d'une entrée de l'échantillon, fnos entrées de tampon, et deux sorties de déchets. La couche de contrôle est constitué d'une vanne pneumatique à membrane située au sommet d'un des canaux de sortie dans la couche fluidiques. Une constriction dans le canal de sortie opposées fournit une pression de décalage pour la soupape pneumatique. Les dimensions de canal typique comprise entre 100 à 500 um. Dans la région (A), entrée de l'échantillon est le flux concentré par deux entrées de mémoire tampon. Dans la région (B), les flux d'entrée opposés convergent à la jonction de la Croix-slot où le piégeage a lieu. La valve pneumatique (C) est positionné sur le dessus de l'un des canaux de sortie. La position du point de stagnation est modulée par la régulation de pression pour cette vanne.

Discussion

Les méthodes actuelles de microfluidique pour la manipulation de particules repose sur l'écoulement hydrodynamique peut être caractérisée comme méthodes de contact à base ou non-contact. Contactez les méthodes basées sur l'utilisation des flux de liquide physiquement confiner et d'immobiliser les particules contre les parois de canal microfabriqué ^9, tandis que les non-contact méthodes reposent sur ​​circulant débit ou microeddies ^10. Dans ce travail, nous présentons un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 gauge blunt needle	Zephyrtronics	ZT-5-021-1-L	For punching port holes in PDMS
3 ml plastic syringe	BD Biosciences	309585	For filling valve with oil
Si wafers	University Wafer		3” P(100) single side polished 380 μm test grade
Cover glass	VWR international	48404-428	24 x 40 mm #1.5
DAQ card	National Instruments	PCI 6229
Fluorescent beads	Spherotech, Inc.	FP-2056-2	2.2 μm Nile red
Fluorinert	3M	FC 40	Fluorinated carrier oil
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71
LabVIEW	National Instruments	Version 9.0f3 (32bit)
Stereo Microscope	Leica Microsystems	MZ6	For aligning PDMS control layer to fluidic layer.
Mechanical Convection Oven	VWR international	1300U	For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers.
Microfluidic tubing and connectors	Upchurch Scientific		1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings
PDMS	GE Healthcare	RTV 615 A&B
Plasma Chamber	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Pressure Transducer	Proportion Air	DQPV1
Spin Coater	Specialty Coating Systems	G3P-8 Spin Coat
Photoresist	MicroChem Corp.	SU 8 2050
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD 2000 Programmable
Terminal Block	National Instruments	BNC 2110	For analog output to pressure regulator and read out.
UV Collimated Light Source and Exposure System	OAI	Model 30 Enhanced Light Source