단일 입자 Microfluidic 기반 유체 트랩

요약

이 문서에서는, 우리는 유체 흐름에 따라 입자의 구속을위한 microfluidic 기반의 방법을 제시한다. 우리는이를 통합 microdevice에 임의의 입자의 감금 및 미세 조작을 가능하게, 피드백 제어 메커니즘을 사용하여 유체의 정체 지점에 안정적인 입자 트래핑을 보여줍니다.

초록

무료 솔루션에서 단일 입자들을 가두고 조작하는 능력은 기초 및 응용 과학의 주요 사용 기술입니다. 광학, 자기 계면과 음향 기술을 기반으로 입자 트래핑을위한 방법은 분자에서 세포 수준에 이르기까지 물리학 및 생물학의 주요 발전을 주도했습니다. 이 문서에서는, 우리는 전적으로 유체 유체의 흐름에 따라 입자 트래핑 및 조작을위한 새로운 microfluidic 기반 기술을 소개합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 오랫동안 비늘을위한 수성 솔루션 마이크로 및 나노 스케일 입자의 트래핑 보여줍니다. 유체 트랩은 두 반대 층류 흐름은 따라서 유체 침체 포인트 (제로 속도 포인트)와 평면 extensional 흐름을 생성, 모이 교차 슬롯 채널 기하학과 통합 microfluidic 장치로 구성되어 있습니다. 이 장치에서는, 입자는 유체 정체 지점에 입자의 위치를​​ 유지하기 위해 유량 분야의 적극적인 제어에 의해 트랩 센터에 국한되어있다. 이러한 방식으로, 입자가 효과적으로 맞춤식 LabVIEW 코드로 구현 피드백 제어 알고리즘을 사용하여 무료로 솔루션에 갇혀있다. 제어 알고리즘은 입자 추적, 입자 중심 위치를 결정하고, 압력 조절기를 사용하여 온 칩 공압 밸브에 적용되는 압력을 조절하여 유체 흐름의 적극적인 조정에 의해 다음 microfluidic 장치에 입자에 대한 이미지 수집 구성되어 있습니다. 이런 방식으로, 온 칩 동적 미터링 밸브 기능함으로써 침체 지점 위치 및 입자 트래핑의 미세 규모의 제어를 가능하게, 아울렛 채널의 상대적인 흐름 속도를 조절합니다. microfluidic 기반 유체 입자 트랩은 트래핑을위한 방법으로 몇 가지 장점을 전시하고 있습니다. 유체 트래핑은 덫을 객체의 물리적 또는 화학적 성질에 대한 특정 요구 사항없이 임의의 입자 가능합니다. 또한, 유체 트래핑 대체 인력 분야 기반 트래핑 방법을 사용하여 어려운 농축이나 붐비는 입자 suspensions에서 "하나의"대상 개체의 감금 수 있습니다. 유체 함정 구현하는 사용자 친화적인, 간단하고 입자의 트래핑과 긴 시간 분석을 촉진하기 위하여 기존의 microfluidic 장치에 추가할 수 있습니다. 전체 유체 함정 감금, 미세 조작 및 표면 고정하지 않고 입자의 관찰을위한 새로운 플랫폼입니다 작은 입자의 자유 솔루션 트래핑에 잠재적으로 섭동의, 광학 자성, 전기 분야에 대한 필요가 없습니다.

프로토콜

유체 입자 트랩은 감금에 대한 두 계층 하이브리드 (polydimethylsiloxane (PDMS) / 유리) microfluidic 장치로 구성되어 있습니다. 단계 1-2 microfluidic 장치의 제조를 설명하고, 3-4 토론 장치 설계 및 운영 단계를 반복합니다.

1. SU - 8 몰드 제작 (비디오에 표시되지 않음)

1. 아세톤과 이소 프로필 알코올 (IPA) 두 개의 실리콘 웨이퍼 (3 "직경) 닦으십시오.
2. N ₂ ° C 1 분에 대한 잔류 수분을 제거하는 65 열판 그들을 이곳 건조 웨이퍼.
3. 유체 레이어 ~ 40 μm의 두께 금형을 만들 수 4,000 rpm으로 30 초에 대한 SU - 8 2050 포토 레지스트 (PR)와 코트 웨이퍼 # 1 스핀. 컨트롤 레이어 ~ 150 μm의 두께가 금형을 만들 수 1,500 rpm으로 30 초에 대한 홍보와 함께 코트 웨이퍼 # 2를 스핀.
4. 소프트 베이킹 웨이퍼 65 # 1 ° 95에서 다음 3 분 및 ° 6 분 C에 대한 C. 65 소프트 베이킹 웨이퍼 # 2 ° C 95에서 다음 5 분 및 대한 ° C 20 분.
5. 적절한 노출 강도 (~ 150 MJ / cm ^2, ~ 260 MJ / cm ² 각각) 해당 마스크 (: 포트와 유체 채널, 웨이퍼 # 2 포트와 제어 계층 웨이퍼 # 1)과 UV에 웨이퍼를 노출.
6. 65 포스트 빵을 웨이퍼 # 1 ° 95에서 다음 1 분 및 ° 6 분 C에 대한 C. 65 포스트 빵을 웨이퍼 # 2 · 95에서 다음 5 분 및 들면 C ° 10 분 C.
7. uncured PR 제거 때까지 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)과 웨이퍼를 개발할 수 있습니다. IPA와 N _2와 건조와 웨이퍼를 씻어.

2. Microfluidic 장치 제작

1. trichlorosilane 몇 방울을 포함하는 유리 접시와 함께 ~ 10 분 진공 아래 건조기에서 웨이퍼를 배치하여 SU - 8 금형의 표면을 Silanize. 표면 silanization은 SU - 8 금형 해제 (PDMS) 복제본을 필링에 도움이됩니다.
2. 자료의 믹스와 데가스 PDMS : 유체 및 제어 계층 각각에 대한 15시 1분 및 5시 1분의 비율 crosslinker.
3. 750 rpm으로 30 초에 대한 유체 층 금형 (웨이퍼 # 1)에 코팅에게 15시 1분 PDMS 혼합물을 스핀 다음 페트리 접시에 웨이퍼를 놓습니다. 페트리 접시로 제어 계층 금형을 놓고 ~ 4 mm의 두께로 금형에 5시 1분 PDMS 혼합물을 따라줘.
4. 70 30 분 구워 웨이퍼 / PDMS ° C 부분적으로 PDMS 레이어를 치료합니다.
5. 상온에 웨이퍼 / PDMS를 냉각 후, SU - 8 곰팡이에서 메스와 껍질로 페트리 접시에서 제어 계층 (웨이퍼 # 2) 형성됩니다 PDMS 복제를 절단. 홀 펀치 21 게이지 바늘로 온 칩 막 밸브 역할을 것이라는 microchannel에 액세스 포트.
6. 웨이퍼 # 1 (스핀 - 코팅 PDMS 유체 층을 가지고있는)로 제어 계층과 함께 PDMS 복제를 놓습니다. 조심스럽게 정렬 및 스테레오 현미경을 사용하여 유체 레이어 제어 레이어를 밀봉. 70 레이어와 빵을 사이의 모든 공기 주머니를 제거하십시오 ° C 완전히 두 레이어를 치료하기 위해 하룻밤. 이 베이킹 단계는 두 레이어가있는 단일 PDMS의 슬래브가 발생합니다.
7. 메스를 사용하여 컨트롤 및 SU - 8 몰드에서 유체 레이어 모두를 포함하는 실내 온도, 잘라내기, PDMS 복제 껍질을 냉각 후. 초과 PDMS를 제거하고 면도날 각 장치 단위를 구분합니다. 21 게이지 바늘로 유체 레이어 microchannels에 구멍 펀치를 액세스 포트.
8. coverslip에 본드는 PDMS의 슬래브 완벽한 장치를 얻을 수 있습니다. 아세톤과 IPA로 첫째, coverslip을 (1.5, 24 X 45mm 없음) 청소하십시오. 다음, 30 초 500 mTorr에서 coverslip 및 산소 플라즈마와 PDMS 복제 표면을 모두 처리하고, 즉시 돌이킬 수없는 인감을 형성 문의에 두 표면을 가지고.
9. PDMS의 레이어와 coverslip 사이의 결합을 증가 하룻밤 장치를 구워.

단계 3-4 위에서 설명한 microfluidic 장치를 사용하여 유체 트랩을 구현 설명합니다.

3. 유체 실험 트랩 설치

1. 거꾸로 현미경의 무대에 microfluidic 장치를 무대 클립을 확보.
2. 버퍼와 샘플 솔루션을 별도로 둘 가스 기밀 주사기를 기입하고 하버드 장치 주사기 펌프 (PHD 2000 프로그램)에 그들을 놓으십시오. 버퍼와 샘플 솔루션은 각각 1 ML와 250 μl 주사기를 통해 microfluidic 장치에 전달됩니다. 일반적으로, 50 MM 트리스 / 트리스 HCL 버퍼 솔루션 (산도 8.0) V / V 트리톤은 X - 100은 버퍼 솔루션으로 사용되는 0.02 %를 포함. 샘플 솔루션은 버퍼 솔루션의 입자 현탁액 (예 : 형광 폴리스티렌 구슬)으로 구성되어 있습니다.
3. 주사기 (예제와 버퍼를 전달) 및 microfluidic 장치 사이의 유체 연결을 설정합니다. luer 잠금 어댑터를 사용 (ID) perfluoroalkoxy (PFA) 튜브 16분의 1 "외경 (OD) × 0.020 '내경에 주사기를 연결합니다. 24 게이지 메타로 microfluidic 장치의 입구 포트 PFA 튜빙의 다른 쪽 끝을 연결합니다내 튜빙. T - 밸브 샘플 배달을 제어하기 위해 microfluidic 장치의 샘플 주사기 및 샘플 포트 사이에 위치 수 있습니다.
4. microfluidic 장치에서 아울렛 채널에 대한 유체 연결을 설정합니다. 24 게이지 금속 튜브를 사용하여 PFA 튜빙 (1 / 16 "OD X 0.020"ID)에 두 개의 콘센트에 채널을 연결합니다. 콘센트에 대한 PFA 튜빙은 동등한 길이의해야합니다. 주사기 및 아울렛 채널 사이에 일정한 압력 강하를 유지하는 역할을 버퍼 솔루션으로 가득 1.5 ML의 원심 관에 잠수함 아울렛 튜브 모두.
5. 작업하는 동안 유체 층에 누설에서 공기를 방지하기 위해 3 ML luer 잠금 플라스틱 주사기를 사용하여 플루오르 캐리어 오일과 함께 온 - 칩 밸브를 입력합니다. 밸브 챔버에서 공기가 유체 층에서 microchannel에 PDMS 막 끝까지 해냈고 이후 아울렛 포트를 통해 유체 흐름과 장치에서 제거됩니다.
6. 온칩 밸브 작동에 대한 컨트롤 레이어에있는 포트에 압력 불활성 가스 (질소) 공급 장치를 연결합니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 질소 탱크 (2200 PSI)와 microfluidic 장치에서 온 - 칩 밸브 00-30 PSI를 제공하는 전자 압력 조절기를 사용합니다. 질소 탱크는 ¼ "OD X 0.170"ID 튜빙을 사용하여 압력 조절기에 연결됩니다. 압력 조절은 그 터미 너스 24 게이지 금속 튜브 1 / 16 "OD X 0.020"ID PFA 튜빙을 통해 microfluidic 장치에 연결되어 있습니다.
7. 모든 기포가 콘센트에 채널을 포함하여 시스템에서 제거되는 것을 보장하기 위해 버퍼 솔루션 0.5 ML로 유체 연결 및 microfluidic 장치를 씻어. 2000-5000 μL / HR 사이에 거품이 범위를 삭제에 사용되는 일반적인 유량. 공기 방울이 microfluidic 채널 밖으로 씻어서 후, 입자 트래핑에 대한 전형적인 용적식 속도는 50-100 μL / HR에 흐름 속도를 줄일 수 있습니다.
8. 이 시점에서, 유체 연결, 샘플을 설립하고 버퍼 솔루션은 고정 유량 (50-100 μL / HR)에서 microfluidic 장치에 전달되며, 장치는 유체 트래핑 준비가되었습니다.

4. 유체 트래핑 절차

1. 입자 트래핑을 자동화 맞춤식 LabVIEW 코드를 (아래에 LabVIEW 코드를 사용 참고를 참조)를 실행합니다.
2. 카메라보기의 중앙에 현미경의 XY 번역 단계, 위치에게 트래핑 지역 (크로스 - 슬롯)를 사용합니다. 목적 렌즈의 초점으로 트래핑 지역을 지참 및 이미징 조건을 최적화하기위한 카메라 설정을 조정합니다.
3. 투자 수익 (ROI)의 중심이 트랩 중심의 위치 것입니다 이러한보기의 카메라의 입력란 내의 관심이 직사각형 영역 (ROI)을 선택합니다.
4. 온칩 밸브에 적용된 오프셋 압력을 초기화합니다. 콘센트 채널 중 하나에서, 100-200 μm의 넓은 수축은 온 - 칩 밸브에 대한 오프셋 압력을 제공하기 위해 도입되었습니다. 일정한 오프셋 압력은 채널 간 슬롯의 중심 부근에서 정체 지점의 위치를​​ 조정하는 온 - 칩 밸브 수 있습니다. 대부분의 실험은 오프셋 압력이 채널 크기 (높이와 넓이), 수축 폭 및 온칩 밸브 (밸브 크기, 막 두께 등)의 사양에 따라 0-12 PSI 사이에 설정됩니다.
5. 피드백 컨트롤러를 시작하고 트랩 응답을 최적화하기 위해 비례 게인을 조정합니다. 피드백 컨트롤러는 입자의 위치와 세트 포인트 (트랩 센터) 사이의 오류 또는 거리를 최소화 정체 지점 위치를 이동하기 위해 온 칩 밸브에 적용되는 압력을 조정합니다. 유속 및 온칩 밸브 위치에 따라 트랩 안정성을 증가하고 원하지 않는 입자 oscillations를 제거하는 최적의 비례 게인 값이있다.
6. 입자 트랩. LabVIEW 코드 자동 트래핑 지역을 입력 입자 중 하나를 함정 것입니다. 원하는 입자가 갇혀되면, 그것은 원하는 경우, 샘플의 흐름을 차단하고 버퍼 솔루션에 갇힌 입자를 분리하는 것이 가능합니다.
7. 함정 입자를 모니터링하고 수동 초점이나 자동 초점 현미경 설치 프로그램을 사용하여 이미지 비행기 내에서 입자 초점을 유지합니다. 그것은 약간 긴 시간 규모 트래핑 이벤트 (시간 분)의 과정 중에 트랩의 안정성을 보장하기 위해 피드백 컨트롤러의 비례 게인을 조정해야 할 수도 있습니다.

LabVIEW 코드 : 피드백 컨트롤러에 대한 사용주의

자동 입자 트래핑은 사용자 정의 LabVIEW 코드를 사용하여 구현 선형 피드백 제어 알고리즘을 사용하여 이루어진다. LabVIEW 코드는 CCD 카메라에서 이미지를 캡처하고 적극적으로 온 칩 동적 공압 밸브의 위치를​​ (부분적으로 개방 / 폐쇄 상태) modulates 압력 레귤레이터에 전위를 (전압) 전송합니다. 으로 밸브 위치 변경 한 콘센트 라인에서 유체 유량 IS는이를 침체 지점을 다시 위치 및 유체 트래핑을 지원, 조정. 피드백 루프의 단계는 순차적으로하고 반복 이미지 캡처 (10-60 Hz에서)의 속도로 실행. LabVIEW 코드는 각각의 피드백 루프주기 동안 다음 단계를 실행합니다 :

• .와 CCD 카메라 : 이미지 캡처 이미지 10X 목적 렌즈와 형광 현미경을 사용하여 microfluidic 장치의 트래핑 지역의 "대상"입자 (0.4 NA)에 대한 인수입니다.
• 입자 추적. 입자 중심 위치가 결정되며, 입자 추적 알고리즘은 시작됩니다. 입자가 중심 위치가 결정하는 점 확산 함수 (PSF)에 대한 입자의 방출 강도 프로필을 피팅하여 현지 있습니다.
• 흐름 필드 컨트롤. 온칩 동적 밸브위한 업데이트된 압력은 비례 컨트롤러와 피드백 제어 알고리즘을 사용하여 계산됩니다. 이러한 방법으로, 밸브의 동작은 트랩 중심 방향으로 입자를 조종하기 위해 입자의 유체 력을 미치는 침체 지점을 다시 위치입니다.

LabVIEW 코드는 트래핑 입자 동안 촬영된 모든 이미지에 대해 다음과 같은 데이터를 기록합니다 : 1) 시간) 중심 (갇힌 입자, 3 X, Y) 위치) 트랩 센터의 위치, 4, 2 경과) 입자의 거리에서 트랩 센터, 5) 압력은 온 - 칩 밸브에 적용. 또한, 코드는 AVI 파일 형식으로 갇힌 입자의 동영상을 기록합니다.

5. 대표 결과

우리는 유체 트랩을 사용하여 다양한 크기 (100, 540, 830 NM, 그리고 2.2 μm의 직경)의 형광 폴리스티렌 비즈를 두었다. 그림 1 (A)는 microfluidic 장치에서 교차 슬롯 교차점에 갇혀 입자의 이미지를 보여줍니다. 갇힌 입자의 궤도는 트래핑 이벤트 중 또는 기록된 동영상 파일에서 갇힌 입자를 추적하고 현지화하여 LabVIEW 코드 기록된 중심 위치 데이터에서 직접 확인할 수 있습니다. 그림 1 (B)는 아울렛 채널 방향을 따라 갇힌 입자 (2.2 μm의 형광 폴리스티렌 비드)의 궤도를 보여줍니다. 비드는 처음 3 분 (사각형) 갇혀 후 콘센트 채널 (원) 중 하나를 택해 트랩과 탈출에서 배포되고 있습니다. compressional 흐름 축 (유입 채널 방향, 데이터가 표시되지 않음)을 따라 입자의 궤도는 그림 1 (B)에 표시된 extensional 흐름 축 (유출 방향)을 따라 입자의 탄도 비슷합니다. 콘센트 채널 방향을 따라 덫에 구슬 (2.2 μm의 직경)에 대한 트랩 센터에서 입자 변위의 히스토그램은 그림 1 (C)로 표시됩니다. 이 작품에서 설명하는 피드백 제어 알고리즘을 사용하여 갇힌 입자는 입구와 출구 채널 방향을 따라 트랩 센터의 ± 1 μm의 사이에 국한되어 있습니다.

유체 트래핑에 사용되는 microfluidic 장치의 개략도는 그림 2에 표시됩니다. 통합 microfluidic 장치는 유체 층과 제어 레이어로 구성되어 있으며,이 문서에서 설명하는 표준 다층 소프트 리소그래피를 사용하여 조작합니다. 유체 층의 버퍼와 샘플 채널뿐만 아니라 유체 트래핑을 촉진하기 위해 교차 슬롯 채널 기하학을 포함하고 있습니다. 제어 계층은 유체 층에서 아울렛 채널 중 하나 이상의 위치 공압 밸브의 구성되며, 제어 및 유체 층이 얇은 탄성 막로 구분됩니다. 장치 작동하는 동안 컨트롤 레이어에있는 밸브는이를 콘센트 채널의 수축을 유도, 유체 층에 얇은 막을 강제로 질소 가스와 압력이다. 동적 공압 밸브는 콘센트 채널의 상대적인 흐름 속도를 조정하고 정체 지점의 미세 규모의 제어를 가능하게 제어 계층에 적용되는 압력을 변경하여 변수 금액으로 콘센트에 채널을 수축.

그림 1 : 입자 트래핑. (A) 한 구슬의 이미지가 유체 함정에 감금. 트랩 센터에서 비드 이외에 몇 가지 untrapped 구슬이 트래핑 영역에 표시됩니다. 콘센트 채널 (사각형) 함께 갇힌 입자의 (B) 탄도. 입자가 트랩 (화살표)에서 출시되면, 그것은 콘센트 채널 (원) 중 하나를 택해 탈출. (C) 콘센트 채널을 따라 트랩 센터에서 덫에 구슬 (2.2 μm의 직경)의 변위의 히스토그램.

그림 2. 유체 트래핑을위한 microfluidic 장치의 도식은 유체 트랩은 두 계층 microfluidic 장치를 사용하여 구성되어 있습니다. 유체 레이어 샘플 입구, F로 구성되어 있습니다우리 버퍼 인레츠, 두 폐기물 콘센트. 제어 계층은 유체 층에서 아울렛 채널 중 하나 위에 위치한 공기 막 밸브로 구성되어 있습니다. 반대 아울렛 채널의 수축은 공압 밸브에 대한 오프셋 압력을 제공합니다. 일반 채널 크기는 100-500 μm의 사이의 범위. 지역 (A), 샘플 입구는 두 버퍼 인레츠으로 초점을 맞추고 흐름입니다. 지역 (B), 반대 유입 스트림 트래핑가 발생 교차 슬롯 교차점에 수렴. 공압 밸브 (C)은 아울렛 채널 중 하나의 맨 위에 배치됩니다. 침체 지점 위치는이 밸브에 압력을 조절하여 변조된 수 있습니다.

토론

유체 흐름에 따라 입자의 조작에 대한 현재 microfluidic 방식은 문의 - 기반 또는 비 접촉 방식으로 특징 수 있습니다. 비 - 연락 방법이 흐름이나 microeddies ¹⁰ 순환에 의존하는 반면, 연락처 기반의 방법은, 물리적 경계 및 microfabricated 채널 벽면 ^구에 대한 입자를 고정하기 위해 유체 흐름을 사용합니다. 이 작품에서 우리는 유체 흐름의 단독 작업을 사용하여 자유 솔루션 입자 트래핑?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 gauge blunt needle	Zephyrtronics	ZT-5-021-1-L	For punching port holes in PDMS
3 ml plastic syringe	BD Biosciences	309585	For filling valve with oil
Si wafers	University Wafer		3” P(100) single side polished 380 μm test grade
Cover glass	VWR international	48404-428	24 x 40 mm #1.5
DAQ card	National Instruments	PCI 6229
Fluorescent beads	Spherotech, Inc.	FP-2056-2	2.2 μm Nile red
Fluorinert	3M	FC 40	Fluorinated carrier oil
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71
LabVIEW	National Instruments	Version 9.0f3 (32bit)
Stereo Microscope	Leica Microsystems	MZ6	For aligning PDMS control layer to fluidic layer.
Mechanical Convection Oven	VWR international	1300U	For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers.
Microfluidic tubing and connectors	Upchurch Scientific		1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings
PDMS	GE Healthcare	RTV 615 A&B
Plasma Chamber	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Pressure Transducer	Proportion Air	DQPV1
Spin Coater	Specialty Coating Systems	G3P-8 Spin Coat
Photoresist	MicroChem Corp.	SU 8 2050
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD 2000 Programmable
Terminal Block	National Instruments	BNC 2110	For analog output to pressure regulator and read out.
UV Collimated Light Source and Exposure System	OAI	Model 30 Enhanced Light Source