A Armadilha hidrodinâmica microfluídicos baseados em partículas individuais

Resumo

Neste artigo, apresentamos um método baseado em microfluídicos para o confinamento de partículas com base no fluxo hidrodinâmico. Demonstramos prendendo partículas estáveis ​​em um ponto de estagnação de fluidos utilizando um mecanismo de controle feedback, permitindo assim confinamento e micromanipulação de partículas arbitrário em um microdispositivo integrado.

Resumo

A capacidade de limitar e manipular partículas individuais em solução livre é uma tecnologia capacitadora essencial para a ciência fundamental e aplicada. Métodos para a captura de partículas baseado em técnicas ópticas, magnéticas eletrocinética, e acústico têm levado a grandes avanços na física e na biologia molecular que vão desde o de nível celular. Neste artigo, apresentamos uma técnica nova baseada microfluídicos para a captura e manipulação de partículas com base exclusivamente no fluxo de fluido hidrodinâmico. Usando este método, nós demonstramos aprisionamento de partículas micro e nano-escala em soluções aquosas para escalas de tempo. A armadilha hidrodinâmicas consiste de um dispositivo integrado microfluídicos com uma geometria do canal cruz-slot onde duas correntes opostas laminar convergir, gerando um fluxo extensional planar com um ponto de estagnação do fluido (velocidade zero pontos). Neste dispositivo, as partículas estão confinadas no centro armadilha por controle ativo do campo de fluxo para manter a posição da partícula no ponto de estagnação do fluido. Desta forma, as partículas são efetivamente presos em solução livre usando um algoritmo de controle de feedback implementado com um código LabVIEW custom-built. O algoritmo de controle consiste de aquisição de imagem para uma partícula no dispositivo micro, seguido pelo rastreamento de partículas, a determinação da posição da partícula centróide e ajuste ativo de fluxo de fluido através da regulação da pressão aplicada a uma válvula pneumática on-chip usando um regulador de pressão. Desta forma, o on-chip funções da válvula de medição dinâmica para regular as taxas de fluxo relativa nos canais de saída, permitindo fina escala de controle de posição estagnação ponto e captura de partículas. A armadilha hidrodinâmico microfluídicos baseados apresenta várias vantagens como um método para a captura de partículas. Trapping hidrodinâmica é possível para qualquer partícula arbitrária sem requisitos específicos sobre as propriedades físicas ou químicas do objeto preso. Além disso, prendendo hidrodinâmica permite o confinamento de um objeto alvo "single" de partículas em suspensões concentradas ou lotado, o que é difícil usar a força métodos alternativos baseada em campo com armadilhas. A armadilha hidrodinâmico é user-friendly, fácil de implementar e pode ser adicionado ao existente dispositivos microfluídicos para facilitar a análise de captura e de longa data de partículas. No geral, a armadilha hidrodinâmica é uma nova plataforma para o confinamento, micromanipulação, e observação de partículas, sem a imobilização de superfície e elimina a necessidade de potencialmente perturbativos campos ópticas, magnéticas e elétricas no aprisionamento solução livre de partículas pequenas.

Protocolo

A armadilha consiste em uma hidrodinâmica de duas camadas híbridas dispositivo (PDMS (polidimetilsiloxano) / vidro) microfluídicos para confinamento de partículas. Os passos 1-2 descrevem a fabricação de dispositivos microfluídicos e Passos projeto de dispositivos 3-4 discutir e operação.

1. SU-8 Fabricação Mold (não mostrado no vídeo)

1. Limpe duas lâminas de silício (3 "de diâmetro) com acetona e álcool isopropílico (IPA).
2. Bolachas secas com N ₂ e colocá-los numa placa de aquecimento a 65 ° C por 1 min para remover a umidade residual.
3. Spin-coat wafer # 1 com SU-8 2050 fotorresiste (PR) por 30 segundos a 4000 rpm para criar um molde de ~ 40 mm de espessura para a camada fluídica. Spin-coat wafer # 2 com PR por 30 segundos a 1500 rpm para criar um molde de ~ 150 mm de espessura para a camada de controle.
4. Wafer bake macio # 1 a 65 ° C por 3 min e depois a 95 ° C por 6 min. Wafer bake macia # 2 a 65 ° C por 5 min e depois a 95 ° C por 20 min.
5. Expor wafers de UV com suas respectivas máscaras (wafer # 1: portos e canais fluídicos, wafer # 2: port e camada de controle) e intensidade de exposição adequado (~ 150 mJ / cm ^2, ~ 260 mJ / cm ^2, respectivamente).
6. Pós bake wafer # 1 a 65 ° C por 1 min e depois a 95 ° C por 6 min. Pós bake wafer # 2 a 65 ° C por 5 min e depois a 95 ° C por 10 min.
7. Desenvolver placas com propileno glicol éter acetato de metila (PGMEA) até que não curado PR é removido. Enxágüe com wafers IPA e seque com N _2.

2. Fabricação de dispositivos microfluídicos

1. Silanizadas a superfície do SU-8 moldes colocando as bolachas em um dessecador sob vácuo para ~ 10 min com um prato de vidro, contendo algumas gotas de triclorosilano. Silanização da superfície auxilia na descascar as réplicas (PDMS) fora dos moldes SU-8.
2. Misture e degas PDMS na base: relações reticulador de 15:1 e 5:1 para o fluídica e camadas de controle, respectivamente.
3. Spin-coat a mistura PDMS 15:01 no molde camada fluídica (wafer # 1) por 30 segundos a 750 rpm e em seguida, coloque a bolacha em uma placa de Petri. Coloque o molde camada de controle em uma placa de Petri e despeje a mistura 05:01 PDMS no molde a uma espessura de ~ 4 mm.
4. Wafers assar / PDMS por 30 min a 70 ° C para curar parcialmente as camadas PDMS.
5. Após esfriar o wafers / PDMS à temperatura ambiente, corte a réplica PDMS, que irá formar a camada de controle (wafer # 2), a partir da placa de Petri com um bisturi e retire-a do molde SU-8. Perfurar uma porta de acesso ao microcanais que atuará como a válvula de membrana em-chip com uma agulha de calibre 21.
6. Lugar a réplica PDMS com a camada de controle sobre o wafer # 1 (que tem o spin-revestido PDMS camada fluídica). Alinhe cuidadosamente e selar a camada de controle para a camada fluídica usando um microscópio estéreo. Certifique-se de remover todas as bolsas de ar entre as camadas e leve ao forno a 70 ° C durante a noite para curar completamente as duas camadas. Esta etapa de cozimento irá resultar em uma laje de PDMS monolítico com duas camadas.
7. Após o resfriamento à temperatura ambiente, cortar e descascar a réplica PDMS contendo tanto o controle e as camadas fluídicas fora do SU-8 molde com um bisturi. Retire o excesso e separar PDMS cada unidade dispositivo com uma lâmina de barbear. Furador portas de acesso para os microcanais na camada fluídica com uma agulha de calibre 21.
8. Ligação da laje do PDMS a uma lamela para obter um dispositivo completo. Primeiro, limpe uma lamela (No: 1.5, 24 x 45 mm) com acetona e IPA. Em seguida, tratar tanto a lamela e as superfícies PDMS réplica com plasma de oxigênio abaixo de 500 mTorr por 30 segundos e, imediatamente, levar as duas superfícies em contato para formar um selo irreversível.
9. Asse os dispositivos durante a noite para aumentar a adesão entre as camadas de PDMS ea lamela.

Descrever os passos 3-4 implementação da armadilha hidrodinâmico usando o dispositivo micro descrito acima.

3. Setup Armadilha hidrodinâmico Experimental

1. Coloque o dispositivo microfluídicos para o palco de um microscópio invertido e prenda com grampos palco.
2. Encher dois à prova de gás seringas separadamente com soluções tampão e amostra e colocá-los em uma bomba de seringa Harvard Apparatus (PHD 2000 Programável). O buffer e as soluções da amostra são entregues ao dispositivo micro através de um 1 ml e uma seringa de 250 L, respectivamente. Tipicamente, a 50 mM Tris / HCl solução tampão Tris (pH 8,0) contendo 0,02% v / v Triton X-100 é usado como solução tampão. A solução da amostra é constituída por uma suspensão de partículas (por exemplo, esferas de poliestireno fluorescente) na solução tampão.
3. Estabelecer as conexões entre as seringas fluídico (entregar a amostra eo buffer) eo dispositivo microfluídicos. Conectar as seringas para 1 / 16 "de diâmetro externo (OD) x 0,020" de diâmetro interno (ID) perfluoroalcoxi tubo (PFA) usando adaptadores luer-lock. Ligue a outra extremidade do tubo de PFA para os portos de entrada do dispositivo micro com 24 meta avaliarl tubulação. A T-válvula pode ser colocado entre a seringa amostra eo porta amostra no dispositivo microfluídicos para controlar a entrega da amostra.
4. Estabelecer as ligações fluídico para os canais de saída no dispositivo microfluídicos. Conectar os dois canais de saída para tubos de PFA (1 / 16 "OD x 0.020" ID), utilizando 24 tubos de metal calibre. A tubulação PFA para as tomadas devem ser de igual comprimento. Tubos submergir ambas tomada em um tubo de centrífuga de 1,5 mL preenchido com solução tampão, que serve para manter uma queda de pressão constante entre as seringas e os canais de saída.
5. Encha a válvula on-chip com transportadora de petróleo fluorados usando uma seringa de plástico 3 mL luer-lock para impedir que o ar vaze para a camada fluídica durante a operação. O ar na câmara de válvula é empurrado através da membrana PDMS no microcanais na camada fluídica e, posteriormente, removido do dispositivo com o fluxo do fluido através das portas de saída.
6. Conectar um gás inerte sob pressão de alimentação (nitrogênio) para a porta na camada de controle on-chip para operação da válvula. Para este fim, usamos um tanque de nitrogênio (2200 psi) e um regulador de pressão eletrônico para o fornecimento 0-30 psi à válvula on-chip no aparelho microfluídicos. O tanque de nitrogênio é ligado ao regulador de pressão utilizando ¼ "OD x 0,170" tubo de ID. O regulador de pressão é conectado ao dispositivo micro através de 1 / 16 "OD x 0.020" ID tubulação PFA com 24 tubos de metal calibre em seu término.
7. Lave as ligações fluídicas eo dispositivo micro com 0,5 mL de solução-tampão para garantir que todas as bolhas de ar são removidas do sistema, incluindo os canais de saída. Típicas taxas de fluxo usado para limpar faixa de bolhas entre 2000-5000 mL / hr. Após as bolhas de ar são lavados para fora dos canais microfluídicos, reduzir a taxa de fluxo de 50-100 mL / h, que é uma taxa de fluxo volumétrico típico para a captura de partículas.
8. Neste ponto, as conexões são estabelecidas fluídico, a amostra e as soluções tampão são entregues ao dispositivo micro a um fluxo fixo (5-10 mL / hr), e o dispositivo está pronto para capturar hidrodinâmico.

4. Procedimento Trapping hidrodinâmica

1. Executar o custom-built código LabVIEW, que automatiza armadilhas de partículas (ver nota de Utilização de LabVIEW código abaixo).
2. Usando o microscópio xy tradução estágio posição, a região captura (cross-slot) no centro da visão da câmera. Traga a região armadilhas em foco da lente objetiva e ajustar as configurações da câmera para otimizar as condições de imagem.
3. Escolha uma região retangular de interesse (ROI) dentro do campo da câmera de vista de tal forma que o centro do ROI será a posição do centro armadilha.
4. Inicializar a pressão compensada aplicada à válvula on-chip. Em um dos canais de saída, uma constrição mM 100-200 gama é introduzida para fornecer uma pressão de deslocamento para a válvula on-chip. A pressão de off-set constante permite a válvula on-chip para ajustar a posição do ponto de estagnação nas imediações do centro do canal cruz-slot. Para a maioria dos experimentos, a pressão de deslocamento é ajustada entre 0-12 psi dependendo das dimensões do canal (altura e largura), a largura da constrição, e as especificações da válvula on-chip (tamanho da válvula, a espessura da membrana, etc.)
5. Iniciar o controlador de feedback e ajustar o ganho proporcional para otimizar a resposta armadilha. O controlador de realimentação irá ajustar a pressão aplicada à válvula on-chip, a fim de mover a posição de ponto de estagnação, o que minimiza o erro ou a distância entre a posição da partícula eo ponto de ajuste (centro armadilha). Dependendo do caudal e da posição da válvula on-chip, existe um valor de ganho proporcional ideal, o que aumenta a estabilidade armadilha e elimina oscilações de partículas indesejadas.
6. Armadilha uma partícula. O código de LabVIEW automaticamente armadilha uma das partículas que entram na região de captura. Uma vez que uma partícula desejado está preso, é possível desligar o fluxo da amostra e isolar a partícula presa em solução tampão, se desejar.
7. Monitorar a partícula preso e manter o foco de partículas dentro do plano da imagem usando foco manual ou um microscópio de configuração automática de foco. Pode ser necessário ajustar um pouco o ganho proporcional do controlador de realimentação, a fim de assegurar a estabilidade armadilha durante o curso de um evento de captura longa escala de tempo (minutos a horas).

Código LabVIEW: Nota de Utilização de Controlador de comentários

Captura de partículas automatizado é obtida utilizando um algoritmo de controle de feedback linear implementado usando um código LabVIEW personalizado. O código de LabVIEW capta imagens de uma câmera CCD e transmite um potencial elétrico (tensão) a um regulador de pressão, que modula a posição ativa (estado parcialmente aberto / fechado) de uma válvula pneumática on-chip dinâmico. Como a válvula muda de posição, a taxa de fluxo hidrodinâmico em uma linha de saída is ajustado, assim, re-posicionar o ponto de estagnação e permitindo captura hidrodinâmico. As etapas do ciclo de feedback são seqüencialmente e iterativamente executado a uma taxa de captura de imagens (10-60 Hz). O código de LabVIEW executa os seguintes passos durante cada ciclo de retroalimentação:

• . Captura de imagem Uma imagem é adquirida por um "target" de partículas na região de captura do dispositivo micro usando microscopia de fluorescência com uma lente objetiva de 10x (NA: 0,4) e uma câmera CCD.
• Rastreamento de partículas posição centróide. Partículas é determinado, eo algoritmo de rastreamento de partículas é iniciada. Partículas são localizados pela montagem do perfil de intensidade de emissão da partícula para uma função propagação do ponto (PSF), a partir do qual a posição do centróide é determinado.
• Controle de fluxo de campo. A pressão atualizados destinado a válvula on-chip dinâmico é calculado utilizando um algoritmo de controle de feedback com um controlador proporcional. Desta forma, a ação da válvula é a re-posicionar o ponto de estagnação, que exerce uma força hidrodinâmica sobre a partícula, a fim de orientar a partícula em direção ao centro armadilha.

O código de LabVIEW registra os seguintes dados para cada imagem capturada durante a captura de partículas: 1) o tempo decorrido, 2) centróide (x, y de posição) da partícula presa, 3) posição do centro armadilha, 4) a distância da partícula do pressão armadilha centro, 5) aplicada à válvula on-chip. Além disso, o código também grava um filme da partícula preso em formato de arquivo AVI.

5. Resultados representante

Nós preso esferas de poliestireno fluorescentes de vários tamanhos (100, 540, 830 nm, diâmetro e 2,2 mm) usando uma armadilha hidrodinâmico. Figura 1 (a) mostra uma imagem de uma partícula presa na junção cruzada slot-in um dispositivo micro. A trajetória de uma partícula presa pode ser determinada diretamente a partir dos dados gravados por posição centróide o código LabVIEW durante um evento de captura ou através do rastreamento e localização de uma partícula presa a partir do arquivo de filme gravado. Figura 1 (b) mostra a trajetória de uma partícula presa (2,2 mM fluorescentes poliestireno talão) ao longo da direção do canal de saída. O talão é inicialmente preso (quadrados) por 3 min e depois é liberado da armadilha e foge junto a um dos canais de saída (círculos). Trajetórias de partículas ao longo do eixo de compressão de fluxo (direção do canal de entrada; dados não mostrados) são semelhantes às trajetórias de partículas ao longo do eixo do fluxo extensional (direção de saída), como mostrado na Figura 1 (b). Um histograma de deslocamento de partículas do centro da armadilha para um cordão preso (2,2 de diâmetro mm) ao longo das direções do canal de saída é mostrado na Figura 1 (c). Usando o algoritmo de controle de feedback descrito neste trabalho, as partículas presas estão confinados dentro de ± 1 mícron do centro da armadilha ao longo do canal de entrada e saída de direções.

Um esquema do dispositivo micro usado para capturar hidrodinâmico é mostrado na Figura 2. O dispositivo integrado microfluídicos consiste de uma camada fluídica e uma camada de controle e é fabricada utilizando litografia de multicamadas padrão suave como descrito neste artigo. A camada fluídica contém os canais tampão e amostra, bem como a geometria do canal cruz-slot para facilitar a captura hidrodinâmico. A camada de controle consiste em uma válvula pneumática posicionados acima de um dos canais de saída na camada fluídica, eo controle e camadas de fluidos são separados por uma membrana elastomérica fina. Durante a operação do dispositivo, a válvula na camada de controle é pressurizado com gás nitrogênio, o que obriga a fina membrana na camada fluídica, induzindo uma constrição no canal de saída. A válvula pneumática dinâmica contrai o canal de saída por quantidades variáveis, alterando a pressão aplicada na camada de controle, que ajusta as taxas de fluxo relativo na tomada de canais e permite fina escala o controle do ponto de estagnação.

Figura 1: Trapping de partículas. (A) Imagem de um talão única confinada na armadilha hidrodinâmico. Além do talão no centro armadilha, várias contas untrapped são mostradas na região de captura. (B) Trajetória de uma partícula presa ao longo dos canais de saída (quadrados). Quando a partícula é liberada da armadilha (seta), que escapa ao longo de um dos canais de saída (círculos). (C) Histograma dos deslocamentos de um talão presos (2,2 de diâmetro mm) do centro da armadilha ao longo dos canais de saída.

Figura 2:. Esquemática do dispositivo micro para capturar hidrodinâmica hidrodinâmico A armadilha é construído utilizando um dispositivo de duas camadas microfluídicos. A camada de fluidos consiste de uma entrada da amostra, fnossas enseadas buffer, e duas saídas de resíduos. A camada de controle consiste de uma válvula pneumática de membrana situada no topo de um dos canais de saída na camada fluídica. A constrição no canal de saída opostas fornece uma pressão de deslocamento para a válvula pneumática. Dimensões canal típicos variam entre 100-500 mM. Na região (A), é o fluxo de entrada da amostra focada por duas entradas de buffer. Na região (B), fluxos de entrada de oposição convergem na junção cruzada slot-trapping onde ocorre. A válvula pneumática (C) é posicionado no topo de um dos canais de saída. A posição do ponto de estagnação é modulado pela regulação da pressão a esta válvula.

Discussão

Os métodos atuais de microfluídicos para a manipulação de partículas com base no fluxo hidrodinâmico pode ser caracterizada como métodos baseados em contato ou sem contato. Contato com os métodos baseados em uso de fluxo de fluido para confinar e imobilizar fisicamente partículas contra as paredes do canal microfabricated ^9, enquanto o contato de métodos não dependem de circulação de fluxo ou microeddies ^10. Neste trabalho, apresentamos um método para solução livre de captura de par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 gauge blunt needle	Zephyrtronics	ZT-5-021-1-L	For punching port holes in PDMS
3 ml plastic syringe	BD Biosciences	309585	For filling valve with oil
Si wafers	University Wafer		3” P(100) single side polished 380 μm test grade
Cover glass	VWR international	48404-428	24 x 40 mm #1.5
DAQ card	National Instruments	PCI 6229
Fluorescent beads	Spherotech, Inc.	FP-2056-2	2.2 μm Nile red
Fluorinert	3M	FC 40	Fluorinated carrier oil
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71
LabVIEW	National Instruments	Version 9.0f3 (32bit)
Stereo Microscope	Leica Microsystems	MZ6	For aligning PDMS control layer to fluidic layer.
Mechanical Convection Oven	VWR international	1300U	For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers.
Microfluidic tubing and connectors	Upchurch Scientific		1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings
PDMS	GE Healthcare	RTV 615 A&B
Plasma Chamber	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
Pressure Transducer	Proportion Air	DQPV1
Spin Coater	Specialty Coating Systems	G3P-8 Spin Coat
Photoresist	MicroChem Corp.	SU 8 2050
Syringe Pump	Harvard Apparatus	PHD 2000 Programmable
Terminal Block	National Instruments	BNC 2110	For analog output to pressure regulator and read out.
UV Collimated Light Source and Exposure System	OAI	Model 30 Enhanced Light Source