בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

Summary

בדו"ח זה אנו מתארים שיטה לבידוד והתרבות של נישה הקדמון התא הכליות עכבר עובריים שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מסלולי איתות ויסות גזע / ובתאים של הכליה המתפתחת. אלו תאים בתרבית נגישים מאוד מולקולה קטנה וטיפול חלבון רקומביננטי, והוא חשוב גם התמרה ויראלית, המאפשרת מניפולציה יעילה של המסלולים מועמד.

Abstract

ההתפתחות העוברית של הכליה, נחקרה בהרחבה הן כמודל עבור אינטראקציה אפיתל-mesenchymal ב organogenesis ולקבל בהבנה את מקורותיה של מחלת כליות מולדת. לאחרונה, האפשרות של היגוי נאיבי בתאי גזע עובריים כלפי גורלם nephrogenic נחקר בתחום המתפתח של רפואה רגנרטיבית. מחקרים גנטיים בעכברים זיהו מסלולים מספר הדרושים לפיתוח כליות, קטלוג עולמי של שעתוק הגנים באיבר לאחרונה שנוצר http://www.gudmap.org/ , מתן הרגולטורים מועמד רבים של פונקציות התפתחותי חיוני. Organogenesis של הכליה מכרסם ניתן ללמוד בתרבות איברים, ודוחות רבים השתמשו בגישה זו כדי לנתח את התוצאות של יישום או חלבונים מועמד או מפילה את הביטוי של גנים מועמדים באמצעות siRNA או morpholinos. עם זאת, תחולתה של התרבות איבר ללימוד איתות המווסת גזע / תא אב בידול מול חידוש בכליות פיתוח מוגבלת איברים בתרבית מכילים דיפוזיה קומפקטי תאי מטריקס מגבילים של מקרומולקולות חלקיקי הנגיף. כדי לחקור את תא האיתות אירועים המשפיעים על גזע / תא נישה אבי בכליות פיתחנו מערכת תא העיקרי קובע את אזור nephrogenic או תא נישה ובתאים של vivo פיתוח כליה לשעבר במנותק inducer אפיתל של בידול. באמצעות עיכול אנזימטי מוגבל, תאים אזור nephrogenic יכול להיות משוחרר באופן סלקטיבי מלפתח הכליות ב E17.5. לאחר סינון, התאים האלה יכול להיות מתורבת כמו monolayer סדיר באמצעות תנאים אופטימיזציה. הגן ניתוח מרקר מוכיח כי תרבויות אלה מכילים חלוקה של סוגי תאים האופייניים לאזור nephrogenic in vivo, וכי הם שומרים על ביטוי הגן המתאים סמן בתקופת התרבות. תאים אלה הם נגישים מאוד מולקולה קטנה וטיפול חלבון רקומביננטי, והוא חשוב גם התמרה ויראלית, אשר מאוד מקלה את המחקר של גזע / אבי מועמד תופעות תא הרגולטור. הפרמטרים של תא ביולוגי בסיסי כגון התפשטות מוות של תאים, כמו גם שינויים בביטוי של סמנים מולקולריים האופייניים נפרון גזע / ובתאים in vivo יכול לשמש בהצלחה גם תוצאות הניסוי. העבודה השוטפת במעבדה שלנו באמצעות טכניקה זו הרומן תא ראשוני שמטרתו לחשוף את המנגנונים הבסיסיים הקובעים את הרגולציה של התחדשות עצמית לעומת הבחנה נפרון גזע / ובתאים.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים עבור עיכול כליות

1. 1.5 מ"ל של collagenase 0.25% (w / v) 1 Pancreatin לעכל (w / v) פתרון% יהיה צורך מיצוי של תאים אזור nephrogenic (NZCs) מ - 8 E17.5 הכליות. מכיוון Pancreatin לוקח כ 2 שעות לפזר בטמפרטורת החדר, מספיק לעכל פתרון המספר הגדול ביותר של הכליות עובריים צפוי צריכה להיעשות לפני הניסוי. הכן לעכל פתרון על ידי הראשון להוסיף 25 מ"ג של collagenase אל פוספט 10 מ"ל של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) ב ברור 15, צינור מ"ל צנטריפוגות סטרילית. זה קריטי, כי DPBS אינו מכיל סידן או מגנזיום כמו זה יפריע לעכל את האנזימטית. מערבבים פתרון nutator במשך 10 דקות לפרק collagenase א הוספת 100 מ"ג של Pancreatin כדי collagenase מומס פתרון ומערבבים על nutator לפחות 2 שעות. לחלופין, collagenase פתרון / Pancreatin לעכל יכול להיות מעורב על nutator לילה בשעה 4 ° C. מומלץ לך ללבוש מסכה, כמו collagenase ו Pancreatin להתפזר בקלות לאטמוספרה במהלך השקילה יכול לגרות מעברי האף.
2. הכינו 5% עוברית שור סרום (FBS) (v / v) פתרון פתרון שנאגרו של האנק מלוחים (HBSS). היפוך לערבב. 1 מ"ל של כל שפופרת של 8 הכליות יהיה צורך.
3. הכן בינוני התרבות על ידי השלמת keratinocyte בינוני חופשי בסרום עם גלוטמין 1% (v / v) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין (PenStrep) (v / v).
4. סטרילי מעיל שטוח תחתית קלקר רקמה תרבות צלחות (96, 48, 24 או 6 היטב) עם פתרון פיברונקטין האדם בריכוז של 5 מ"ג ² ס"מ על פני צמיחה. 5 מ"ג של אבקת פיברונקטין הוא resuspended ב 5 מ"ל של סטרילית H ₂ O. זה מדולל ב 01:25 DPBS סטרילי ללא סידן או מגנזיום 250 מ"ל מתווסף גם כל צלחת 24 באר. פלטות מודגרת מכן במשך שעה 1 ואחריו 1 שעה ב 4 ° C. לחילופין עם פתרון פיברונקטין בטמפרטורת החדר, צלחות ניתן מודגרות לילה בשעה 4 ° C. הפתרון הוא aspirated אז במנדף זרימה למינרית לפני תוספת של בינוני / תאים.

2. הכליות הביתור & קפסולות הסרת (בוצע בטמפרטורת החדר)

1. בשלב E17.5, להקריב את אמא באמצעות הליך אישור טיפול בבעלי חיים מוסדיים שלך ועדת שימוש, להסיר את הרחם, ולמקם אותו בצלחת פטרי המכילות DPBS עם סידן ומגנזיום. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים "שענים כדי להסיר כל העובר מן הרחם לערוף את כל העובר. לאחר המלטה כולו מתוך הרחם, להעביר את העוברים כדי בצלחת פטרי נקי המכיל DPBS מספיק סידן ומגנזיום כדי לכסות לחלוטין את העוברים והותיר אחריו כמו הרבה דם ופסולת רקמות האפשרי.
2. בעזרת מלקחיים, לעשות חתך ההיקפי דופן הבטן של העובר ברמה של הטבור. אז במקום העובר על גבו, סיכה אותו על הכתפיים עם קבוצה אחת של מלקחיים, ולהסיר את האיברים הפנימיים מהריאות אל שלפוחית ​​השתן באמצעות סט אחר של מלקחיים. בעזרת תרגול ניתן לעשות זאת בתנועה אחת. הכליות צריך להיות מחובר לחלק האחורי של המונית של איברים. אם הכליות לא נשארים מחוברים האיברים נדחק, הם יכולים להסיר בזהירות מן הקיר הגוף הגבי. הכליות כי נפגעו במהלך תהליך זה לנתיחה אמור להיות מושלך כפי שהם יזהמו את התרבות הסופית עם סוגי תאים בלתי הולמת.
3. משם בעדינות להקניט את הכליות משאר האיברים, מקפיד לשמור על הכליות מחוברות זו לזו. החזק את הרקמה בין הכליות עם קבוצה אחת של מלקחיים ותופס את בלוטת יותרת הכליה מחוברת אחת הכליות עם מלקחיים אחרות. בלוטת יותרת הכליה צריך להיות מחובר הקפסולה כליות. לקלף בעדינות את בלוטת יותרת הכליה ועל הקפסולה הרחק סביב החלק החיצוני של הכליה, בדומה מקלפת בננה. שימו לב שלא לפצל את הכליה במחצית תוך קילוף, ולהיות בטוח שלא לפגוע ברקמת הכליה מתחת הקפסולה. בזהירות להסיר כל כמוסה הנותרים, כמו גם את השופכן אם הוא עדיין מחובר. חזור עם כליה הנותר.
4. השתמש pipet העברת לחתוך למקום הכליות לתוך צינור קלקר 5 מ"ל של HBSS. חזור על שלבים 2.2-2.4 עבור העובר כל אחד. הכליות עשוי להיות ונקווה 8 לכל צינור. עם הסרת, בפועל לנתיחה ואת הקפסולה ייקח 2-3 דקות לכל עובר.

3. עיכול אנזימתי של הכליות (כל הצעדים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת)

1. הסר פתרון HBSS מתוך 5 צינורות מ"ל המכיל הכליות עם pipettor זמן בזהירות הימנעות ממגע עם הכליות. מיד להוסיף 1.5 מ"ל של collagenase / Pancreatin פתרון לעכל את שפופרת המכילה 5 מ"ל הכליות לפני שעבר מדגם הבאה. חזור על הפעולה עבור כל שפופרת של הכליות.
2. צינורות מקום עם האנזים / כליות מעכל על nutator ב מראש חימם 37 ° C בחממה במשך 15 דקות. 2 דקות לפניהשלמת לעכל, הוסף 3 μl של DNase (1 U / ml) אחד טרי צינור 5 מ"ל פוליסטירן עבור לעכל כל המתבצעת.
3. להסיר במהירות מעכל מן האינקובטור, הוסף 75 μl של FBS ו להפוך 3 פעמים כדי לערבב. בואו לעמוד על הספסל במשך 2 דקות.
4. העברת 1.4 מ"ל של ההשעיה תא אל הצינור קלקר 5 מ"ל המכיל DNase (1 U / ml), תוך השארת תא הנותרים 0.2 מ"ל ההשעיה והכליות מאחור. תוספת 0.2 מ"ל של תמיסת השאיר אחריו יכיל זיהומים כגון תאי מטריקס.
5. תא מערבבים השעיה / DNase על nutator ב מראש חימם 37 ° C בחממה במשך 10 דקות.
6. להסיר במהירות השעיות התא החממה ולהעביר לכל צינור Eppendorf 1.5 מ"ל. ספין השעיות תא microfuge ב 325 גר 'במשך 5 דקות.
7. הסר supernatant מתא גלולה ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של 5% FBS / HBSS, pipetting למעלה ולמטה 5-6 פעמים. שווי כל הצינור לפני שעבר מדגם הבאה.
8. ספין השעיות תא microcentrifuge בבית 325 גרם במשך 5 דקות.
9. הסר supernatant ומוסיפים 0.5 מ"ל של מדיום keratinocyte חופשי בסרום (KSFM) עם תוספים כדי צינור כל צינור כובע לפני שעבר מדגם הבאה. לאחר בינוני נוספה כל הצינורות, בעדינות resuspend כל גלולה התא על ידי pipetting למעלה ולמטה 5-6 פעמים עם micropipette 1ml. מערבבים את כל המתלים תא צינור פוליסטירן טרי 5 מ"ל.
10. טרום הרטיבה שתי תאים מסננת 40 מיקרון כמוסות דגש על 5 מ"ל פוליסטירן צינור עגול עם תחתית KSFM לדגימה. Pass השעיות התא באמצעות כובע one מסננת התא ידי העברת עם micropipette מ"ל 1. הימנע ממגע עם מסנן קצה פיפטה. איסוף זרימה דרך וחזור סינון דרך מסננת הכובע השני. הסר את מכסה תא מסננת ולהחליף עם כובע חדש צינור פוליסטירן נורמלי 5 מ"ל.
11. ספירת תאים עם hemocytometer או תאים אחרים לספור המכשיר תאים להעביר בארות צלחת תרבות פיברונקטין מצופה בצפיפות של 100,000-200,000 תאים לכל ² ס"מ, דילול כנדרש עם KSFM עם תוספים. באופן כללי, אנו לאחזר כ 4.5x10 ⁶ תאים בכל המלטה 10 העובר.
12. דגירה תאים 37 ° C חממה humidified עם 5% CO _2.
13. אפשר תאים להתאושש לצרף עבור 2-4 שעות לפני גירוי בינוני עם חומרים כימיים נוספים. לעורר תאים עם תרכובת של עניין 1 עד 48 שעות. לטהר RNA לניתוח באמצעות PCR RNeasy Qiagen מיקרו ערכת הבאים הוראות היצרן או בצע את ההוראות שלהלן כדי fluorescently immunostain התאים.

4. הכנת ריאגנטים עבור קיבוע של תאים Immunostaining

1. הכן PFA 4%: ממיסים paraformaldehyde 4% PBS (v / v) בשעה 55 ° C עם תסיסה רגיל. מצננים לטמפרטורת החדר לפני השימוש. פתרון זה הוא רעיל ויש שהושלך מכולות פסולת המיועד.
2. הכן פתרון permeabilization ידי הוספת טריטון X-100 ל PBS להשיג פתרון 0.3% (v / v).
3. הכן פתרון לחסימת 5% ב-PBS עם סרום מן המינים זהה היה בשימוש להעלות את הנוגדן משנית לשמש. לדוגמה, אם יזהה נוגדן ארנבת כנגד אנטיגן היעד שלך עם חמור נגד ארנב אלקסה פלואוריד 568, להכין פתרון חסימת המכילה סרום חמור 5%. חנות ב 4 ° C.
4. הכן פתרון נוגדן ראשוני על ידי הוספת את הריכוז המתאים של נוגדן לפתרון חסימת 5%.
5. הכן פתרון נוגדנים משני מיד לפני השימוש. הוסף נוגדן fluorophore מצומדות בריכוז המומלץ של היצרן יחד עם גרעיני counterstain DAPI ושאר סמנים אברון כגון phalloidin לפתרון 5% חסימה. אם אחסון נדרש, לשמור על פתרון בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
6. הכן גליצרול 50% / פתרון PBS (v / v) לאחסון של תאים immunostained. לחילופין, ניתן להשתמש Vectashield.

5. קיבוע של תאים Immunostaining

1. הפרוטוקול הבא מיועד קיבעון והכתים של NZCs בצלחת 24 באר. כרכים נתון טוב עבור אחד. ריאגנטים צריך להיות pipetted בעדינות במהלך כל הצעדים כדי למנוע ניתוק של תאים, תסיסה צלחת לא מומלץ בשלבים הדגירה.
2. הוצא בעדינות בינוני עם 1 מ"ל micropipette ומוסיפים 0.5 מ"ל של PFA 4% תאים בתרבית המצורפת. דגירה במשך 15 דקות ללא הפרעה בטמפרטורת החדר.
3. הסרה של 4% PFA ומוסיפים 0.5 מ"ל לכל טוב של פתרון permeabilization. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הסר פתרון permeabilization בעדינות ולשטוף פעמיים עם 0.5 מ"ל של PBS לכל ולשטוף.
5. הוסף 0.5 מ"ל של חסימת פתרון דגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
6. הסר פתרון חסימת ולהוסיף 0.225 הפתרון העיקרי מ"ל נוגדן.
7. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות או לילה ב 4 ° C.
8. הסר פתרון נוגדן ראשוני בעדינות ריNSE פעמיים עם 0.5 מ"ל של PBS לכל ולשטוף.
9. הוסף 0.225 פתרון משני מ"ל נוגדן. דגירה צלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
10. הסר פתרון נוגדנים משני בעדינות ולשטוף פעמיים עם 0.5 מ"ל של PBS לכל ולשטוף.
11. הוסף 0.3 מ"ל של גליצרול 50% / PBS פתרון (v / v) או Vectashield מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של פני השטח היטב.
12. תאים תמונה עם מיקרוסקופ חנות epifluorescence או עטוף בנייר כסף על 4 ° C.

6. נציג תוצאות

באיור 1. NZCs היו מטוהרים מן E17.5 עוברים, מצופה ב 200,000 תאים לס"מ ² ו מודגרות ב 37 ° C עבור סכום כולל של 24 שעות. תאים היו הדמיה לעומת השלב עם מיקרוסקופ הלייקה IRB DM הפוכה לפני מכתים immunofluorescent. (א) 20X לעומת השלב לאור NZCs לאחר 24 שעות בתרבות. (ב) תאים קובעו ונצבעו באמצעות אנטי PAX2 ארנב נוגדנים ספציפיים עבור ובתאים נפרון (אדום) משנית אלקסה פלואוריד 568 מצומדות חמור נגד הארנב. הערה גרעינים כחול counterstained עם DAPI. (ג) שלב 40X בניגוד להציג מקבץ של אבות נפרון (במרכז) לאחר 24 שעות בתרבות. (ד) תמונה של 40X NZCs מבודד LacZ + עוברים של זן Foxd1 ^LacZ, המבטא β-galactosidase בשליטת היזם Foxd1. Foxd1 מתבטא האוכלוסייה תא סטרומה בתוך אזור nephrogenic של הכליה המתפתחת. תאים הוכתמו ה-F-אקטין סמן phalloidin (אורגון הירוקה העיקרית המצומד), את כתם DAPI גרעיני (כחול) ואת ארנב נגד β-galactosidase (משנית - Alexa פלואוריד חמור נגד ארנב 568) לגילוי Foxd1 + סטרומה תאים ( אדום).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבודד והתרבות תאים מאזור nephrogenic של הכליה העוברית. זהו פיתוח של שיטת שפורסם בתחילה כחלק ממחקר של ההשפעות של טיפול BMP7 על תאים של אזור nephrogenic (בלנק et al. 2009). במחקר הראשוני, בסדרה של ניסויים כדי לאפיין את סוגי תאים מיוצג בקרב האוכלוסייה NZC נע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Watchmaker’s forceps #5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A	Roche Group	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin	Sigma-Aldrich	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM	Sigma-Aldrich	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml	Sigma-Aldrich	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin	BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca	Lonza Inc.	17-512F
5mL polystyrene tubes	BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer	BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Supplied as powder
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal	MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin	Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Use "DNase on column" protocol
Transfer pipettes, 3ml	BD Biosciences	357575