Выделение и культуре клеток из нефрогенной зона эмбриональных почек мышь

Резюме

В этом докладе мы описываем метод изоляции и культуры нишу клеток-предшественников из эмбриональных почек мыши, которые могут быть использованы для изучения сигнальных путей, регулирующих стволовых / прогениторных клеток из развивающихся почек. Эти культурные клетки очень доступным для небольшой молекулы и рекомбинантного белка лечения и, что важно также, чтобы вирусная трансдукция, которая позволяет эффективно манипуляции кандидатом путей.

Аннотация

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering naïve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated http://www.gudmap.org/, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

протокол

1. Подготовка реагентов для почек Пищеварение

1. 1,5 мл 0,25% коллагеназы (м / о) и 1% Панкреатин переварить (м / о) решение будет необходима для извлечения нефрогенным клетки зоны (NZCs) с 8 E17.5 почек. Потому что Панкреатин занимает около 2 часов для растворения при комнатной температуре, достаточно переварить решение для наибольшего числа эмбриональных почек ожидать должно быть сделано до эксперимента. Подготовка переварить решение, добавьте сначала 25 мг коллагеназы на фосфат 10 мл Дульбеко буферного раствора (DPBS) в 15 мл ясно, стерильную пробирку центрифуги. Очень важно, чтобы DPBS НЕ содержит кальция или магния, поскольку это будет мешать ферментативных переварить. Смешайте раствор на nutator в течение 10 минут, чтобы растворить Коллагеназа А. Добавить 100 мг Панкреатин растворенные в воде Коллагеназа решения и смеси на nutator не менее 2 часов. Кроме того, коллагеназы / Панкреатин переварить решения могут быть смешаны на nutator течение ночи при 4 ° C. Рекомендуется, чтобы вы носите маску, как коллагеназы и Панкреатин разгона легко в атмосферу во время взвешивания и могут раздражать носовые ходы.
2. Подготовка 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (объем / объем) раствор в солевой буфер решение Хэнка (HBSS). Обратить перемешать. 1 мл для каждой трубки 8 почек будет необходимо.
3. Подготовка питательной среды путем дополнения кератиноцитов бессывороточной среде с 1% глютамин (об. / об) и 1% пенициллина-стрептомицина (PenStrep) (объем / объем).
4. Пальто стерильной плоским дном полистирола культуре ткани пластин (96, 48, 24 или 6 а) с человека решение фибронектина при концентрации 5 мг на см ² поверхности роста. 5 мг фибронектина порошок ресуспендируют в 5 мл стерильной H ₂ O. Это разбавляют 1:25 в стерильных DPBS без кальция или магния и 250 мл добавляется в каждую лунку 24-луночный планшет. Плиты затем инкубировали с фибронектина растворе при комнатной температуре в течение 1 часа, затем 1 час при температуре 4 ° C. Кроме того, плиты могут быть инкубировали в течение ночи при температуре 4 ° С. Затем раствор атмосферный в ламинарном боксе до добавления среды / клеток.

2. Пройдя через почки и удаление капсул (урон при комнатной температуре)

1. На E17.5, жертвенность матери с помощью процедуры, утвержденные вашей Институциональные уходу и использованию животных комитета, удалить матку, и поместить его в чашке Петри содержащие DPBS с кальцием и магнием. Под микроскопом рассекает, используйте часовщиков щипцы для удаления каждый эмбрион из матки и обезглавить каждого эмбриона. Как только весь помет находится вне матки, трансфер эмбрионов на чистую чашку Петри, содержащий достаточно DPBS с кальцием и магнием, чтобы полностью покрывать эмбрионов оставив позади так много крови и тканей мусора насколько это возможно.
2. Использование щипцов, чтобы окружная разрез в брюшной стенке эмбриона на уровне пупка. Затем поместите эмбриона на спине, контактный его вниз на плечи на одном комплекте щипцы, и удалить внутренние органы от легких до мочевого пузыря, используя другой набор щипцов. С практикой это можно сделать одним движением. Почки должны быть прикреплены к задней массы органов. Если почки не остаются прикрепленными к потрошился органов, их можно осторожно вынуть из спинной стенке тела. Почки, которые были повреждены во время этого процесса вскрытия должны быть отброшены, поскольку они будут загрязнять окончательного культуры с неподходящими типами клеток.
3. Аккуратно дразнить от почки от остальных органов, заботясь, чтобы сохранить почки связаны друг с другом. Держите ткани между почки с одним набором щипцов и захватить надпочечников прикреплен к одному из почки с другими щипцами. Надпочечников должны быть прикреплены к почечную капсулу. Аккуратно очистите надпочечников и капсулы от вокруг внешней почки, похожие на пилинг банана. Заботьтесь, чтобы не разделить почки в два раза в то время как пилинг, и быть уверенным, чтобы не повредить почки ткань под капсулой. Осторожно удалите все оставшиеся капсулы, а также мочеточник, если он по-прежнему прилагаются. Повторите с оставшейся почки.
4. Используйте пипетку вырезать передачу на место почки в 5 мл полистирола трубки HBSS. Повторите шаги 2.2-2.4 для каждого эмбриона. Почки могут быть объединены 8 в трубу. При удалении практике, рассечение капсулы и займет 2-3 минут в зародыше.

3. Ферментативного пищеварения почек (все шаги При комнатной температуре, если не указано иное)

1. Удалить HBSS решение от 5 мл пробирки, содержащие почки с пипетки, тщательно избегая контакта с почками. Сразу же добавить 1,5 мл коллагеназы / Панкреатин переварить решение 5 мл трубку с почками, прежде чем перейти к следующему образцу. Повторите эти действия для каждой трубки почек.
2. Место труб с ферментом / почек дайджесты по nutator в подогретого 37 ° C инкубаторе в течение 15 минут. 2 минуты дозавершение переварить, добавляют 3 мкл ДНКазы (1 ед / мл) на один свежий 5 мл полистирола трубки для каждого переварить может быть исполнено.
3. Быстро удалить дайджесты из инкубатора, добавить 75 мкл ФБС и инвертировать 3 раза перемешать. Дайте постоять на скамейке в течение 2 минут.
4. Передача 1,4 мл клеточной суспензии в 5 мл полистирола пробирку ДНКазы (1 ед / мл), оставив остальные 0,2 мл суспензии клеток и почек позади. Дополнительные 0,2 мл раствора оставил будет содержать примеси, такие как внеклеточного матрикса.
5. Смешайте суспензии клеток / ДНКазы на nutator в подогретого 37 ° С инкубатор на 10 минут.
6. Быстро удалить клеточные суспензии из инкубатора и передавать друг к 1,5 мл трубки Эппендорф. Спиновые клеточные суспензии в микроцентрифужную в 325 г в течение 5 минут.
7. Удалить супернатант из осадок клеток и ресуспендируют осадок в 1 мл 5% ЭТС / HBSS, пипетирования вверх и вниз от 5 до 6 раз. Cap каждую пробирку, прежде чем перейти к следующему образцу.
8. Спиновые клеточные суспензии в микроцентрифужных в 325 г в течение 5 минут.
9. Удалить супернатант и добавить 0,5 мл кератиноцитов бессывороточной среде (KSFM) с добавками в каждую пробирку и шапку трубку, прежде чем перейти к следующему образцу. После среда была добавлена ​​во все пробирки, мягко ресуспендирования каждый осадок клеток с помощью пипетки вверх и вниз от 5 до 6 раз с 1 мл микропипетки. Смешайте все клеточные суспензии в свежем 5 трубка полистирола мл.
10. Предварительно мокрой два 40 микрон клеточной фильтр шапки размещены на 5 мл полистирола круглым дном трубки с KSFM на образец. Pass клеточные суспензии через одну крышку фильтра ячейки путем перечисления с 1 микропипетки мл. Старайтесь не прикасаться фильтр с кончика пипетки. Сбор проточные и повторить фильтрацию через вторую крышку фильтра. Снимите крышку ячейки фильтра и заменить на новый колпачок от нормального 5 трубка полистирола мл.
11. Граф клеток с гемоцитометра или другие устройства подсчета клеток и передачи клеткам скважин фибронектина покрытием пластины культуре плотность 100,000-200,000 клеток на см ^2, разбавляя по мере необходимости с KSFM с добавками. Как правило, мы получаем примерно 4.5x10 ^{6 клеток} на 10 эмбриона помета.
12. Инкубируйте клетки в 37 ° С увлажненным инкубаторе с 5% CO _2.
13. Разрешить клеткам восстановиться и приложите на 2-4 часов в среде до стимуляции дополнительных реагентов. Стимулировать клеток с соединением, представляющих интерес для 1 до 48 часов. Purify РНК для анализа ПЦР с использованием Qiagen RNeasy Micro Kit, следуя инструкциям производителя или следуйте инструкциям ниже, чтобы флуоресцентно immunostain клеток.

4. Подготовка реагентов для фиксации клеток и Иммуноокрашивание

1. Подготовка 4% PFA: Растворите 4% параформальдегида в ФСБ (об. / об) при 55 ° С при регулярном волнении. Охладите до комнатной температуры перед использованием. Это решение является токсичным и должен быть уничтожен в специально отведенных для мусорных контейнеров.
2. Подготовка пермеабилизации решение, добавив Тритон Х-100 для PBS получить 0,3% (объем / объем) раствор.
3. Подготовка 5% блокирующий раствор в ФБР с сывороткой и того же вида, который был использован для повышения вторичными антителами, которые будут использоваться. Например, если вы будете обнаруживать кролика антитела против вашего целевого антигена с ослом анти-кролик Alexa Fluor 568, подготовить блокирующий раствор, содержащий 5% осла сыворотки. Хранить при температуре 4 ° С.
4. Подготовка первичных решение антител путем добавления соответствующей концентрации антител к 5% блокирующим раствором.
5. Подготовка вторичного антитела решение непосредственно перед использованием. Добавить флуорофора конъюгированных антител, при рекомендуемой концентрации производителя вместе с ядерным контрастирующая DAPI и других маркеров органелл, таких как фаллоидином до 5% блокирующим раствором. Если хранение необходимости держать решение в темноте при 4 ° С до использования.
6. Подготовка 50% глицерин / PBS решение (об / об) для хранения immunostained клеток. Кроме того, Vectashield могут быть использованы.

5. Фиксация клеток и Иммуноокрашивание

1. Следующий протокол предназначен для фиксации и окрашивания NZCs в 24-луночный планшет. Объемы указаны только для одной скважины. Реагенты следует осторожно пипеткой в ​​течение всех этапов, чтобы избежать отряд клеток, и пластина агитации не рекомендуется при инкубации.
2. Аккуратно снимите среде с 1 мл микропипетки и добавить 0,5 мл 4% PFA к которому прилагаются культуре клеток. Инкубировать 15 минут спокойно при комнатной температуре.
3. Удалить 4% PFA и добавить 0,5 мл на лунку пермеабилизации решение. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
4. Удалить пермеабилизации раствора и осторожно промыть два раза с 0,5 мл PBS на полоскание.
5. Добавить 0,5 мл блокирующий раствор и инкубировать при комнатной температуре в течение 60 минут.
6. Удалите блокирующий раствор и добавляют 0,225 мл первичной решение антител.
7. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов или на ночь при 4 ° C.
8. Удалите первичный решение антител и аккуратно риNSE в два раза с 0,5 мл PBS на полоскание.
9. Добавить 0,225 мл вторичного решение антител. Инкубируют пластинки в темноте при комнатной температуре в течение 60 минут.
10. Удаление вторичной решение антител и аккуратно промыть в два раза с 0,5 мл PBS на полоскание.
11. Добавить 0,3 мл 50% глицерин / PBS решение (об / об) или достаточно Vectashield для покрытия нижней части и поверхности.
12. Изображение клетки с epifluorescence микроскопа или магазина, завернутые в фольгу при 4 ° C.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1. NZCs очищали от E17.5 эмбрионов, помещали на 200000 клеток на см ² и инкубировали при 37 ° С в течение всего 24 часов. Клетки изображено фазового контраста с IRB Leica DM инвертированного микроскопа до иммунофлуоресцентного окрашивания. (А) 20-кратный фазового контраста зрения NZCs после 24 часов в культуре. (Б) Клетки фиксировали и окрашивали использованием кроличьих анти-PAX2 антитела, специфичные для клеток нефрона предшественников (красный) и вторичные Alexa Fluor 568 сопряженных осла анти-Кролик. Обратите внимание, синий ядер контрастно с DAPI. (C) 40X зрения фазового контраста скопления нефрона прародителей (по центру), после 24 часов в культуре. (D) 40X образ NZCs изолированы от LacZ + эмбрионов штамма Foxd1 ^LacZ, которая выражает β-галактозидазы под контролем Foxd1 промоутера. Foxd1 выражается в стромальных клеточной популяции в течение нефрогенной зоне развивающихся почек. Клетки окрашивали F-актин маркер фаллоидином (Орегон зеленый первичные сопряженные), ядерные пятно DAPI (синий) и кроличьих анти-β-галактозидазы (вторичный - Alexa Fluor осла анти-кролик 568) для обнаружения Foxd1 + стромальных клеток ( красный).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе описывается метод, чтобы изолировать и культуры клеток из нефрогенной зона эмбриональных почек. Это развитие метода первоначально опубликован в рамках изучения последствий BMP7 лечения на клетки нефрогенным зоны (Blank и соавт., 2009). В первоначальном исследовании, сер...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Watchmaker’s forceps #5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A	Roche Group	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin	Sigma-Aldrich	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM	Sigma-Aldrich	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml	Sigma-Aldrich	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin	BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca	Lonza Inc.	17-512F
5mL polystyrene tubes	BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer	BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Supplied as powder
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal	MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin	Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Use "DNase on column" protocol
Transfer pipettes, 3ml	BD Biosciences	357575