Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Özet

Bu yazıda, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücreleri düzenleyen sinyalizasyon yolaklar çalışma için kullanılabilir embriyonik fare böbrek progenitör hücre niş izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür hücreleri küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi için son derece erişilebilir ve önemlisi de aday yollarının etkin bir şekilde müdahale etmenizi sağlar viral iletimi,.

Özet

Böbrek embriyonik gelişim yoğun organogenez epitel mezenkimal etkileşim için bir model olarak ve doğuştan böbrek hastalığı kökeni anlayış kazanmak için her iki çalışılmıştır. Daha yakın zamanlarda, nefrojenik kaderi karşı naif embriyonik kök hücreleri direksiyon olasılığı, rejeneratif tıp ortaya çıkan alanında incelenmiştir. Fareyi genetik çalışmalar böbrek gelişimi için gerekli olan çeşitli yollar belirledik ve organ gen transkripsiyon son zamanlarda küresel bir katalog oluşturuldu http://www.gudmap.org/, temel gelişim fonksiyonlarının çok sayıda aday düzenleyiciler. Kemirgen böbrek Organogenez organ kültürü incelenecek ve birçok rapor, ya da aday proteinleri uygulayarak veya aday genler siRNA veya morpholinos kullanarak ifade aşağı vurma sonuçlarını analiz etmek için bu yaklaşım kullanılır. Kültürlü organları, makromoleküllerin ve virüs parçacıkları kompakt bir ekstrasellüler matriks sınırlayan difüzyon içeren Ancak, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücre farklılaşması karşısında yenilenmesini düzenleyen sinyal çalışmaya organ kültürü uygulanabilirliği sınırlıdır. Hücre farklılaşma epitel indükleyicisi izolasyonu gelişmekte olan böbrek ex vivo nefrojenik bölge veya progenitör hücre niş oluşturan bir birincil hücre sistemi geliştirdik böbrek kök / progenitör hücre niş etkileyen olaylar sinyalizasyon incelenmesi. Sınırlı enzimatik sindirim E17.5 az gelişmekte olan böbrekler, nefrojenik bölge hücreleri seçici kurtarılmış olabilir. Işleminden sonra, bu hücreler optimize koşulları kullanarak düzensiz bir tek tabaka olarak yetiştirilebilir. Marker gen analizi, in vivo nefrojenik bölge karakteristik hücre tipleri bu kültürlerin bir dağıtım içerdiğini gösterir ve kültür döneminde uygun işaretleyici gen ekspresyonu korumak . Bu hücreler küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi son derece erişilebilir ve daha önemlisi de aday kök / progenitör hücre düzenleyici etkileri çalışmanın büyük ölçüde kolaylaştırır viral iletimi,. Temel hücre çoğalması ve hücre ölümü gibi in vivo olarak nefron kök / progenitör hücrelerinin karakteristik moleküler belirteçler ifade değişiklikleri gibi biyolojik parametreler deneysel sonuçların başarılı olarak kullanılabilir. Bu romanda ana hücre tekniği kullanılarak laboratuarda devam eden çalışmaları nefron kök / progenitör hücrelerin kendini yenileme karşı farklılaşma yönetmelik düzenleyen temel mekanizmaları ortaya çıkarmak için amaçlamaktadır.

Protokol

1. Böbrek Sindirim hazırlanması için Reaktifler

1. A (w / v) ve% 1 Pankreatin sindirmek (w / v) solüsyonu 1.5 ml% 0.25 kollajenaz 8 E17.5 böbrekler nefrojenik bölge hücreleri (NZCs) çıkarılması için gerekli olacaktır. Pankreatin oda sıcaklığında erimesi için yaklaşık 2 saat sürer, en büyük sayı önce deney yapılmalıdır beklenen embriyonik böbrekler için yeterli çözüm sindiremez. Ilk kez, 25 kollajenaz mg 10 ml Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) açık bir 15 ml, steril santrifüj tüpüne. Ekleyerek çözüm sindirimi hazırlayın Bu enzimatik sindirimi engel olacak şekilde, DPBS kalsiyum veya magnezyum içeren DEĞIL kritik öneme sahiptir. Kollajenaz A. çözünmüş kollajenaz bir nutator karışımı bir çözüm ve en az 2 saat süreyle 100 mg Pankreatin ekle çözmek için, 10 dakika boyunca bir nutator çözüm karıştırın. Alternatif olarak, kollajenaz A / Pankreatin sindirmek çözüm 4 gecede bir nutator karışık olabilir ° C kollajenaz A ve Pankreatin tartım sırasında atmosfere kolayca dağıtmak ve burun pasajda tahriş edebilir gibi bir maske takmaları tavsiye edilir.
2. Hank Tamponlu Salin solüsyonu (HBSS)% 5 fetal sığır serum (FBS) (v / v) çözeltisi hazırlayın. Karıştırmak için ters çevirin. 8 böbrekler her tüp için 1 ml gerekli olacaktır.
3. % 1 glutamin (v / v) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (PenStrep) (v / v) ile keratinosit serum serbest orta tamamlayan kültür ortamı hazırlayın.
4. Kat insan fibronektin çözüm büyüme yüzey cm ² başına 5 mg bir konsantrasyon ile steril düz dipli polistiren doku kültürü levhalar (96, 48, 24 veya iyi 6). Fibronektin tozu 5 mg 5 ml steril H ₂ O. yeniden süspanse Bu, kalsiyum veya magnezyum olmadan steril DPBS 01:25 seyreltilir ve 250 ml, 24 plaka her kuyuya eklenir. Tabaklar, sonra oda sıcaklığında 1 saat için 1 saat 4 ° C Alternatif takip fibronektin çözüm inkübe, tabak 4 gece inkübe edilebilir ° C çözüm laminer akış kaputu sonra aspire edilir önce orta / ek hücreleri.

2. Diseksiyon Böbrekler ve çıkarma Kapsül (oda sıcaklığında Bitti)

1. E17.5 anda, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir prosedür kullanılarak anne kurban rahim kaldırmak, ve kalsiyum ve magnezyum DPBS içeren bir Petri kabı yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, her embriyo rahim kaldırmak ve her embriyo başını kesmek için saatçiler 'forseps kullanabilir. Tüm çöp rahim sonra, embriyolar, kalsiyum ve magnezyum, mümkün olduğu kadar çok kan ve doku artıkları olarak geride bırakarak embriyolar tamamen karşılamak için yeterli DPBS içeren temiz bir Petri kabı aktarın.
2. Forseps kullanarak, embriyonun karın duvarındaki göbek düzeyinde dairesel bir kesi yapmak. Sonra sırtında embriyo forseps bir set ile omuzları aşağı pin ve akciğerlerden iç organları diğer forseps kullanarak mesane kaldırmak. Bu uygulama ile tek hareketle yapılabilir. Böbrekler, organların kütlesinin arkasına eklenmelidir. Parçalanmış organlar böbrekler bağlı kalır yoksa, onlar dorsal vücut duvarı dikkatlice çıkarılmalıdır. Bu diseksiyon işlemi sırasında zarar görmüş Böbrekler uygunsuz hücre tipleri ile nihai kültür kontamine olarak atılmalıdır.
3. Yavaşça birbirine bağlı böbrekler tutmaya özen böbrekler, organların geri kalanından uzakta alay. Böbrekler arasındaki doku forseps bir set tutun ve diğer forseps ile böbrekler birine bağlı adrenal bezin kapmak. Böbreküstü bezi, böbrek kapsül eklenmelidir. Böbreküstü bezi ve böbrek dışında, bir muz soyma benzer dört bir yanından gelen kapsül kabuğu hafifçe. Soyma ise böbrek yarısında split ve kapsül altında böbrek dokusuna zarar vermemek için emin olmak için özen gösterin. Kalan herhangi bir kapsül gibi hala bağlıysa üreter dikkatlice çıkarın. Kalan böbrek ile tekrarlayın.
4. Böbrekler HBSS 5 ml polistiren tüp içine yerleştirmek için bir kesim transfer pipetlemeyin kullanın. Her embriyo için 2.2-2.4 adımları tekrarlayın. Böbrekler, tüp başına 8 toplanmış olabilir. Uygulama, diseksiyon ve kapsül alınması ile embriyo ortalama 2-3 dakika sürecektir.

3. Böbrekler Enzimatik Sindirim (aksi belirtilmedikçe Oda Sıcaklığı Tüm Adımları At)

1. Dikkatle böbrekler ile temas kaçınarak bir pipet ile böbreklerin içeren 5 ml tüpler HBSS çözüm çıkarın. Hemen kollajenaz sonraki örnek geçmeden önce böbrekleri içeren 5 ml tüp A / Pankreatin sindirmek çözümü 1,5 ml ekleyin. Böbreklerin her tüp için tekrarlayın.
2. Enzim / böbrek Yeri tüpler 15 dakika önceden ısıtılmış 37 ° C inkübatör nutator sindirir. 2 dakika öncesindirimi tamamlanması, bir taze yapılmaktadır her sindirimi için 5 ml polistiren tüp 3 ul DNaz (1 U / ml) ekleyin.
3. Hızla kaldırmak inkübatör ile sindirerek, FBS 75 ul eklemek ve karıştırmak için 3 kez ters. Bankta 2 dakika boyunca bekletin.
4. 5 ml polistiren tüp kalan 0.2 ml hücre süspansiyonu ve arkasında böbrekler bırakarak DNaz (1 U / ml) içeren 1.4 ml hücre süspansiyonu aktarın. Çözüm ekstra 0,2 ml ekstraselüler matriks gibi maddeler ihtiva arkasında bıraktı.
5. Önceden ısıtılmış bir 10 dakika boyunca 37 ° C inkübatör nutator Mix hücre süspansiyonu / DNaz.
6. Hızla inkübatör hücre süspansiyonları kaldırmak ve her 1.5 ml Eppendorf tüp transferi. 5 dakika boyunca 325 g mikrofuge'ye hücre süspansiyonları Spin.
7. 5 ila 6 kat yukarı ve aşağı pipetleme hücre pelletini tekrar süspansiyon pelet, 1 ml% 5 FBS / HBSS süpernatantı. Sonraki numune geçmeden önce her tüp kap.
8. 5 dakika için 325 g mikrosantrifüj hücre süspansiyonları Spin.
9. Süpernatantı alın ve bir sonraki örnek geçmeden önce, her tüp ve kapak boru katkı keratinosit serum serbest orta (KSFM) 0,5 ml ekleyin. Orta tüm tüplere ilave edildikten sonra, yavaşça, her bir 1ml mikropipet 5 ila 6 kat yukarı ve aşağı pipetleme hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. 5 ml taze bir polistiren tüp tüm hücre süspansiyonları birleştirin.
10. Örnek başına KSFM ile 5 ml polistiren yuvarlak alt tüp yerleştirilir Pre-ıslak iki adet 40 mikron hücre-süzgeç kapaklar. 1 ml mikropipet ile aktararak bir hücre süzgecinden kapağı ile hücre süspansiyonları iletin. Pipet ile filtre dokunmaktan kaçının. Flow-through toplayın ve ikinci süzgeç kapağı ile filtrasyon tekrar. Hücre süzgeç kapağını çıkarın ve yeni bir kapak ile normal bir 5 ml polistiren tüp değiştirin.
11. Seyreltilmesi katkı maddeleri ile KSFM gerektiği gibi, bir hemasitometre veya cm ² başına 100.000-200.000 hücre yoğunluğu fibronektin kaplı bir kültür plaka kuyu sayım cihazı ve transfer hücreleri diğer hücre ile hücre sayımı. Genellikle, 10 embriyo çöp başına yaklaşık 4.5x10 ⁶ hücre almak.
12. 37 hücre inkübe ° C,% 5 CO ₂ ile nemlendirilmiş inkübatör.
13. Hücreleri kurtarmak ve ek reaktifler ile önceden uyarımı için 2-4 saat orta eklemek için izin ver. 1 ila 48 saat boyunca ilgi bileşik hücreleri uyarmak. Üreticinin talimatları izleyerek Qiagen RNeasy Micro kiti kullanılarak PCR analizi için RNA Purify veya floresan hücreleri immunostain için aşağıdaki yönergeleri izleyin.

4. Hücre Sabitleme için Reaktifler hazırlanması ve immün

1. % 4 PFA hazırlayın: 55 PBS (v / v)% 4 paraformaldehid çözülür ° C düzenli ajitasyon. Kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Bu çözüm, toksik ve belirlenen çöp konteynerleri atılmalıdır.
2. PBS için% 0.3 (v / v) bir çözüm elde etmek için Triton X-100 ekleyerek permeabilization çözüm hazırlayın.
3. Kullanılmak üzere ikincil antikor yükseltmek için kullanılabilir olduğu gibi aynı türün serum ile PBS içinde% 5 engelleme çözüm hazırlayın. Hedef antijene karşı anti-Rabbit Alexa Fluor 568 bir eşek ile bir tavşan antikor tespit Örneğin,% 5 eşek içeren serum engelleyici bir solüsyon hazırlanır. 4 ° C saklayınız
4. Primer antikor antikor% 5 engelleme çözümü için uygun konsantrasyon ekleyerek çözüm hazırlayın.
5. Sekonder antikoru solüsyonu kullanımdan hemen önce hazırlayın. Nükleer counterstain DAPI ve% 5 engelleme çözümü için Phalloidin gibi diğer organel belirteçler ile birlikte üretici firmanın önerdiği konsantrasyonda fluorofor konjuge antikor ekleyin. Depolama gerekiyorsa, karanlıkta, 4 çözüm tutmak ° C kullanana kadar.
6. % 50 gliserol / PBS solüsyonu (v / v) ile immunohistokimyasal hücrelerinin depolanması için hazırlayın. Alternatif olarak, Vectashield kullanılabilir.

5. Hücre Sabitleme ve immün

1. Aşağıdaki protokol, 24 plaka NZCs fiksasyon ve boyama için tasarlanmıştır. Verilen Hacimler tek bir kuyu için. Reaktifler hücre dekolmanı önlemek için tüm adımları sırasında hafifçe pipetlenir olmalıdır ve plaka ajitasyon inkübasyon adımları tavsiye edilmez.
2. 1 ml mikropipet ile hafifçe orta kaldırmak ve 0.5 ml% 4 PFA bağlı kültür hücreleri ekleyin. , Oda sıcaklığında rahatsız 15 dakika inkübe edin.
3. % 4 PFA çıkarın ve her iyi permeabilization çözüm 0,5 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
4. Permeabilization çözüm kaldırın ve yavaşça durulama ortalama 0.5 ml PBS ile iki kez yıkayın.
5. Engelleme solüsyonu 0.5 ml ekleyin ve 60 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
6. Engelleme çözüm çıkarın ve 0,225 ml primer antikor çözümü eklemek.
7. 2 saat veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe 4 ° C
8. Primer antikor çözüm çıkarın ve hafifçe rinse durulayın ortalama 0.5 ml PBS ile iki kez.
9. 0,225 ml ikincil antikor çözüm ekleyin. Plaka karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
10. Sekonder antikor çözüm kaldırın ve yavaşça durulama ortalama 0.5 ml PBS ile iki kez yıkayın.
11. % 50 gliserol / PBS solüsyonu (v / v) ya da iyi yüzey alt kapağı için yeterli Vectashield 0,3 ml ekleyin.
12. Epifloresans mikroskop veya mağaza ile Resim hücreleri 4 folyoya sarılı ° C

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 NZCs E17.5 embriyolar cm ² başına 200.000 hücre kaplanmış, saflaştırılmış ve 24 saat olmak üzere toplam 37 ° C'de inkübe edildi. Hücreler immunofluorescent boyama öncesinde bir Leica DM IRB inverted mikroskop ile faz kontrast tarafından görüntülenmiştir. (A) 24 saat sonra kültür NZCs 20X faz kontrast görünümü. (B) Hücreler sabit nefron progenitör hücreler için spesifik bir tavşan anti-PAX2 antikor (kırmızı) ve ikincil Alexa Fluor 568 konjuge eşek anti-Tavşan ile boyandı. Not mavi çekirdekleri DAPI ile zıt. (C) 24 saat sonra kültür nefron atalarıdır bir küme 40X faz kontrast görünümü (merkezli). (D) LacZ + Foxd1 organizatörü kontrolü altında β-galaktosidaz ifade Foxd1 ^LacZ gerilme, embriyo Foxd1 izole NZCs 40X görüntü, gelişmekte olan böbrek nefrojenik bölge içinde stromal hücre popülasyonu ifade edilir. Hücreler, F-aktin işaretleyici Phalloidin (Oregon yeşil birincil konjuge), nükleer leke DAPI (Mavi) ve tavşan anti-β-galaktosidaz ile boyandı Foxd1, algılama için (ikincil Alexa Fluor eşek anti-Tavşan 568) + stromal hücreler ( kırmızı).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolde, embriyonik böbrek nefrojenik bölge hücreleri izole ve kültür bir yöntem açıklanmaktadır. Başlangıçta nefrojenik bölge (Boş ve ark, 2009) hücreleri BMP7 tedavi etkileri bir çalışmanın parçası olarak yayınlanan bir yöntem geliştirilmesi. İlk çalışmada, NZC nüfus içinde temsil edilen hücre tipleri karakterize etmek için bir dizi deney yapılmıştır. (Srinivas ve ark, 2001; Yu ve ark; Kısaca, kortikal stroma (Foxd1 ^{+ / lacZ)} (. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Watchmaker’s forceps #5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A	Roche Group	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin	Sigma-Aldrich	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM	Sigma-Aldrich	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml	Sigma-Aldrich	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin	BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca	Lonza Inc.	17-512F
5mL polystyrene tubes	BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer	BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Supplied as powder
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal	MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin	Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Use "DNase on column" protocol
Transfer pipettes, 3ml	BD Biosciences	357575