العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

Summary

نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لعزل وثقافة السلف المتخصصة الخلية من الكلى الماوس الجنينية التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم الجذعية / السلف خلايا الكلى النامية. هذه الخلايا المستزرعة متاحة للغاية لجزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسي ، والذي يسمح للتلاعب كفاءة الممرات مرشح.

Abstract

وقد تم التطور الجنيني في الكلى درس على نطاق واسع على حد سواء باعتبارها نموذجا للتفاعل الظهارية - الوسيطة في organogenesis واكتساب فهم أصول أمراض الكلى الخلقية. في الآونة الأخيرة ، وقد تم دراسة إمكانية توجيه الخلايا الجذعية الجنينية من السذاجة تجاه مصائر كلوي الناشئة في مجال الطب التجديدي. وقد حددت الدراسات الجينية في الماوس عدة مسارات اللازمة للتنمية في الكلى ، وفهرس عالمي للنسخ الجيني في الجهاز وقد تم مؤخرا إنشاء http://www.gudmap.org/ ، وتوفير العديد من المنظمين مرشح للوظائف التنموية الأساسية. يمكن دراستها Organogenesis في الكلى القوارض في الثقافة الجهاز ، والعديد من التقارير قد استخدمت هذا الأسلوب لتحليل نتائج تطبيق إما بروتينات مرشح أو اسقاط التعبير عن الجينات باستخدام مرشح أو morpholinos سيرنا. ومع ذلك ، يقتصر تطبيق ثقافة الجهاز لدراسة الإشارات التي تنظم الجذعية / تمايز الخلايا السلف مقابل التجديد في الكلى كما تحتوي على أجهزة مثقف ميثاقا نشر المصفوفة خارج الخلية التي تحد من الجزيئات والجسيمات الفيروس. لدراسة الخلية إشارات الأحداث التي تؤثر على الساق / السلف الخلية المتخصصة في الكلى وضعنا نظام الخلية الأساسية التي تحدد منطقة كلوي أو السلف المتخصصة خلية من خلايا الجسم الحي الكلى السابقين النامية بمعزل عن محفز الظهارية للتمايز. باستخدام الهضم الأنزيمي محدودة ، يمكن الخلايا الكلوية منطقة تتحرر بشكل انتقائي من البلدان النامية في الكلى E17.5. بعد الترشيح ، يمكن هذه الخلايا مثقف بوصفه أحادي الطبقة غير النظامية به الظروف الأمثل. علامة تحليل الجينات يدل على أن هذه الثقافات تحتوي على توزيع أنواع الخلايا المميزة للمنطقة كلوي في الجسم الحي ، وأنها تحافظ على التعبير الجيني علامة المناسبة خلال الفترة الثقافة. هذه الخلايا هي سهلة الوصول إلى جزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسية ، مما يسهل كثيرا من دراسة الجذعية / آثار السلف مرشح منظم الخلية. يمكن المعلمات الخلية الأساسية البيولوجية مثل الانتشار النووي وموت الخلية ، وكذلك التغيرات في التعبير عن علامات مميزة الجزيئية للخلايا الجذعية / السلف نفرون في الجسم الحي واستخدمت بنجاح النتائج التجريبية. العمل الجاري في مختبرنا باستخدام هذه الرواية تقنية الخلية الأولية تهدف إلى الكشف عن الآليات الأساسية التي تحكم تنظيم التجديد الذاتي مقابل التمايز في الخلايا الجذعية / نفرون السلف.

Protocol

1. إعداد الكواشف لهضم الكلى

1. سوف 1.5 مل من كولاجيناز 0.25 ٪ ستكون هناك حاجة إلى (ث / ت) و 1 حل بنكرياتين هضم (ث / V) ٪ لاستخراج الخلايا الكلوية منطقة (NZCs) في الفترة من 8 E17.5 الكلى. بنكرياتين لأن يأخذ حوالي 2 ساعة ليحل في درجة حرارة الغرفة ، وهضم ما يكفي من حل لأكبر عدد من الكليتين الجنينية المتوقعة ينبغي أن تكون المقدمة قبل التجربة. إعداد خلاصة الحل بإضافة أول 25 ملغ من كولاجيناز ألف إلى 10 مل Dulbecco الفوسفات في التخزين المؤقت المالحة (DPBS) بشكل واضح 15 مل ، أنبوب الطرد المركزي العقيمة. فمن الأهمية بمكان أن DPBS لا تحتوي على الكالسيوم أو المغنيسيوم لأن هذا سوف تتداخل مع هضم الأنزيمية. مزيج حل على nutator لمدة 10 دقائق لإذابة كولاجيناز A. إضافة 100 ملغ من بنكرياتين كولاجيناز إلى حل أي حل وعلى مزيج nutator ما لا يقل عن 2 ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون مختلطة كولاجيناز A / حل هضم بنكرياتين على nutator بين عشية وضحاها في 4 ° C. ويوصى بأن عليك ارتداء قناع ، كما كولاجيناز ألف وبنكرياتين تفريق بسهولة في الجو خلال وزنها ويمكن أن تهيج الممرات الأنفية.
2. إعداد الجنين مصل الأبقار 5 ٪ (FBS) (V / V) في محلول هانك حل لتحلية التخزين المؤقت (HBSS). عكس إلى المزيج. وسوف 1 مل لكل أنبوب من 8 الكلى يكون ضروريا.
3. تحضير مستنبت من خلال استكمال خلية كيراتينية المتوسطة مجانا المصل مع الجلوتامين 1 ٪ (V / V) و 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين (PenStrep) (V / V).
4. معطف العقيمة البوليسترين لوحات مسطحة القاع زراعة الأنسجة (96 ، 48 ، 24 أو 6 أيضا) مع الحل فبرونيكتين الإنسان بتركيز 5 ملغ لكل سم ² من سطح النمو. هو معلق 5 ملغ من مسحوق فبرونيكتين في 5 مل من العقيمة O. ₂ H هذا هو المخفف في 1:25 DPBS عقيمة بدون المغنيسيوم والكالسيوم أو 250 مل يضاف إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا. والمحتضنة لوحات ثم بمحلول فبرونيكتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة يليها 1 ساعة بمعدل 4 درجة مئوية بدلا من ذلك ، يمكن المحتضنة لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ثم يستنشق هو الحل في التدفق الصفحي هود قبل إضافة متوسطة / الخلايا.

2. تشريح الكلى وإزالة كبسولات (حرر في درجة حرارة الغرفة)

1. في E17.5 والتضحية الأم باستخدام إجراء التي وافقت عليها رعاية الحيوان المؤسسية الخاص ولجنة استخدام وإزالة الرحم ، ووضعه في طبق بتري تحتوي DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. تشريح تحت المجهر ، واستخدام الملقط الساعات "لإزالة كل الجنين من الرحم وقطع رأس كل جنين. مرة واحدة في القمامة بالكامل خارج الرحم ونقل الأجنة إلى طبق بتري تحتوي DPBS نظيفة بما فيه الكفاية مع الكالسيوم والمغنيسيوم لتغطي كامل الأجنة تاركة وراءها الكثير من الدماء والأنسجة والحطام ممكن.
2. باستخدام الملقط ، وجعل شق كفافي في جدار البطن للجنين على مستوى السرة. ثم ضع الجنين على ظهرها ، دبوس عليه في الكتفين مع مجموعة واحدة من الملقط ، وإزالة الأحشاء الداخلية من الرئتين الى المثانة باستخدام مجموعة أخرى من الملقط. يمكن مع الممارسة أن يتم ذلك في اقتراح واحد. يجب أن يرفق الكلى إلى الجزء الخلفي من كتلة الأجهزة. إذا لا تزال تعلق الكلى لأجهزة ينتزع منه ، ويمكن إزالتها بعناية من جدار الجسم الظهرية. يجب التخلص من الكلى التي تضررت خلال هذه العملية تشريح لأنها سوف يلوث ثقافة النهائي مع أنواع الخلايا غير لائقة.
3. ندف بلطف بعيدا الكلى من بقية الأجهزة ، مع الحرص على الحفاظ على الكلى متصلة مع بعضها البعض. عقد بين أنسجة الكلى مع مجموعة واحدة من الملقط وانتزاع الغدة الكظرية المرفقة إلى واحدة من الكليتين مع ملقط الأخرى. يجب أن يرفق الغدة الكظرية للكبسولة الكلى. بلطف قشر الغدة الكظرية ، وبعيدا عن كبسولة حول خارج الكلية ، على غرار تقشير الموز. الحرص على عدم تقسيم الكلى في النصف بينما تقشير ، وتأكد من عدم تلف نسيج الكلى تحت الكبسولة. إزالة بعناية أي كبسولة المتبقية وكذلك الحالب إذا لا تزال تعلق عليه. مع تكرار الكلى المتبقية.
4. استخدام الماصة نقل قطع لوضع الكلى في أنبوب البوليسترين 5 مل من HBSS. كرر الخطوات من 2،2-2،4 لكل الجنين. ويمكن تجميع الكلى بنسبة 8 في الأنبوب. ومع إزالة الممارسة ، تشريح وكبسولة تأخذ 2-3 دقائق لكل الجنين.

3. الأنزيمية الهضم الكلى (جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يرد خلاف ذلك)

1. إزالة حل HBSS من 5 مل تحتوي على أنابيب الكلى مع pipettor بعناية مع تجنب الاتصال مع الكليتين. إضافة 1.5 مل من الفور كولاجيناز A / حل هضم بنكرياتين إلى أنبوب 5 مل تحتوي على الكلى قبل ان ينتقل الى العينة المقبل. كرر لكل أنبوب من الكليتين.
2. أنابيب مكان مع انزيم / الكلى على هضم nutator في مرحلة ما قبل حرارة 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 15 دقيقة. 2 دقائق قبلالانتهاء من هضم ، إضافة 3 ميكرولتر من الدناز (1 يو / مل) إلى واحد الطازجة 5 مل أنبوب البوليسترين لكل هضم يتم تنفيذها.
3. إزالة بسرعة هضم من الحاضنة ، إضافة 75 ميكرولتر من FBS وعكس 3 مرات لخلط. دعونا نقف على مقاعد البدلاء لمدة 2 دقيقة.
4. نقل 1.4 مل من التعليق الخلية في أنبوب البوليسترين 5 مل تحتوي على الدناز (1 يو / مل) بينما يترك الخلايا المتبقية 0.2 مل تعليق والكلى وراءهم. غادر اضافية 0.2 مل من وراء حل وسوف تحتوي على شوائب مثل المصفوفة خارج الخلية.
5. مزيج تعليق خلية / الدناز على nutator في مرحلة ما قبل 37 درجة مئوية درجة حرارة الحاضنة لمدة 10 دقيقة.
6. إزالة تعليق بسرعة من خلية الحاضنة ونقلها إلى كل أنبوب 1.5 مل إيبندورف. تدور تعليق خلية في microfuge في 325 جرام لمدة 5 دقائق.
7. طاف من إزالة الخلايا وبيليه بيليه resuspend في 1 مل من 5 ٪ FBS / HBSS ، pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 6 مرات. سقف كل أنبوب قبل الانتقال إلى نموذج المقبل.
8. تدور تعليق خلية في microcentrifuge في 325 جرام لمدة 5 دقائق.
9. طاف إزالة وإضافة 0.5 مل من مصل المتوسطة خلية كيراتينية مجانا (KSFM) مع الإضافات إلى كل أنبوب وأنبوب قبعة قبل الانتقال إلى نموذج المقبل. بعد تمت إضافة المتوسطة لجميع الأنابيب ، resuspend بلطف بيليه كل خلية pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 6 مرات مع micropipette 1ml. الجمع بين كل خلية في تعليق الطازجة 5 مل أنبوب البوليسترين.
10. قبل 40 ميكرون الرطب two الخلية مصفاة القبعات وضعت على البوليسترين 5 مل أنبوب أسفل مستديرة مع KSFM لكل عينة. تمرير تعليق خلية خلية واحدة من خلال رسملة مصفاة من خلال نقل مع micropipette 1 مل. تجنب لمس تصفية مع طرف ماصة. التدفق من خلال جمع وتكرار الترشيح من خلال رسملة مصفاة ثانية. إزالة الغطاء مصفاة الخلية واستبدالها مع غطاء جديد من الطبيعي 5 مل أنبوب البوليسترين.
11. عدد الخلايا مع الخلايا الاخرى عدادة الكريات أو عد خلايا الجهاز ونقلها إلى آبار لوحة الثقافة المغلفة فبرونيكتين في كثافة 100،000-200،000 الخلايا لكل سم ² ، كما هو مطلوب مع تمييع KSFM مع الإضافات. عموما ، فإننا استرداد حوالي 4.5x10 ⁶ خلايا الجنين في القمامة 10.
12. احتضان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع مرطب 5 ٪ CO _2.
13. يسمح للخلايا لاسترداد وإرفاق لمدة 2-4 ساعات في المتوسط ​​قبل التحفيز مع الكواشف إضافية. تحفيز الخلايا مع مجمع الفائدة : 1 إلى 48 ساعة. تنقية الحمض النووي الريبي لتحليل PCR باستخدام RNeasy Qiagen مايكرو مجموعة باتباع إرشادات الشركة المصنعة أو اتبع التعليمات التالية لimmunostain fluorescently الخلايا.

4. إعداد الكواشف لتثبيت للخلايا وImmunostaining

1. إعداد PFA 4 ٪ : ذوب بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني (V / V) عند درجة حرارة 55 مئوية مع الانفعالات العادية. تبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. هذا الحل هو السامة ويجب التخلص من النفايات في حاويات المعينة.
2. يعد حل permeabilization بإضافة تريتون X - 100 لبرنامج تلفزيوني للحصول على حل 0.3 ٪ (V / V).
3. إعداد محلول 5 ٪ حظر في برنامج تلفزيوني مع المصل من الأنواع نفسها التي كانت تستخدم لرفع مستوى الأجسام المضادة الثانوية لاستخدامها. على سبيل المثال ، إذا كنت سوف الكشف عن الأجسام المضادة ضد المستضد الأرانب التي تستهدفها مع حمار المضادة للأرنب اليكسا فلور 568 ، يعد حل حظر تحتوي على 5 ٪ المصل حمار. المحل في 4 درجات مئوية.
4. يعد الحل الأساسي الضد بإضافة تركيز مناسب من الأضداد إلى 5 ٪ حل حظر.
5. إعداد الثانوية حل الضد مباشرة قبل الاستعمال. إضافة الضد fluorophore مترافق في تركيز الشركة المصنعة أوصت مع دابي ملون مباين النووية وغيرها من علامات عضية مثل phalloidin إلى محلول 5 ٪ حظر. إذا كان المطلوب التخزين ، والحفاظ على الحل في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى استخدام.
6. تحضير الجلسرين 50 ٪ / حل PBS (V / V) لتخزين الخلايا immunostained. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Vectashield.

5. تثبيت للخلايا وImmunostaining

1. ويهدف البروتوكول التالية لتثبيت وتلون NZCs في 24 لوحة جيدا. نظرا لأحجام وبئر واحدة. وينبغي الكواشف pipetted بلطف خلال جميع الخطوات لتجنب مفرزة من الخلايا ، وغير مستحسن لوحة التحريض في الخطوات الحضانة.
2. إزالة بلطف المتوسطة مع micropipette 1 مل وإضافة 0.5 مل من 4 ٪ إلى PFA الخلايا المستزرعة المرفقة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون عائق.
3. إزالة 4 ٪ PFA وإضافة 0.5 مل من محلول لكل بئر permeabilization. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. إزالة حل permeabilization والشطف بلطف مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف.
5. إضافة 0.5 مل من عرقلة الحل ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
6. الحل إزالة الحجب وإضافة 0.225 مل حل الضد الابتدائي.
7. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
8. إزالة الأجسام المضادة والحل الأساسي ري بلطفNSE مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف.
9. إضافة 0.225 مل حل الضد الثانوية. احتضان لوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
10. إزالة الأجسام المضادة الثانوية حل والشطف بلطف مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف.
11. إضافة 0.3 مل من 50 ٪ الجلسرين / PBS الحل (V / V) أو Vectashield بما يكفي لتغطية الجزء السفلي من السطح جيدا.
12. خلايا ملفوفة مع صورة المجهر epifluorescence أو تخزينها في احباط في 4 درجات مئوية.

6. ممثل النتائج

الشكل 1. وتنقيته من NZCs E17.5 الأجنة ، مطلي في الخلايا لكل 200000 سم ² والمحتضنة في 37 درجة مئوية ليصبح المجموع 24 ساعة. وعلى النقيض من تصوير الخلايا المرحلة مع الاتحاد الدولي للرجبي لايكا المجهر المقلوب DM قبل تلوين مناعي. (أ) على النقيض من المرحلة 20X عرض NZCs بعد 24 ساعة في الثقافة. (ب) كانت ثابتة والملون باستخدام خلايا الأرنب مكافحة PAX2 الأجسام المضادة لخلايا محددة السلف نفرون (الحمراء) ، وثانوية اليكسا فلور 568 مترافق حمار المضادة أرنب. لاحظ نوى الزرقاء counterstained مع دابي. (C) على النقيض من المرحلة 40X عرض مجموعة من الأسلاف نفرون (متوسط) بعد 24 ساعة في الثقافة. (D) وأعرب عن صورة 40X من NZCs المعزولة من أجنة LacZ + من سلالة ^LacZ Foxd1 ، الذي يعبر عن β - غالاكتوزيداز تحت سيطرة المروج Foxd1. Foxd1 السكان في انسجة الخلايا داخل المنطقة كلوي في الكلى النامية. تم صبغ الخلايا التي تحتوي على علامة phalloidin F - الأكتين (أوريغون الخضراء الابتدائية المتقارن) ، وصمة عار دابي النووية (الأزرق) والمضادة للأرنب β - غالاكتوزيداز (الثانوي -- اليكسا فلور حمار المضادة للأرنب 568) للكشف عن خلايا انسجة Foxd1 + ( الحمراء).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول وصفنا أسلوبا لعزل الخلايا والثقافة من منطقة كلوي في الكلى الجنينية. هو تطوير وسيلة نشر في البداية كجزء من دراسة لآثار العلاج على خلايا BMP7 المنطقة كلوي (فارغ وآخرون ، 2009). في الدراسة الأولية ، وأجريت سلسلة من التجارب لتحديد خصائص أنواع الخلايا مم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Watchmaker’s forceps #5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A	Roche Group	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin	Sigma-Aldrich	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM	Sigma-Aldrich	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml	Sigma-Aldrich	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin	BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca	Lonza Inc.	17-512F
5mL polystyrene tubes	BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer	BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Supplied as powder
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal	MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin	Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Use "DNase on column" protocol
Transfer pipettes, 3ml	BD Biosciences	357575