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Method Article
Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour l'isolement et la culture de la niche de cellules progénitrices du rein d'embryon de souris qui peuvent être utilisées pour étudier les voies de signalisation réglementant cellules souches / progénitrices du rein en développement. Ces cellules cultivées sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui permet une manipulation efficace des voies candidat.
Le développement embryonnaire du rein a été largement étudié à la fois comme un modèle pour l'interaction épithélio-mésenchymateuse dans l'organogénèse et d'acquérir la compréhension des origines de la maladie rénale congénitale. Plus récemment, la possibilité de piloter naïve cellules souches embryonnaires vers des destins néphrogénique a été explorée dans le domaine émergent de la médecine régénérative. Des études génétiques chez la souris ont identifié plusieurs voies nécessaires pour le développement du rein, et un catalogue global de la transcription du gène dans l'organe a été récemment générées http://www.gudmap.org/ , offrant de nombreux régulateurs candidat des fonctions essentielles de développement. L'organogenèse du rein chez les rongeurs peuvent être étudiés en culture d'organe, et de nombreux rapports ont utilisé cette approche pour analyser les résultats des deux protéines appliquant candidat ou faire tomber l'expression de gènes candidats en utilisant siRNA ou morpholinos. Cependant, l'applicabilité de la culture d'organes pour l'étude de la signalisation qui régule la tige / différenciation de cellules progénitrices de renouvellement par rapport au niveau du rein en développement est limité en tant qu'organes de culture contenant une diffusion matrice compacte limitant extracellulaire des macromolécules et des particules virales. Pour étudier la signalisation cellulaire des événements qui influencent la tige / niche de cellules progénitrices dans les reins, nous avons développé un système de cellules primaires qui établit la zone néphrogénique ou une niche de cellules progénitrices de l'ex vivo du rein en développement dans l'isolement de l'inducteur de la différenciation épithéliale. En utilisant la digestion enzymatique limitée, les cellules de zone néphrogénique peut être sélectivement libérée de développer reins à E17.5. Après filtration, ces cellules peuvent être cultivées comme une monocouche irrégulière en utilisant des conditions optimisées. L'analyse du gène marqueur démontre que ces cultures contiennent une distribution des types cellulaires caractéristiques de la zone néphrogénique in vivo, et qu'ils maintiennent l'expression du gène marqueur approprié pendant la période de culture. Ces cellules sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui facilite grandement l'étude de la candidate souches / progéniteurs effets régulateur de la cellule. Paramètres biologiques de base cellulaires comme la prolifération et mort cellulaire ainsi que des changements dans l'expression des marqueurs moléculaires caractéristiques de néphrons cellules souches / progénitrices in vivo peuvent être utilisés avec succès comme les résultats expérimentaux. Les travaux en cours dans notre laboratoire en utilisant cette technique de cellules primaires roman vise à découvrir les mécanismes de base régissant la réglementation de l'auto-renouvellement versus différenciation dans les néphrons cellules souches / progénitrices.
1. La préparation de réactifs pour la digestion rein
2. Reins dissection & Capsules Suppression (effectué à température ambiante)
3. Digestion enzymatique des reins (toutes les étapes à température ambiante sauf indication contraire)
4. La préparation de réactifs pour la fixation des cellules et Immunocoloration
5. Fixation des cellules et Immunocoloration
6. Les résultats représentatifs
Figure 1. NZCS ont été purifiés à partir de E17.5 embryons, plaquées à 200 000 cellules par cm 2 et incubées à 37 ° C pour un total de 24 heures. Les cellules ont été imagés par contraste de phase avec un microscope Leica DM IRB inversé avant coloration par immunofluorescence. (A) 20X vue contraste de phase de NZCS après 24 heures dans la culture. (B) Les cellules ont été fixées et colorées avec un anticorps de lapin anti-PAX2 anticorps spécifique pour les cellules progénitrices néphron (rouge) et un secondaire Alexa Fluor 568 ânes conjugué anti-lapin. Remarque noyaux bleus de contraste avec le DAPI. (C) vue 40x à contraste de phase d'un cluster de progéniteurs néphron (centrée) après 24 heures de culture. (D) l'image de la 40X NZCS isolée de LacZ + embryons de la souche Foxd1 LacZ, qui exprime β-galactosidase sous le contrôle du promoteur Foxd1. Foxd1 est exprimé dans la population de cellules stromales dans la zone néphrogénique du rein en développement. Les cellules ont été colorés avec la phalloïdine F-actine marqueur (Oregon Green primaires conjugués), le nucléaire au DAPI tache (bleu) et de lapin anti-β-galactosidase (secondaire - Alexa Fluor âne anti-lapin 568) pour la détection de cellules stromales Foxd1 + ( rouge).
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Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour isoler et cultiver les cellules de la zone néphrogénique du rein embryonnaire. Il est le développement d'une méthode initialement publié dans le cadre d'une étude sur les effets des traitements sur les cellules BMP7 de la zone néphrogénique (Blank et al., 2009). Dans l'étude initiale, une série d'expériences visant à caractériser les types de cellules représentées au sein de la population NZC ont été menées. Brièvement, la p...
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Ce travail a été soutenu par R01 DK078161 du NIDDK (LO), bourses de recherche postdoctorale de l'American Heart Association (AB), les Fondations Wenner-Gren de la Suède et Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Suède (UB). Un soutien additionnel a été fourni par le Maine Medical Center Research installations essentielles Institut pour l'histopathologie, la bioinformatique et FACS (soutenu par 2P20RR18789-06) et l'animalerie MMCRI.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
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